Dithranol כמו מטריקס לליזר Desorption / יינון ההדמיה מטריקס Assisted על Fourier Transform יון הציקלוטרון התהודה ספקטרומטר מסות

Dithranol (DT; 1,8-dihydroxy-9 ,10 dihydroanthracen--9-אחד) כבר דווח בעבר כמטריצה ​​MALDI הדמיה רקמה של מולקולות קטנות; פרוטוקולים לשימושם של DT להדמית MALDI של שומני אנדוגני על פני השטח של חלקי רקמות על ידי חיובי יון MALDI-MS במכשיר quadrupole-FTICR רזולוציה ultrahigh מסופקים כאן.

הדמיה ספקטרומטריית מסה (MSI) קובע את דפוסי לוקליזציה ופריסה המרחבית של תרכובות על פני השטח של קטע רקמה, בעיקר באמצעות MALDI (desorption / יינון מטריצת סיוע לייזר) מבוססת טכניקות אנליטיות. מטריצות חדשות למולקולה קטנה MSI, אשר יכול לשפר את הניתוח במשקל מולקולרי נמוך תרכובות (MW), יש צורך. מטריצות אלה אמורות לספק אותות אנליטי מוגבר תוך הפחתת אותות רקע MALDI. בנוסף, השימוש במכשירים ברזולוציה ultrahigh, כגון התמרת התהודה הציקלוטרון יון (FTICR) ספקטרומטר מסות, יש לו את היכולת לפתור את אותות אנליטי מאותות מטריקס, וזה באופן חלקי יכול להתגבר על בעיות רבות הקשורות לרקע שמקורם MALDI מטריצה. ההפחתה בעוצמות של אשכולות מטריצת metastable ידי FTICR טרשת נפוצה יכולה גם לעזור להתגבר על חלק מההפרעות הקשורות לפסגות מטריצה ​​על מכשירים אחרים. ברזולוציה גבוההמכשירים כגון ספקטרומטר מסות FTICR הם יתרון כפי שהם יכולים לייצר דפוסי הפצה של תרכובות רבות בו זמנית תוך מתן אמון בהזדהויות כימיות. Dithranol (DT; 1,8-dihydroxy-9 ,10 dihydroanthracen--9-אחד) כבר דווח בעבר כמטריצה ​​MALDI הדמיה רקמות. בעבודה זו, פרוטוקול לשימוש בDT הדמיה MALDI של שומני אנדוגני מהמשטחים של חלקי רקמות של יונקים, על ידי חיובי יון MALDI-MS, בquadrupole היברידי הרזולוציה ultrahigh מכשיר FTICR כבר סיפק.

הדמיה ספקטרומטריית מסה (MSI) היא שיטה אנליטית לקביעת דפוסי לוקליזציה ופריסה המרחבית של תרכובות על פני השטח של קטע רקמת ^1,2. desorption / יינון לייזר מטריקס סייע (MALDI) MSI לניתוח של פפטידים וחלבונים היה בשימוש כבר למעלה מעשור וחל שיפור רב בשיטות להכנת מדגם, רגישות זיהוי, ברזולוציה מרחבית, שחזור ועיבוד נתונים ^3,4. על ידי שילוב מידע מסעיפים מוכתמים בהיסטולוגיה וניסויים MSI, פתולוגים יכולים לתאם את החלוקה של תרכובות ספציפיות עם תכונות מעניינות pathophysiologically ^5.

דפוסי ההפצה של מולקולות קטנות, כוללים תרופות אקסוגניים ^6,7 ומטבוליטים שלהם ^8-10 גם נחקרו על ידי ההדמיה של רקמות MALDI-MS ^11. שומנים הם אולי CLA הנפוץ ביותר למדss של תרכובות עם ההדמיה MALDI, הן ^ב18 מצבי MS ^12-17 ו-MS / MS. השימוש בMALDI MSI הדמיה מולקולה קטנה היה מוגבל על ידי מספר גורמים: 1) מטריצות MALDI הם עצמם מולקולות קטנות (בדרך כלל מ '/ z <500), אשר יוצרות אותות יון בשפע. אותות בשפע אלה יכולים לדכא היינון של analytes מולקולה קטנה ולהפריע ^ל19,20 זיהוי שלהם. ציפוי ממס ללא מטריצה ^​​21, סובלימציה מטריצת ^22, ומטריצת precoated MALDI MS ^23, בין השאר, פותחו על מנת לשפר את MSI של מולקולות קטנות.

מטריצות חדשות שיכול לשפר את הניתוח של תרכובות הנמוך MW הן עניין רב במולקולה הקטנה MSI. מטריצות אלה אמורות לספק אותות אנליטי מוגבר עם אותות מטריקס ירד. במצב החיובי יון, 2,5-dihydroxybenzoic חומצה (DHB) וα-Cyano-4-hydroxycinnamic חומצה (CHCA) הם שתי מטריצות MALDI MS נפוצות ^ל24 MSI . המטריצה ​​האידיאלית תהיה ליצור גבישים קטנים, כדי לשמר את הלוקליזציה המרחבית של analytes. DHB נוטה ליצור גבישים גדולים יותר, ולכן החלת המטריצה ​​באמצעות סובלימציה פותחה באופן חלקי להתגבר על בעיה זו, ואפשרה את השימוש במטריצה ​​זו להדמיה רגישה של פוספוליפידים ^22,25. 9-Aminoacridine שמש במשך MSI של analytes protic במצב ²⁶ חיובי יון ולנוקלאוטידים ופוספוליפידים ^ב26-29 המצב השלילי יון. 2-Mercaptobenzothiazole כבר מצא לתת גילוי MALDI יעיל של שומנים ^30, ומאז משמש עבור ההדמיה של מוח עכבר gangliosides ^{ביום 31.} הרזולוציה ultrahigh של התמרת התהודה הציקלוטרון יון (FTICR) ספקטרומטר מסות מעט יכול להקל על בעיה זו על ידי פתרון אותות אנליטי מאותות מטריצת ^32. יתרון נוסף של השימוש בFTICR-MS הוא שהעוצמות של אשכולות מטריצת metastable הן reduc³³ אד, אשר גם מפחית הפרעות אלה ^27.

