Yaşlanma ve Amiloid Patoloji sırasında sinaptik değişiklikler Çalışması Sıçanlar ve Transgenik Farelerde akut Hipokampal Dilimleri hazırlanması

Bu makale, sıçan ve transgenik farelerin hipokampal dilimler sinaptik değişiklikler, beynin yaşlanma ve Alzheimer hastalığı gibi nörodejeneratif hastalıklar, yaşa bağlı ile ilgili çalışma için hazırlamak için prosedürler sıralanıyor.

Kemirgen hipokampal dilim hazırlık memeli sinaptik fonksiyon ve plastisite araştırmak için belki de en çok kullanılan araçtır. Hipokampus sıçan ve fareler hızlı ve kolay bir şekilde ayıklanır ve dilim oksijenli yapay beyin omurilik sıvısı saat canlı kalır olabilir. Ayrıca, temel electrophysisologic teknikleri hipokampal dilimleri sinaptik fonksiyon soruşturma kolayca uygulanır ve bazı bilişsel bozukluklar için en iyi biyobelirteç sağladı. Hipokampal dilim, öğrenme ve hafıza yer sinaptik plastisite mekanizmalarının çalışma için özellikle popüler. Hipokampal dilimleri (veya eksikliği bunların), sinaptik etkinliği uzun vadeli potansiyasyonu ve depresyon (LTP ve LTD) indüksiyon değişiklikler, bilişsel-engelli hayvan ve / nörolojik fenotip tanımlamak için ya da eylem mekanizması değerlendirmek için sık sık kullanılır nootropic bileşikler. Bu makale hipokampal dilim sıçan ve transgenik farelerin beyin yaşlanması ve Alzheimer hastalığı (AH) ^1-3 ile ilişkili sinaptik değişiklikler çalışma için hazırlamak için kullanılan prosedürler sıralanıyor. Yaşlı sıçanlarda ve AD modeli fareler kullanımı, araştırma genç sıçan ve / ya da fare kullanarak alışık araştırmacılara özel bir takım zorluklar ortaya çıkabilir. Yaşlı sıçanlarda beyin çekimi ve / veya diseksiyonu gecikme ve dolayısıyla sinaptik fonksiyon ve plastisite gerçek yaşı farklılıklar inkâr veya abartmak genç sıçanlar ve fareler, daha kalın kafatasları ve sert bağ dokusu var. Yaşlanma ve amiloid patoloji yine fizyolojik değerlendirme alınan herhangi bir çıkarımlar komplike diseksiyon işlemi sırasında sürekli hipokampal hasar alevlendirebilir. Burada, biz bu problemleri en aza indirmek için diseksiyon işlemi sırasında atılan adımları tartışacağız. Örnekler, "sağlıklı" ve "sağlıksız" bir dilim sıçan ve fareler elde sinaptik yanıtlarının yanı sıra temsili sinaptik plastisite deneyler sağlanmaktadır. Bu hayvan modellerinde (örneğin, kayıt çözümü bileşenleri, stimülasyon parametreleri) sinaptik fonksiyon diğer metodolojik faktörlerin olası etkileri de tartışılmıştır. Bu makalenin odak noktası, yaşlı sıçanlar ve transgenik fareler, acemiler fizyolojisi dilim kullanımı olsa da, burada çeşitli kemirgen modelleri kullanarak, kendi çalışmalarına başlamak için yeterli detay bulmalısınız.

