Ve Yetiştirme ve Enjeksiyon

Yöntemin hemocoel içine entomopatojenik bakteri doğrudan enjeksiyon kullanır burada açıklanan Manduca Sexta Böcek larvaları. M. Sexta Piyasada bulunan ve iyi çalışılmış böcek türüdür. Bu nedenle, bu yöntem, bir veya her iki ortağın perspektifinden konak-bakteri etkileşimleri analiz için basit bir yaklaşımı temsil etmektedir.

Yaygın olarak bilinen bir tütün hornworm Manduca Sexta, domates ve tütün içeren solanaceous bitkilerle beslenen, önemli bir tarımsal zararlıların olarak kabul edilir. M. duyarlılık entomopatojenik bakteri türleri ^1-5, hem de böcek bağışıklık sistemi ^6-8 ile ilgili olarak mevcut olan bilgi birikimini çeşitli Sexta larva ve beklemede olan genom sekansı ⁹ bu konak-mikrop etkileşimleri araştırılmasında kullanım için iyi bir model organizma yapmak patogenezi sırasında. Buna ek olarak, M. Sexta larvaları diğer duyarlı böcek türüne laboratuar göreli olarak işlemek ve sürdürmek için nispeten büyük ve kolay. Onların büyük boyutu da enfeksiyona konak yanıtının analizi için etkili doku / hemolimf ekstraksiyon kolaylaştırır.

Burada sunulan yöntem M. hemocoel içine bakterilerin direkt enjeksiyon (kan boşluğu) açıklar Sexta larva. Bu yaklaşımsadece enjeksiyonundan sonra böcek ölüme zaman izleyerek, çeşitli bakteri türleri, suşları, ya da mutantlarının virülans özelliklerini incelemek ve karşılaştırmak için kullanılabilir. Bu yöntem genellikle böcek girmesinden kazanmak için bir araç olarak nematod vektörleri ile ilişkilendirmek Xenorhabdus ve Photorhabdus türlerin patojenite incelemek için geliştirilmiştir. Entomopatojen nematodlar genellikle doğal sindirim veya solunum açıklıklar yoluyla larva enfekte ve böcek hemolimf (kan) kısa bir süre sonra ¹⁰ içine onların simbiyotik bakteri içeriğini yayınlayacak. Burada açıklanan yöntem ve böylece enjeksiyon böcek üzerinde bakteri ve nematod etkileri ayrılmasının bir nematod vektör için ihtiyaç atlar. Bu yöntem, nickleme ¹¹ ve oral toksisite deneyleri ¹² de dahil olmak üzere, entomopathogenesis analiz etmek için var olan diğer yöntemler kullanılarak mümkün değildir inokulum, içinde bulaşıcı malzemenin doğru sayımı (hücre ya da protein) için olanak sağlar Burada açıklandığı gibi direkt enjeksiyon yöntemi programı Böcek ölümleri takip ederek bakteriyel patogenez analiz etmektir. Bununla birlikte, bu metod M. üzerindeki enfeksiyon üzerindeki etkilerini araştırmak kullanılmak üzere genişletilebilir Sexta bağışıklık sistemi. Böcek humoral ve hücresel yanıtları hem yoluyla enfeksiyona yanıt verir. Beden irinterine ait tepki ile ilişkili bakteri desen ve tanıma farklı antimikrobiyal peptitler daha sonraki üretim ⁷ içerir; bu peptitlerin kodlayan genlerin ekspresyonu RNA ekstraksiyonu ve PCR kantitatif ¹³ aracılığıyla doğrudan enfeksiyonu takiben izlenebilir. Enfeksiyon hücresel yanıt nodülasyon, kapsülleme ve hemocytes ⁶ Enfeksiyöz ajanlar fagositozu içerir 13, 14 tarafından görüntülenebilir.