השימוש בdithranol (DT; 1,8-dihydroxy-9 ,10 dihydroanthracen--9-אחד) כמטריצה ​​MALDI הדמיה רקמות כבר דווחה בעבר ^34. בעבודה הנוכחית, פרוטוקול מפורט מסופק לשימושם של DT לMSI של שומני אנדוגני על פני השטח של חלקי רקמות עדשת שור, במצב החיובי יון.

1. חתך רקמה

1. פלאש להקפיא את דגימות הנושא, שנקטפו ברגע, תוך שימוש בחנקן נוזלי, לשלוח אותם בקרח יבש (אם נדרש משלוח), ולאחסן אותם ב-80 ° C עד חתך רקמות. (אם דוגמאות מסחריות נמצאות בשימוש, להבטיח כי הדגימות שהוכנו באופן זה.)
2. לחתוך איברים לגודל לניהול כדי שיתאים ליעד MALDI. לקצץ את כל חלקים לא רצויים של האיבר. במחקר זה שתואר כאן, עדשות עגל שור היו decapsulated באמצעות הליך בעבר תאר ³⁵ לפני חתך רקמות.
3. הסר את כל האיברים מ-80 ° C במקפיא ולתקן אותם על במה חיתוך רקמות קירור. כדי לתקן עדשת עגל שור, הנח טיפות מים אחד או שתיים על הבמה חיתוך הרקמות של cryostat. במהירות למקום העדשה במים לפני שהוא מתמצק. לחלופין, הוא יכול לשמש גם תרכובות טמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר) כדי לתקן רקמה על הבמה החיתוך. אם תרכובות אוקטובר משמשות, מיניסכום mal של אוקטובר צריך להיות מיושם ויש להקפיד על מנת להבטיח כי חלקי רקמות קיצוץ לא יהיו מזוהמים בתרכובות אוקטובר אשר יכול להפריע ליינון וזיהוי של analytes ^5,36,37.
4. לאפשר את הטמפרטורה בתוך cryostat לאזן ל-18 ° C. טמפרטורות קרות או חמים יותר יכולות לשמש לרקמות רכות יותר או קשים יותר, בהתאמה. ואז לחתוך את הרקמה equatorially ל20 מיקרומטר פרוסות עבות. השתמש 10-15 פרוסות עבות מיקרומטר עבור רוב הרקמות, עם זאת, בשל האופי השברירי של רקמת עדשת שור, 20 מיקרומטר פרוסות עבות היו בשימוש. לרקמת עדשת שור, לבטל את סעיפי הרקמות הראשונים ולהשתמש רק בפרוסות שהם קרובים או במטוס המשווני.
5. אם רקמת עדשת העין היא הדמיה, השתמש 1.5 μl של חומצה פורמית (98% בטהרה, הכיתה LC-MS) לprewet פני השטח של תחמוצת אינדיום בדיל (איטו) מצופה שקופיות זכוכית.
6. להעביר בזהירות את חלקי רקמות אל פני השטח של איטו השותףשקופיות זכוכית מיקרוסקופיות ated בתוך cryostat. קטע הרקמה יהיה להפשיר במהירות וביהפוך בחוזקה מודבקת אל פני השטח של השקופית. בדרך כלל, יכולים להיות מותקנים סעיפי רקמות מרובים על אותו שקף מצופה איטו בדרך זו.
7. Lyophilize השקופית ל15 דקות לפני יישום מטריצת MALDI.
8. לבדיקת מטריקס, לפזר את המטריצות בודדות בממסים מתאימים. באופן ידני במקום 1 μl של כל פתרון מטריצה ​​על קטע הרקמה. בנוסף, במקום סטנדרטי כיול מולקולה קטנה על הרקמות לצורך האימות של רגישות MALDI.
9. מוסיף שלושה סימני הוראה לשקופית זכוכית איטו המצופה על ידי כתיבה על פני השטח nonconductive של שקופיות זכוכית איטו מצופים עם עט תיקון נוזל. קח את התמונה אופטית של שקופית הרקמות באמצעות סורק ולשמור אותו בפורמט מתאים, כגון TIFF או jpg.

2. מטריקס ציפוי

2.1. אוטומטי מטריקס ציפוי

1. Apפתרונות מטריקס רובדי, המכילים אצטוניטריל או אצטוניטריל / מים מעורבים כממסים, באופן אוטומטי למשטחים של חלקי רקמות באמצעות ImagePrep ברוקר או מרסס מטריצה ​​אלקטרונית דומה.
2. כסה את הקצוות של המשטח הקדמי של שקופית הזכוכית המצופה-איטו עם קלטת כך שהמטריצה ​​לא מעיל הקצוות של השקופיות. הדבר מבטיח כי סימני ההוראה על פני השטח ההפוך יכולים לשמש ליישור שקופיות רקמות. אל תכסה את הקצוות של השקופיות עם מטריצה ​​כפי שהם משמשים כנקודות מגע כדי לשמור על מוליכות החשמלית של השקופית מצופה איטו.
3. מעיל שקופיות הזכוכית באמצעות עשרים מחזורים של ציפוי מטריקס (תרסיס 2-sec, דגירה 30-sec, ו60-sec זמן ייבוש לכל מחזור).

2.2. ציפוי מטריקס ידני

1. אם ממסים אורגניים (למשל כלורופורם ואתיל אצטט) שאינם מתיישבים עם חומרי הייצור של מרסס המטריצה ​​האלקטרוני הם requiאדום, להשתמש במרסס airbrush pneumatically בסיוע ליישם את המטריצה. מוסיף את פתרון המטריצה ​​מוכן למאגר הממס של אקדח airbrush ולהחיל זרימה עדינה של גז חנקן בלחץ לראש התרסיס.
2. כסה את הקצוות של המשטח הקדמי של שקופיות זכוכית מצופים איטו עם קלטת כך שהמטריצה ​​לא מעיל הקצוות של השקופיות. הדבר מבטיח כי סימני ההוראה על פני השטח ההפוך יכולים לשמש ליישור שקופיות רקמות. אל תכסה את הקצוות של השקופיות עם מטריצה ​​כפי שהם משמשים כנקודות מגע כדי לשמור על מוליכות החשמלית של השקופית מצופה איטו.
3. לאחר תרסיסים יציבים וקנס כבר ציינו, לרסס באופן ידני את המטריצה ​​כך שמעיילי קטע הרקמה לחלוטין. להחיל את הסכום המינימאלי של פתרון המטריצה ​​נדרש בקושי להרטיב את פני השטח במהלך כל מחזור כדי למנוע delocalization אנליטי האפשרי. באופן כללי, השתמש כ 10 מחזורים של ספריי מטריצה ​​למעייל קטע רקמה; מספר המחזורים הואתלוי בסוג הרקמה ובהרכב מטריצה.

3. MALDI MS

1. הכן פתרון כיול המוני על ידי דילול הפתרון "ES כוונון המיקס" הסטנדרטי בפקטור של 1:200 ב60:40 isopropanol: מים (המכיל חומצה פורמית 0.1% בתערובת הסופית).
2. מציג 2 μl / min של הפתרון המדולל "ES כוונון המיקס" ליינון electrospray מצב הכפול / מקור MALDI יון בספקטרומטר מסת FTICR, מהצד ESI (ESI).
3. הפעלת מכשיר FTICR במצב ESI החיובי יון, עם זיהוי פס רחב וגודל רכישת נתונים של 1,024 קילו / sec. פרמטרים ESI אופייניים הם מתח electrospray נימים, 3,900 V; לרסס מתח מגן, 3,600 V; גז nebulizer (N ₂₎ זרימה, 2 ליטר / דקה; גז יבש (N ₂₎ לזרום וטמפרטורה, 4 ליטר / דקה ו200 מעלות צלזיוס; רחפן מתח 1, 15 V; זמן של הטיסה (TOF), 0.009 שניות; זרימת גז התנגשות (Ar), / s 0.4 L; זמן הצטברות יון מקור, שניות 0.1;וזמן הצטברות יון תא התנגשות, 0.2 שניות. כוון את הפרמטרים פעולת FTICR על מנת למקסם את הרגישות אנליטית על פני הטווח ההמוני ממ '/ z 200 עד 1,400, תוך שמירה על ריקבון חופשי אינדוקציה טובה תחום בזמן אותות (FID). בדרך כלל, הפרמטרים פעולת ICR הם מתח העוזר, 8 V; העוזר מתח היסט, 8 V; הגברה עירור של 10; זמן דופק עירור, .01-.015 שניות; מתח צלחת מלכודת קדמי, 1.5 V; מתח צלחת מלכודת בחזרה, 1.6 V ו מתח כניסת מנתח, -4 V. לאחר סט של פרמטרים פעולת FTICR כבר נקבע, לרכוש הספקטרום ההמוני ESI ולכייל את המכשיר באמצעות המוני התייחסות של התרכובות סטנדרטיות בפתרון "ES כוונון המיקס".
4. כדי לכוון את המכשיר לפעולת MALDI, לפזר כמה aliquots μl 1 של terfenadine מעורב ופתרון סטנדרטי reserpine בפתרון המטריצה ​​בריכוז של 1 מיקרומטר כל אחד, ולזהות את הפתרונות הללו ישירות על גבי אחת מTissuסעיפי דואר (כלומר, קטע רקמת מבחן) אשר כבר רכוב על שקופיות מצופות איטו. מניחים את השקף המצופה איטו למתאם שקופיות רקמות (כלומר יעד MALDI מיוחד) ולטעון את המתאם מהצד MALDI למקור יון ESI / MALDI הכפול. לייעל את הפרמטרים התפעוליים MALDI המתאימים לכוח הלייזר ומספר יריות לייזר להצטברות MALDI אות עבור כל סריקה המונית, ועוד פרמטרים פעולת MALDI אופייניים הם: יריות לייזר, 50; ומתח צלחת MALDI של 300 V.
5. לאחר כוונון, כיול, ואופטימיזציה של המכשיר לניסויי MALDI-MSI, ליישר את המיקום הפיזי של קטע רקמה להיות צילם עם תמונה האופטית נרשמה בתוך תוכנת ההדמיה. השתמש בשלושת הסימנים "תיקון נוזל", שהוצבו בעבר בצד השני של משטח השקופיות מצופה איטו (שלב 1.9), למערך הזה בשיטת טריאנגולציה של שלוש נקודות.
6. בצע ESI בו זמנית וMALפעולת DI, כך שכל ספקטרום המוני מכיל את הפסגות המוני התייחסות של הפתרון "ES כוונון המיקס" לכיול מסה הפנימית שלאחר רכישה. זה יגרום במדידת המסה מדויקת ביותר במהלך MALDI טרשת נפוצה. לשם כך, להחליש ראשון אות ESI על ידי הפחתת מתח הנימים עד אותות MALDI להשתלט על הספקטרום ואילו אותות calibrant ESI עדיין גבוהים מספיק לצורך כיול מסה הפנימי.
7. בשלב הבא, להגדיר את שיטת rastering אוטומטית להקרנת לייזר. הגדר את אזורי הרקמה להיות צילם ולהגדיר את גודל צעד סריקה הלייזר המתאים. שים לב שגודל צעד סריקה קטנה יותר לספק תמונות רקמת רזולוציה גבוהות יותר, אך דורש באופן משמעותי יותר מסת רפאים זמן רכישה ועוד שטח אחסון נתונים. מספר פיקסלים בתמונה תלוי בגודל סריקה לייזר צעד להתקנה ולגודל הרקמה. עבור עדשה טיפוסית שור שבו יש גודל רקמה 1 סנטימטר ^2, תמונת רקמה מורכבת בדרך כלל של CA. פיקסלים 5,000 אם גודל צעד סריקה לייזר של 200 מיקרומטר משמש במכשיר FTICR. השתמש בניתוח "אקראי מקום", כפי שזה מונע הטיה מבוססת מיקום בשל הנחתה אות הדרגתית במהלך הניסוי.