1. Böcek Yumurta Sterilizasyon ve Yetiştirilmesi

1. 900-1,000 ml H ₂ O içinde sağlanan agar ilk otoklavlanarak 15 g diyet hazırlayın Hemen sonra iyi bir laboratuvar blender 166 gr buğday tohumu diyet ve harmanı ile otoklav, karıştırın. 4 de alüminyum folyo için diyet aktarmak, ardından serinlemek için bir tabak (veya yemekleri) dökün, sıkıca sarın ve mağaza ° C
2. Girişte, M. sterilize ara sıra karıştırarak, 90 mm ​​filtre kağıdı ile bir cam filtre tutucu ve termos aparat, 2-3 dakika süreyle% 0.6 çamaşır suyu çözeltisi 250 ml Sexta yumurta.
3. Yıkama başına 250 ml steril distile H ₂ O ile çamaşır suyu çözeltisi ve yıkama yumurta 3-4 kez tahliye için vakum açın.
4. Bir Petri plaka kapağı yerleştirilmiş taze 90 mm filtre kağıdı yumurta aktarın ve onları kurutun kadar birlikte artık sopa (20-30 dk.)
5. Her kabı yaklaşık 40 yumurta koyarak, böcek diyet ile plastik kaplar altına yumurta aktarın(Şekil 1A). Yumurta nem kaynaklı fungal kontaminasyonu önlemek için diyet ayrılır. 8 saat karanlık fotoperiyodun: 16 saat ışık ile 26 yumurta ° C koruyun. Enkübasyon öncesinde sarı-beyaz renk hafifletir.
6. Kuluçka tamamlandıktan sonra, dikkatli bir şekilde alt (Şekil 1B) üzerinde bir diyet ile yeni konteyner yaklaşık 25 larvası her bir aktarın. Bu onların kırılgan erken gelişim aşamalarında onlara zarar vermemek için forseps kullanarak uzun siyah boynuz tarafından her larva almak için önemlidir. Yukarıdaki gibi 2 gün için inkübe edin. Larva ölüm bu aşamada alışılmadık olsa da, bazı ölü ya da daha büyük olasılıkla, gelişimsel bodur larva görülebilir. Bu tür böcekler fazla çalışma dışı ve donma sonucu feda edilmelidir.
7. Yamyamlık davranışları, yemek küçük parçalar (Şekil 1C) ile bireysel kaplara transferi larva önlemek ve yukarıdaki gibi inkübe etmek. Böcek gelişimini izlemek, yemek yerine ve temizlik dışkı ouher gün konteyner t onlar üçüncü larva dökücü (genellikle 6-9 gün yumurtadan sonra) geçmesi kadar. Bu böcek gövdesi (Şekil 1D) boyunca çizgili her proleg ve artan önem üzerinde siyah kanca benzeri Kroşe ve görünümü ile karakterize, ^4. evre larva aşamasında olduğunu. Larva boyutu önemli ölçüde değişebilir, ancak genellikle ^4. evre evre girdikten 0.15-0.4 gr ağırlığındadır. Benzer boyuttaki larvaları enjeksiyon için seçilmelidir.

2. Enjeksiyon için Bakteri hazırlanması

1. Eğer test etmek isteyen büyüme fazı için standart prosedürlere uygun olarak, test edilecek olan bakteri suşu (ler) büyütün.
2. Her bir bakteri suşunun Pelet 500 ul, oda sıcaklığında 13,000 rpm'de bir mikrosantrifüj içinde 2 dakika için eğirme ile test edilmelidir.
3. 1 ml steril 1x fosfat süspanse hücreleri yukarıdaki gibi tekrar tamponlu salin (PBS) ve pelet.
4. 0.5 ml steril 1x PBS ve mea içinde süspanse edin hücrelerisüspansiyon emin optik yoğunluk (OD). Gerekirse, aynı OD her süspansiyonlar seyreltilir. İstenirse, steril büyüme ortamı aynı zamanda, 1 x PBS yerine hücre yeniden süspansiyon ve seyreltme için kullanılabilir.