4. ניתוח נתונים

1. כייל את הספקטרום ההמוני MALDI באמצעות כיול פנימי להשוואה הראשונית ולבחור פסגות עבור MS / MS. De-איזוטופ ובחר את פסגות monoisotopic כפי שתואר לעיל, תוך שימוש בסקריפט של VBA מותאם אישית ^38.
2. יצוא וכתוצאה מרשימות שיא monoisotopic וקלט הערכים מ '/ z נמדדו ^ל39 METLIN ו / או מאגרי מידע metabolome HMDB ⁴⁰ להתאמה המונית עם ערכי הספרייה. קחו למשל את (M + H) ^+, (M + Na) ^+, ו( M + K) ⁺ יונים במהלך החיפושים במאגר הנתונים, עם שגיאה המונית המותרת של ± 1 עמודים לדקה.
3. ליצור תמונות MALDI לכל אחד מהגופים השומנים זוהו על פני קטע הרקמה כולה באמצעות מתאר לעצמידואר ניתוח תוכנה, עם רוחב מסנן מסה של 1 עמודים לדקה בשיא השיא.
4. ברגע שתמונות כבר נוצרו עבור כל הערכים מ '/ z התואמים את ערכי מסד נתונים, להפיק תמונות לכל פסגות אחרות, כמו גם לחפש דפוסי הפצה ייחודיים שיכול להיחקר מאוחר יותר.

5. אישור על זהותם של השומנים צילמו

1. לאשר את זהותם של שומנים בשפע הגבוה, אשר יש יוני שבר אופייניים שניתן לאתרם באמצעות מכשיר FTICR (למשל 184.073 לפוספוליפידים), על ידי MALDI-MS/MS. בצע MALDI-MS/MS באמצעות ניתוק הנגרם התנגשות (CID) ישירות על הרקמה.
2. לאלו מינים שומנים שלא ניתן לאשר באופן ישיר על ידי MALDI-MS/MS, להשתמש במערכת UPLC מצמידים את ספקטרומטר מסה ש-TOF ^34.
   1. ידני לנתח aliquots מכילים ~ 10 מ"ג של רקמה מהאזור שבו המינים של ריבית מקומי. הנח aliquots הרקמות הללו ל2צינורות צנטריפוגה מיליליטר.
   2. Homogenize aliquot כל רקמה ב250 μl מים, תוך שימוש בטחנת מיקסר עם שני כדורי מתכת נירוסטה 5 מ"מ.
   3. הוסף 1 מיליליטר של תמיסת כלורופורם מתנול (1:3, V / V), ומערבולת הצינורות. בשלב הבא, צנטריפוגה הצינורות באמצעות microcentrifuge ב12,000 XG במשך 10 דקות.
   4. לאסוף supernatants ולייבש אותם ברכז מהיר ואקום רוטרי.
   5. ממיסים את השאריות בשל 30:70 isopropanol 100 μl: מים. הזרק aliquot 10-μl על טור UPLC להפרדה באמצעות elution שיפוע.
   6. השתמש בתנאי chromatographic לLC-MS/MS שומנים בדם באופן מקוון, שכבר פורסם בעבר ^34.
   7. הנוכחי ליצור חילוץ יון (XIC) chromatograms באמצעות הערכים מ '/ z התיאורטי, עם חלון של ± 50 עמודים לדקה ברחבי ההמונים התיאורטי.
   8. אם תרכובות אותנטיות לשומנים אלה הן זמינות, להתאים את זמני שמירה של התרכובות אותנטיות עם אלה של Corresponding פסגות XIC מדגימות הרקמה. אם התרכובות זהות, הפעמים השמירה וספקטרום MS / MS צריכים להתאים.
3. אם מתחם אותנטי אינו זמין, השתמש בתבנית הפיצול של השומנים בדם שזוהה כדי להתאים ספקטרום MS / MS סטנדרטי ממסד נתוני metabolome כגון METLIN או HMDB. השתמש דה נובו פרשנות ספקטרלי המונית כדי לקבוע מבנה אפשרי לשומנים בדם.

דגימות רקמה שהם מחולק והפשרה רכובים על גבי שקופיות זכוכית איטו מצופים צריכה להיות שלמות, ללא קרע גלוי. לרקמות רבות, הפשרת רקמות ישירה לתלייה על גבי שקופיות זכוכית איטו מצופים מקובלת. עבור חלק מרקמות ספציפיות, כגון עדשת שור, קריעה נרחבת של הרקמה נתפסה לעתים קרובות כאשר הפשרה ישירה הרכבה משמשת (איור 1 א). Precoating של שקופיות זכוכית איטו עם אתנול או חומצה פורמית (איור 1b) מסייע לשמור על השלמות של חלקי רקמות ברקמות גוברים.

גם הבחירה של מטריצה ​​ואת הבחירה של ממס הן גורמים חשובים המשפיעים על האיכות של ספקטרום MALDI. כאשר ספקטרום MALDI MS מתאים הוא רכש מהקטע הרקמה, הספקטרום ההמוני הוא בדרך כלל צפוף עם אותות שומנים בדם בטווח זיהוי ההמוני (איור 2 א). יש לבחור במטריצה ​​וממס, כך שיש להם קוטביותהווו גודל: 14.399999618530273px; גובה קו:. 28px; "> דומה לanalytes של עניין, משום שתהליך MALDI דורש פתרון מוצק שלב של אנליטי בגבישי המטריצה ​​בדרך כלל עוצמות אות אנליטי הטובות ביותר מגיעות מהשימוש של מטריצות MALDI עם solubilities דומים לזה של analytes הרצוי ^41,42. איור 2a מראה דוגמא של ספקטרום מיוצר עם ממס יעיל מטריצה ​​(70% ACN עם 0.01% TFA), ואיור 2b מראה בחירה גרועה של מטריצה ​​ו (MeOH 70% עם 0.01% TFA) ממס עבור dithranol.

אחד היתרונות של יינון electrospray מצב כפול (ESI) / יון מקור MALDI הוא שהיא מאפשרת תוספת של אותות calibrant ESI ובמקביל רכישת ספקטרום MALDI בלי להתערב בתהליך אבלציה. אותות calibrant אלה ESI מאפשרים כיול מסה פנימי כדי לספק דיוק מסה גבוה עם שגיאה המונית של <0.5 עמודים לדקה ^38. כמואות ESI של הפתרון "ES כוונון המיקס" הרגיל יכולה להיות בסדר גודל חזק יותר מאותות MALDI של analytes מן הרקמה, אותות calibrant נגזרו 'חדשות ארכיאולוגיות חייבים להיות מוחלשים. אותות Calibrant צריכים להיות גלויים ושל עוצמה מספקת עבור כיול של הספקטרום, אבל לא צריך לשלוט בספקטרום.

ברגע שהקבוצה של ספקטרום המוני מניסוי MALDI-MSI כבר נרכשה, יכולה להיות שנוצרה התמונה עבור כל אחד מהיונים מזוהים, עם כל פיקסל מייצג את נקודת הקרנת לייזר מפני שטח של קטע רקמה. שילוב של כל פיקסלים הבודדים עם עוצמות יון שונות ברחבי קטע הרקמה מניסוי MALDI MSI משקף את היינון של analytes היעד בתוך הרקמה ^1. זה יכול, בתורו, לספק מידע על הריכוזים יחסי של analytes בחלקים שונים של קטע הרקמה (3 ב איור). יש להקפיד בעיבוד שלנתונים מאז גורמים רבים יכולים להשפיע על מה שהוא ראה ואיך הנתונים מתפרשים. ברוב הניסויים, הנתונים מנורמלים השוטפת יון (TIC) בתוך כל ספקטרום. בלי נורמליזציה זו, אזורים עם עמיתים להתגבשות טובה יותר אנליטי מטריצה ​​(כלומר, מה שנקרא "נקודות חמות") יכולים לגרום לאותות חזקים יותר לanalytes וזה הייתי להטות את הנתונים על ידי מתן מידע שלא יכול לתאם גם עם הריכוזים יחסי בפועל של analytes (איורים 3C-3D).

הכנת רקמה גם יכולה לשנות באופן דרמטי את התמונה שנוצר. אם המדגם הוא "רטוב מדי" (כלומר יותר מדי ממס יושם), ואז יהיה analytes delocalize על הרקמה ועוד הרבה של מידע מרחבי ייאבדו (3F איור). השיטה של ​​רכישת נתונים חשובה גם בתמונה הסופית שהתקבלה. כניסויי MALDI בסעיפי רקמות שלא טופלו מטבעם "מלוכלכים & #34;, הרגישות של המכשיר עשויה להפחית לאורך זמן. ניסויים קצרים ירידה זו לא יכולה להיות ברורה, עם זאת, זה יכול להיות בעיה עבור ניסויים ארוכים יותר או דגימות מלוכלכות במיוחד. אם הנתונים שנרכשו באופן ליניארי על פני המדגם זה יכול להוביל להטית locational כאזורים ספציפיים של קטע הרקמה ינותחו לאחר הרגישות של מכשיר ירד. לכן, שימוש בנקודות אקראיות עבור כל רכישות נתונים מומלץ. אמנם שיטה זו לוקחת יותר זמן, זה עוזר להסיר או למזער את ההטיה בנתונים.

כפי שניתן לראות במאמר הקודם שלנו ^34, בהשוואה לCHCA וDHB, DT אפשר זיהוי של מיני שומנים נוספים, ואילו השומנים מזוהים עם עדיין יכולים להיות מזוהה CHCA וDBH.

>
איור 1. רקמת הרכבה וחיתוך. תמונות השוואתי אופטיות של שני חלקי שור עדשת עגל רקמות (20-מיקרומטר עבה), ללא prewetting חומצה פורמית (א), ועם prewetting חומצה פורמית (ב), רכוב על שקופיות זכוכית מצופים איטו.

איור 2. . ההמוני ספקטרה MALDI MS ספקטרום שנרכשה ישירות מקטע רקמה:) אידיאלי ספקטרום צפוף אוכלוסין המוניים עם אותות שומנים (70% ACN עם 0.01% TFA); ב) ספקטרום המוני שנוצר מקטע רקמה מצופה בבחירה גרועה של (MeOH 70% עם 0.01% TFA) ממס. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.

השיקולים החשובים ביותר להצלחת MALDI MSI הם: 1) הכנת רקמה; 2) בחירת מטריצה; 3) יישום מטריקס, ו 4) פרשנות וניתוח של נתונים. כאשר המדגם ומטריקס ערוכים כראוי, רכישת נתונים MS היא אוטומטית. ניתוח נתונים מסוג זה של ניסוי הוא די עתיר עבודה.

הכנת רקמה מתאימה היא קריטית לניסויי MALDI MSI מוצלחים. המקור של הרקמות והטיפול יכולים להיות השפעה גדולה על סופו. הדגימות חייבות להיות מייד פלאש קפוא בחנקן נוזלי ומאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס, והם לא צריכים להיות מאוחסנים במשך תקופה ארוכה של זמן, כפי שכמה מטבוליטים יכולים להיות יציבים גם ב -80 ° C.