3. ^4. evre larvalar Enjeksiyon

1. Her bir seyreltme için yeni bir pipet ucu kullanılarak steril PBS içerisinde 1 x 96-kuyu mikrotiter plaka 6 kuyu içinde ilk olarak bakteri suşunun seri 10-kat dilüsyonu, (Şekil 2A) hazırlayın. Her bir kuyudaki hücre süspansiyonu nihai hacimli enjeksiyon (böcek başına 10 ul) artı plaka için 20 ul inokulum (adım 3.2 ve 3.7 'ye bakınız) için gerekli hacim aşmalıdır.
2. Uygun bir büyüme ortamı içeren bir Petri plaka üst kısmındaki 5 dilüsyonları (10 ^-6 ile 10 ^-2) için spot 10 ul her. Noktalar merkezi (Şekil 2B) yayılmış böylece kompaktörü yatırın.
3. Buz üzerinde kaplarda böcek diyet ve dışkı ve yerde böcekler kaldıryaklaşık 5 dk.
4. 3 kez% 70-100 etanol, 2 tüplerin her biri, steril _H2O (Şekil 2C) bir tüp ardından durulama yoluyla şırınga iğnesi sterilize edin. Sıvı hacmi batırmak iğne için yeterli olmalıdır.
5. Hemasitometre kullanarak bir mikroskop altında seyreltik hücre süspansiyonları quantitate. İstenen inokulum bağlı olarak, iyi bir uygun mikro-titer (Şekil 2B) 10 ul çizin.
6. Svab böcek% 95 etanol ile yüzey ve karın prolegs biri arkasından (45 ° 'den daha az), bir açıyla böcek içine 10 ml hücre süspansiyonu enjekte edilir. Ponksiyon gut vermemeye özen ve sadece epidermal tabakasında (Şekil 2E) altında içeriğini enjekte. Hemolimf bazı kaybı (berrak, yeşil-mavi sıvı) normal olsa da, enjeksiyon yerinde çıkan partikül madde ve sarı sıvı bağırsak delinmesi göstergesidir. Bu durum oluşursa, böcek kurban ve yeniden yeni bir larva eldeyerleştirin.
7. İlk enjeksiyon grubunda kalan her böcek için adım 3.6 tekrarlayın. İğne sterilizasyon kirlenme meydana gelmedikçe bakteri suşu ile aynı seyreltme ile enjekte edilen her bir böcek arasında gerekli değildir. Alternatif olarak, tekrar eden dağıtıcı örnekleri arasında enjeksiyon hacmi daha fazla tutarlılık için kullanılabilir.
8. Bakteri suşu ile birinci her böcek enjekte edildikten sonra, bu süre plakasının ortasında, hücre süspansiyonları lekelenme ve alt kısmından başlayarak akış (Şekil 2F) sağlayarak, aşama 3.2 'tekrarlayın. Uygun sıcaklıkta inkübe plakaları ve inokulum Numaralandırılacak kolonileri saymayın. Bu ikinci adım, bu kaplama, birinci ve ikinci kaplamalar arasında farklı koloni sayısı neden olacaktır gibi örnekleri, enjeksiyon işlemi sırasında kontamine olmadığını doğrulamak için kullanılır.
9. Tekrar denemeye bakteri her bir suş için 3.8 ile 3.1 adım. Son olarak, bir ster kullanarak steril 1x PBS ile 3-5 böcekler enjekteBir negatif kontrol grubu olarak Ile iğne. 8 saat karanlık fotoperiyodun: 16 saat ışık ile 26 ° C'de inkübe böcekler.
10. Enjeksiyonundan sonra zamanla böcek hayatta izleyin. Böcek ölümü stimülasyonu üzerine istemli hareket eksikliği olarak karakterize edilir. Böcekler genellikle Ölmeden önce enfeksiyon sırasında iştah kaybı, ishal (sulu, sarı dışkı), ve / veya su kaybı ("terleme") sergilerler; bu özelliklerin yanı sıra kayda değer olabilir.

Böcek ölümleri bir tahlil temsili bir örneği Şekil 3'te gösterilmektedir. Bu deneyde, böcekler ya da vahşi tip (ATCC19061) veya orta-log fazı (zorlanma başına n = 6 böcekler) için yetiştirilen Xenorhabdus nematophila bir zayıflatılmış mutant suşu (LRP ¹³⁾ yaklaşık 50 koloni oluşturan birim (CFU) enjekte edildi. Böcekler yaklaşık olarak 72 saat süre ile izlenir ve her bir timepoint hâlâ hayatta enjekte edilen böceklerin yüzde kaydedildi. Bu durumda, zayıflatılmış gerginlik böcek öldürme net bir gecikme göstermiş; yabani tip suşu önce herhangi bir mutant-enfekte larva ölümü, 30 saat sonrası enjeksiyon içindeki tüm 6 larva öldürdü.

Şekil 1. Enjeksiyon için hazırlık içinde Böcek yetiştirme. A) 40 Hakkında yüzeyi sterilize yumurta ile 5 oz fincan altına yerleştirilirsteril böcek diyet lastik tıpa üzerine oturtulmuş. B) yirmi böceklerin yumurtadan yeni çıkmış altında steril böcek diyet ile 5 oz bardak transfer edilir ve 2 gün için inkübe edilir. C) Böcekler sonraki alt steril diyet ile 1oz bardaklar için tek tek transfer ve olgun kadar inkübe edilir. D) Dördüncü evre M. vücut boyunca belirgin çizgiler (üst) ve karın prolegs (alt) siyah Kroşe ile Sexta larva.