עבור רבים רקמות יונקים, 10-15 פרוסות רקמה עבות מיקרומטר כבר מומלצת לMALDI MSI. בניסויים אלה, עדשות עגל שור נחתכו equatorially ל20 מיקרומטר של רקמה עבהLices הבא decapsulation עדשה באמצעות הליך בעבר תאר ^35. קטעי רקמה עבים יותר שור עדשת העגל שימשו משום שהתקשה לשמור על השלמות של קטע רקמת עדשה הן במהלך חיתוך רקמות וברקמות גוברים. העדשה היא רקמה כדורית סימטרית לאורך הקו המשווה שלה, כך שהפרוסות היחידים שהיו קרובים ל, או ב, המטוס המשווני נאספו.

בשל הקושי בשמירה על שלמות הרקמות במהלך חיתוך רקמות וההרכבה, prewetting באמצעות ממס כגון אתנול (לחלבונים ופפטידים ³⁵⁾ או חומצה פורמית (ליפידים) יכול לשמש. זה צריך להיות גם ציין כי, לחלבון וההדמיה פפטיד, הדגימות לעתים קרובות נשטפות עם ממס אורגני כדי להסיר מולקולות קטנות הכוללים שומנים ואוקטובר משמשים להרכבה, עם זאת, צריך להיעשות צעד כביסה רק עם ממסים שאינם מתמוססים analytes של עניין, ויש להימנע עבור SMAניתוח מולקולת ll.

הבחירה של מטריצה ​​היא קריטית גם עבור כל ניסויי MALDI, עם זאת, ביצועי מטריקס ברקמות לא יכולים להיות זהים לביצועי מטריצה ​​עם תקן מטוהר. לדוגמא, בכוח הלייזר מינימאלי, DT נוצר אותות רקע הקשורים ל-DT שפע מן כתמי מטריצה ​​ללא רקמות ואותות אלה חולקו כoligomers DT וadducts נתרן ואשלגן המקביל שלהם, עם זאת, ברקמה, רבים של אותות אלה היו לא נצפה, מצביע על כך שהבדיקות של מטריצות שונות על המדגם המסוים של בחירה עשויות להיות חשובות בבחירת המטריצה ​​המתאימה לניתוח MALDI MSI נתון. DT משמש לעתים רחוקות לניתוח שומנים בדם עקב הרקע הגבוה דיווח שנוצר על ידי מטריקס, עם זאת, בהשוואה לDHB וCHCA לפרופיל של שומנים על ידי MALDI-FTICR MS ברקמות, DT הניב תוצאות חיוביות. לכן מטריצה ​​זה יכולה להיות מטריצה ​​שעשוי להיות שימושית עבור הדמיה רקמות MALDI באמצעות מכשיר זה ^34.

שיתוף התגבשות יעילה של המטריצה ​​ואנליטי הוא תנאי הכרחי לרגישות גבוהה ניתוח MALDI-MS. לכן המסיסות מוצק השלב של אנליטי במטריצה ​​היא חשובה בתהליך ^41,42 MALDI. מטריצות MALDI עם solubilities הדומה לאלה של analytes הרצוי דווחו לייצר את עוצמות אות אנליטי החזקות ביותר. בגלל DT הוא חומצה חלשה אורגנית, כמו גם תרכובת אורגנית מאוד הידרופובי, המבוסס על התאוריה הקלסית נטרול חומצת בסיס Brønsted-ורי ⁴³ והתאוריה של מסיסות, הוא צפוי להעדיף את היינון של בעלי המטען חיובי ופחות קוטבי תרכובות. למעשה, מצאנו כי שומנים קוטביים שלטו בתרכובות שזוהו במצב החיובי יון כאשר DT שימש כמטריצה.

הממסים המשמשים להכנת פתרון מטריקס גם לשחק תפקיד חשוב בניתוח רקמות ישיר על ידי MALDI-MS. ה-pH היה מעורבת כגורם חשוב ביעילות של מטריקס, וTFA הוא תוסף נפוץ בשימוש עם CHCA וDHB. עם זאת, עם DT, התוספת של מתקן חומצה או בסיס הייתה השפעה רבה על נתונים שהתקבלו. בגלל הידרופוביות של DT והמסיסות המוגבלת שלה בממסים קוטביים, ממס אורגני lipophilic מומלץ. בעת ניתוח שומנים, תערובת של כלורופורם מתנול (2:1, v: v) עם 1% חומצה פורמית, שהוא ממס אורגני אופייני להפקת שומנים בדם, הייתה בשימוש. אנחנו הניחו שזה מספק שיתוף התגבשות טובה יותר של שומנים עם DT. טבע lipophilic של הממס עלול למנוע גם solubilization של תרכובות אחרות, כגון חלבונים ומלחים, כפי שמודגם בספקטרומטריית קודמת נוזלית משטח חילוץ המוני ניתוח ניסויים (LESA-MS) ^44. זה יוביל לגיבוש טוב יותר של המטריצה ​​ושומנים עם פחות מזהמים. מערכת הממס שנבחרה לניתוח צריכה למקסם את המסיסות של המטריצה ​​ודסיanalytes האדום (ליפידים) תוך מזעור המסיסות של מזהמים לא רצויים (מלחים וחלבונים / פפטידים).