Şekil 2. ^4. evre M. Enjeksiyon Sexta larva. A) Bakteri seri olarak bir 96-gözlü tabak içinde seyreltilir. B) Birden dilüsyonları On mikrolitre inokulum numaralandırmak için kaplanır. C) 3 şırınga etanol içinde durulama (2x) ve steril su ile sterilize edilir. D) uygun seyreltme Ten mikrolitre enjektöre çekilir. E) hücre süspansiyonu 45 ° enjekte edilirİlk karın proleg arkasında açısı. F) Sulandırma tekrar inokulum ikinci bir ölçü sağlamak için kaplanır.

Şekil 3. M. Temsilcisi sonucu Sexta enjeksiyon denemesi. Sabit faz (10 ^-4 dilüsyon 10 ul) Xenorhabdus nematophila hücrelerinin yaklaşık 50 koloni oluşturan birim (CFU) altı ^4. evre M. enjekte edildi gerilme başına Sexta larva. Kurulmuş bir virülans defekti Hem yabani tip ve mutant suşu (LRP) zamanla mortalite enjeksiyon ve böcekler monitorize edildi. Sonuçlar yüzde süresi (saat) üzerinde böcekler hayatta olduğu bildirilmiştir. Bu eğriler log-rank analizi yoluyla 0.000458 bir p-değeri ile istatistiksel farklıdır.

M. direkt enjeksiyon Burada açıklandığı gibi entomopatojen bakterilerle Sexta larva, bakteriyel virulans analiz için basit ve etkili bir araç olarak hizmet vermektedir. Yöntemi farklı deneysel konularda ve / veya koşullara göre aynı zamanda son derece uyarlanabilir. Bakteriler enjeksiyon öncesinde çeşitli şekillerde hazırlanabilir. X'in durumda nematophila, orta-günlük faz besin açısından zengin Luria-Bertani (LB) ortamda yetişen yabani türü hücre enjeksiyonu izleyen 30 saat içinde çoğu veya tüm böcekler öldürmek, genellikle en kışkırtıcı. Sabit faz hücreler genellikle larvaları öldürmek için artık 5-10 saat sürebilir. Büyüme fazı öldürücülük etkiler de, enjekte edilen hücre sayısı tipik inokulum 20 ila 20.000 arasında değişen CFU ile ¹⁶ daha az önemli gibi görünmektedir. Aslında, Xenorhabdus ve Photorhabdus türlerinin durumunda, 5 CFU olduğu kadar az böcek ev sahibi ¹⁷ öldürmek için yeterli olmaktadır. Virülans prope değerlendirmek içinetanol sterilizasyon (örn. Bacillus türleri) dirençli bakteri türlerinin rties, tek kullanımlık iğneler etanol sterilizasyon yerine (adım 3.4) her bir tek gerilme enjekte etmek için de kullanılabilir.

Bu yöntemin başka ayarlamalar yetiştirme ve / veya M. manipülasyonu değişiklikleri içerebilir Sexta. Örneğin, böcekler, daha doğal bir besin kaynağı olarak domates ve tütün yaprakları üzerinde yetiştirilen edilebilir. M. Alternatif olarak, farklı gelişim aşamalarında Sexta larvaları bu yöntem ile tayin edilebilir. Dördüncü evre larvalar nispeten iri boyutuna göre seçildi, ama daha küçük larvalar da bu yöntem ile enjekte edilebilir. Beşinci evre larvalar Ancak bu gelişim aşamasında bağışıklık sistemindeki değişiklikler potansiyel veri analizi komplike, erken ^5. evre larvalar ¹⁸ daha duyarlı geç 5 ^inci evre larvalar işlemek, enjekte edilebilir.

Son olarak, direkt enjeksiyonyöntem, diğer böcek türleri ile kullanılmak üzere uyarlanabilir. M. Böyle Galleria mellonella gibi diğer (daha hassas) model organizma, daha enfeksiyona karşı daha az hassastır çünkü Sexta son derece patojenik türleri için bir model sistemi olarak kullanılmaktadır. G. mellonella Bununla birlikte, bu çalışmalar ^19'da tarif edilen yöntem ile enjekte edilebilir, ve Xenorhabdus ve Photorhabdus cinsi kadar şiddetli tahlil bakteri türleri için yararlı olabilir.

Çıkar çatışması ilan etti.

Yazarlar Goodrich-Blair laboratuar geçmiş üyelerine teşekkür etmek istiyorum: Samantha Orchard, Kimberly Cowles, Erin Herbert-Tran, Greg Richards, Megan Menard ve Youngjin Park bu protokolün gelişmesine katkılarından dolayı. Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı Hibe IOS-0950873 ve Sağlık NRSA dostluk FAI084441Z Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından finanse edildi.