הציפוי של המטריצה ​​על פני השטח של הרקמה צריך להיות אחיד ככל האפשר. כדי למקסם את הרזולוציה המרחבית של התמונה, גודל הגביש צריך להיות קטן ככל ⁴⁵ אפשריים. באמצעות מרסס מטריצה ​​אלקטרוני, המטריצה ​​יכולה להיות מצופה באופן אחיד וreproducibly עם גודל גביש קטן. זוהי השיטה המועדפת במעבדה שלנו. הוא עדיף בהרבה ליישום הוראות כפי שהוא מקטין את גודל כתם, הומוגניות, ואת שחזור. עם זאת, רבים מהממסים כי הם שימושיים עבור MSI של מולקולות קטנות, אינם תואמים עם החומרים המשמשים בייצור מרסס המטריצה ​​האוטומטית. אמנם עדיין לא מיושם במעבדה שלנו, יישום המטריצה ​​סובלימציה מבוססת כבר המליץ ​​לניתוח שומנים ^22. שיטה זו מספקת גודל משופר (מופחת כלומר) במקום, הומוגניות, ורפרודוקציהibility וזה כנראה צריך להיות השיטה של ​​בחירה כאשר המטריצה ​​שנבחרה היא חביבה לשיטה זו.

לציפוי של מטריצות המכילות ממסים עולים בקנה אחד עם המרסס אוטומטי המטריצה ​​(כולל כלורופורם), שיטה חלופית של ציפוי מטריצה ​​היא להשתמש באקדח מברשת אוויר. לפתרונות אלה מטריקס, השתמשנו מרסס airbrush סייע פניאומטית. למרות ששימוש באקדח מברשת האוויר הוא לא שיטה אידיאלית, זה עשוי להיות השיטה היחידה שיכול לשמש לממסים ומטריצות שאינם מתיישבים עם שיטות האחרות, ועם הכשרה וניסיון, זה יכול ליצור ציפוי מטריצה ​​אחיד מאוד. כאשר מיישמים את פתרון המטריצה ​​באופן ידני, רק את הסכום המינימאלי של נוזל חייב להיות מיושם בכל מחזור בקושי להרטיב את פני השטח של הרקמה. יותר מדי נוזלים עלול delocalize analytes בשל הממסים האורגניים. ישנם נושאי שחזור עם יישום וניסיון ידניים בציפוי השקופיות בשיטה זו אניזה חיוני להצלחה. בשל האופי הידני של יישום מטריצת אקדח מברשת האוויר, יש להקפיד על מנת להבטיח שציפוי אחיד מורכב; ציפוי הומוגניות יכול להוביל לנתונים מוטים, שהוא נציג של ציפוי מטריקס ולא לוקליזציה אנליטי.

בעת ביצוע ניסויי MSI MALDI, זיהוי ראשוני של analytes זוהה מבוסס בדרך כלל על בסיס הנתונים חיפוש metabolome של ההמונים מדויקים שנמדדו בו הם בדרך כלל זמינים רק כאשר מכשיר ברזולוציה גבוהה משמש ^38. מקור יון ESI / MALDI הכפול על ספקטרומטר מסת איפקס-QE 12 טסלה ההיברידית quadrupole-FTICR מאפשר התוספת של אותות שנוצרו 'חדשות ארכיאולוגיות לשימוש כפסגות calibrant המסה הפנימיות לכל ספקטרום המוני MALDI, מבלי להשפיע על desorption MALDI / תהליך יינון. השימוש בכיול מסה פנימי הוא קריטי לדיוק מדידת מסה גבוהה בMALDI-FTICR. כיול חיצוני לא יכול לקחת בחשבון באופן מלאהשפעות אחראי החלל בתוך התא ICR ^46-48. הכוונון והכיול של FTICR הוא קריטי להצלחה. בסוג זה של מכשיר פרמטר שנקרא "הזמן של טיסה" (TOF), המהווה את הזמן שלוקח ליון לנסוע מתא ההתנגשות למנתח (תא ICR) הוא אחד החשוב ביותר בהגדרת המשתמש הגדרות המשפיעות על רגישות זיהוי של מכשיר FTICR. בטווח מסת נתונה (כלומר מ '/ z 200-1,400), TOF נמוך מעדיף זיהוי של היונים מ' / z נמוכים יותר וגבוה יותר TOF מעדיף גילוי של יונים מ '/ z גבוהים יותר. לכן, לגילוי רגישות גבוהה של שני היונים '/ z נמוכים וגבוהים בטווח מסת זיהוי, ערך TOF של 9 אלפיות שני הוא רצוי.

לניסוי מעשי, תחלופה חייבת להתבצע בין גודל סביר רכישת נתונים, ברזולוציה המונית, ואת המשך הזמן על רכישת נתוני הדמיה בטרשת נפוצה. לניסוי FTICR טרשת נפוצה, בגודל של קובץ הנתונים שנרכש וresoluti ההמוניעל תלויים בגודל רכישת נתונים של ריקבון האינדוקציה בחינם אות (FID). גודל רכישת נתונים גבוה יותר יגרום לרזולוציה גבוהה יותר מסה וגודל קובץ נתונים גדול יותר. עם זאת, גודל רכישת נתונים גבוה גם גורם לשיעור MS איטי סריקה. כתחלופה, מומלץ שגודל רכישת נתונים של 1,024 kb / sec לשמש על FTICR. גודל רכישת נתונים נמוך יותר ורזולוציה נמוכה יותר מתאימה המונית אינו מאפשרים הפרדת מינים מסוימים יון isobaric.

חייב גם להיבחר גודל צעד סריקה הלייזר, כך שהוא קטן מספיק כדי לספק פיקסלים ברזולוציה טובה לתמונות MS של analytes של עניין, עם זאת, גודל צעד סריקה קטן מאוד יכול להפוך את נתוני קבצים בלתי ניתנים לשליטה שוקלים קובץ נתוני הדמיה MS מורכב מאלף ספקטרום המוני MALDI. בהתחשב בגודל הגדול יחסית של עדשות שור, CA. 1.2 -1.5 סנטימטר קוטר, השתמשנו גודל צעד סריקה של 250 מיקרומטר. שימוש acqu נתונים 1,024 kb / secגודל isition וגודל צעד 250 מיקרומטר סריקה, בסיס נתוני המדגם שלנו היו כ 60 Gb. במהלך רכישת נתונים, יש להשתמש בניתוח נקודה אקראי, כמו זה מונע הטיה מבוססת מיקום בשל הנחתה אות הדרגתית, אך נקודה אקראית דורשת זמן רב יותר באופן משמעותי לרכוש את הנתונים.

בגלל מערכי נתונים MALDI MSI שנרכשו על מכשיר FTICR MS כוללים נתונים מסה מדויקים, מ '/ z חולץ ניתן לחפש מול מסדי נתונים metabolome כגון METLIN ו / או HMDB. באמצעות חלון עמודים לדקה ± 1 המשימות הראשוניות של אותות יון רבים למטבוליטים הן של ודאות גבוהה. עם זאת, בגלל שיש לי מינים רבים באותה נוסחה כימית, אישור של הזהות חייב להיות לעתים קרובות נעשה שימוש באמצעים חלופיים. לפיכך, ניסויי MS / MS, והשוואה של MS / MS הספקטרום עם נתונים שפורסמו בעבר, יש לבצעו לזיהוי בטוח. ספקטרום MALDI-MS/MS לפעמים ניתן לרכוש ישירות על מכשיר FTICR, אבל עבור maמולקולות שומנים ניו יורק, שכיחותם ו / או יעילות יינון שלהם אינן מספיקות לקבלת נתונים MS / MS שימושיים, והעשרה וטיהור לפני LC-MS/MS נדרשות. בניתוחים אלו, רוב השומנים שנצפו היו פוספוליפידים קוטב, וחולקו כמחשבים אישיים, PES, SMS, PSS, PGS, עוזרות אישיות, ופוספטים ceramide (CerPs); מולקולות שומנים אחרות שזוהו כוללות שומני סטרולים, carnitines acyl, וGlycerides. בהתבסס על המאפיינים של הממס ומטריקס, זה היה צפוי. ספקטרום MS / MS של מחשבים אישיים מכיל שיא בולט במ '/ z 184.073, שיוחס לקבוצה הקוטבית ראש המחשב, phosphocholine, כמו גם מידע חשוב מבחינה מבנית נוסף, אשר יכול לתת זיהוי חד משמעי של המולקולות. בנוסף, שימוש בשיטה זו, שומנים בסטרולים רבים מזוהים, עם זאת, לא ניתן לקבוע באופן חד משמעי ביותר לזהויות ייחודיות, אפילו עם נתונים MS / MS. adducts אשלגן החזק בדרך כלל שולט הספקטרום, אבל protonated וsodiateיכול גם להתגלות adducts ד.

בגלל תהליך MS MALDI הוא רק מסוגל לספק מידע שפע יחסי המבוסס על יעילות היינון המקומית בתוך כל פיקסל, יש לנקוט בזהירות בעת פירוש נתוני MALDI MSI ללא איזוטופ היציב סטנדרטים פנימיים שכותרת ^49. יתר על כן, לאמון בתוצאות הלוקליזציה, אישור של כל דפוסי הפצה זוהו חייב להיעשות תוך שימוש בשיטות אלטרנטיביות. LC-MS/MS ביצוע על דגימות רקמה גזורים לאישור מומלץ.

בהתבסס על המסות מדויקות נמדדו בנוסחאות מסה הכימית בתחום הנמוכה, יכול להיות שנוצר עבור '/ z נתון; בתוך שגיאה המונית עמודים לדקה 1 ומאפשר למספר בלתי מוגבל של C, H, O, ו-N, ועד למקסימום של 2 S ו2 P לעתים קרובות רק הרכב יסודות יחיד אפשרי. מ '/ z זה גם ניתן לחפש נגד HMDB ומסדי נתוני METLIN, אשר עשוי להניב תרכובות מועמד פוטנציאליות. למרבה הצער,על MS FTICR חתך מסה הנמוך הוא CA. 130 דא, אשר עשוי להפוך אותו לקשה לביצוע ישירות MS / MS. לפיכך, נדרש אישור באמצעות מערכת אחרת לעתים קרובות.

ניסויי LC-MS/MS Q-TOF מתבצעים בדרך כלל על דגימות רקמה שהיה גזור באופן ידני מאזורים ספציפיים ברקמות של עניין. תוך שימוש בשיטת מיצוי שומנים תיארה, יכול להיות שנוצר XICs לתרכובות היעד וניתן לרכוש MS / MS לאישור. כך או השוואה לרמה אותנטית או דה נובו הבהרה מבנית נדרשת לפני לא יכולה להיות משימה כימית בטוחה.

Dithranol נעשה שימוש כדי לחקור את דפוסי חלוקת שומנים בעדשת עגל שור וגם נבדק בכבד חולדה, לב ורקמות כליה ^34. MALDI MSI יכול לשמש לאבחון של מצב מחלה אנושית והיא כבר נמצאת בשימוש לניתוח פתולוגי ^50. עם התפתחותה של חזקה יותר ולא מהיריםechnologies לMALDI MSI, הלוקליזציה המרחבית של תרכובות מסוימות עשוי להיות מידע שימושי לפתולוג. ברגע אנליטי ניתן הדמיה באופן שגרתי באמצעות שיטה המבוססת על MSI MALDI, ניתן להשתמש בו למטרות אבחון. למעשה, הדמיה רקמות ניתן לבצעו במסגרת בית חולים, עם מכשיר הממוקם בסמוך לחדר הניתוח, שבו, כפי שהודגם ⁵¹ כבר, זה יכול לשמש כדי לקבוע במדויק את השוליים של גידולים.

יש לנו מה למסור.

המחברים רוצים להכיר הגנום קנדה והגנום קולומביה הבריטית למימון פלטפורמה, ותמיכה. כמו כן אנו מודים לד"ר קרול א 'פרקר לסקירה ביקורתית של סיוע כתב היד ועריכה. CHL גם בזכות רשת פרוטאומיקה קולומביה הבריטית לקבלת תמיכה.