1. Hazırlanması Ice-soğuk Oksijenli Yapay Beyin Omurilik Sıvısı (ACSF)

1. ACSF "Ca ^{2 +-free"} 2 L hazırlayın. 2L Erlenmeyer şişesi, yaklaşık 1.5 L steril veya çift distile H ₂ O ekleyin ve karıştırın plaka üzerinde şiddetle karıştırarak başlamak. 124 NaCl, 2 KCl, 1.25 KH ₂ PO _4, 2 MgSO _4, 26 NaHCO ₃ ve 10 dekstroz (bkz. Tablo 1): Aşağıdaki ACSF bileşenleri (mM) ekleyin. Distile H ₂ O. ile 2 L hacim getirin .
2. % 95 O ₂ /% 5 CO ₂ hava tankı, yaklaşık 20-30 dakika boyunca şiddetle oksijen ACSF bağlı bir akvaryum bubbler ve tüp kullanma. PH kontrol edin ve gerekirse, NaOH veya HCl ile 7.4 'e ayarlamak.
3. 750 mL oksijenli Ca ^{2 +} ücretsiz ACSF ayrı bir Erlenmeyer şişesinin içine dökün, açılış kapağı parafilm, ve 20-30 dk bir ultrafreezer (-80 ° C) transfer . Bu ortam ve akut beyin hipokampal dilim diseksiyon için kullanılan olacak *. #, Iyice karıştırın, ve% 95 O ₂ /% 5 CO ₂ ile oksijenasyon devam ACSF kalan 1.25 L hacmi 2 mM CaCl ₂ ekleyin. Bu ortam diseksiyonları sonra ve elektrofizyolojik kayıtlar sırasında dilimleri perfüze beyin dilimleri saklamak için kullanılacaktır.
   * Buz gibi soğuk Ca ^{2 +} ücretsiz medya metabolizmasını yavaşlatır ve Ca ^{2 +} bağımlı eksitotoksisitesi Diseksiyon sırasında en aza indirmek için kullanılır.
   Ca ² # ^Changes yaşlanma sırasında disregülasyon ve AD, ^{Ca 2 +-bağımlı} sinaptik ^plastisite 4-9 indüksiyonu üzerinde önemli bir etkisi olabilir . Mg2 + oranları dilim kayıtları sırasında ^(2,4,10): LTD yaş farkı konusunda çelişkili raporlar farklı ACSF Ca ^{2 +} kullanılması kısmen kaynaklanıyor olabilir. Ca ² önemi ⁺ düzenleme ve ACSF Ca ^{2 +} yaşlanma çalışmalarda düzeyi Tartışma bölümünde daha ayrıntılı olarak ele alınmaktadır.
4. Ca ^{2 +} ücretsiz ACSF donma olmakla birlikte, elektrofizyolojik kayıtlar öncesinde ve sırasında beyin dilim bakım için bir holding odası hazırlamak *. Biz, dört ayrı microchambers (bkz. Şekil 2) içeren bir özel makro tutma haznesi kullanın. Macrochamber steril ile doludur, H ₂ O oksijenli ve microchambers aslında su yüzeyi üzerinde çıkıntı adalar. Her microchamber içinde, dilim oksijenli ACSF sığ bir havuz netleştirilerek eklemek bekletin. Dilimleri tamamen sular altında, ancak nemlendirilmiş hava ile bir arayüz oturmak değildir. Macrochamber içinde yalıtımlı bir gözü sıcaklık ayarı için sağlar.
   * Holding odaları pek çok çeşidi de piyasada bulunan (örneğin, Warner Instruments bir dalma-stili "Ön Odası # BSC-PC yapar) ve yaşlanma ve transgenik fare dilim çalışmalarında kullanılmak için uygun olmalıdır. Bir tutam, dilimler korunabilir ACSF ile dolu küçük bir petri birkaç saat, bir oksijen teslim tüpü için küçük bir delik Petri kapağı olun. oksijen baloncukları fiziksel dilim ajitasyon yok dikkatli olun. teslim tüp sadece ortaya Dilimleri yeterli oksijen alacak ACSF yüzeyi üzerinde (gaz dağılımı, sıvı yüzeyinde bir girinti neden olmalı).

2. Yaşlı Beyin Kaldırma ve Hipokampal Diseksiyon (> 20-aylık-sıçan)

1. Büyük bir lavabo (bkz. Şekil 1 ve Tablo 2) yanındaki diseksiyon alanı * hazırlayın. Lavabo küçük bir hayvan giyotin yerleştirin ve katlanmış bir kağıt havlu da dahil olmak üzere beyin kaldırma ve hipokampal diseksiyonu, # 11 neşter bıçak, beebee makas, kemik rongeurs, bir "Hippocampus aracı" (özel bir çift spatula için cerrahi aletler ve malzemeler yattı Güzel Cerrahi Araçları), küçük cerrahi makas, ince bir çift uçlu spatula, plastik Pasteur pipeti, 110 mm çapında whatman Filtre kağıdı, buz dolu bir kapaklı 100 mm cam petri ve plastik bir kaşık. Ayrıca, karkas imhası için bir plastik torba yakın tutun.
   * Beyin çıkarma kısa sürede tamamlanması gerektiğini, bu nedenle zihinsel prosedürü "ile yürüyüş" ve araçların kullanım amacıyla düzenlemek için iyi bir fikirdir.
2. Ca ^{2 +} ücretsiz ACSF dondurucuya kaldırın. Medya tamamen, dondurulmuş, kısmen olmalıdır. Parafilm ile kapağı, bir cam behere ACSF yaklaşık 50 ml dökün ve diseksiyon alanı yanında yer. Bu ortam, beyin çıkarıldıktan sonra kısa bir süre saklamak için kullanılır. Kalan Ca ^{2 +} ücretsiz medya dilim hazırlanması için Vibratome rezervuar doldurmak için kullanılır. Bu ortam reoxygenated olabilir, ya da sadece parafilm ile kaplı ve 4 buzdolabı yerleştirilen ° C
3. Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış yöntemler kullanarak sıçan Euthanize. Bizim hayvanlar yavaş yavaş% 100 _CO 2 ile dolu küçük bir pleksiglas odasında yerleştirilir . Bilinç kaybı genellikle beş dakika içinde ortaya çıkar ve refleks aktivite yokluğu tarafından onaylandıktanBir ayak tutam.
4. Birinci servikal vertebranın hemen rostral sıçan başını kesmek ve katlanmış bir kağıt havlu üzerine kafa yerleştirin. # 11 bistüri kullanarak, hızlı bir şekilde burun kemiği yakınında başlayan ve oksipital kemik kaudal kafa derisi ortasında bir kesi yapmak. Sütür kafatasının dorsal yüzeyi tamamen açığa, deri kas yoluyla tamamen kesmek için emin olun.
5. Kafatası plakaları beebee makasla kesti. Genç sıçanlar ve fareler, kafatası tek başına kemik rongeurs kullanımı ile hızlı bir şekilde kaldırılabilir. Ancak, yaşlı sıçanlarda bu yordamı zorlaştırabilir genç erişkin sıçan ve fareler daha kalın kafatasları var. Biz kafatası ile kesme rongeurs ile büyük ölçüde kemik kaldırma kolaylaştırır beyin yaralanması azaltır ve değerli saniye kaydeder bulduk. Rat sıkıca karşı üst başlığı ile, kafatasının arka kısmı foramen magnum üstün bölgeye beebee makas alt katıksız kesme kenarına yerleştirin. Oksipital plaka kesti kafatası iç yüzeyi (ve beyin uzak) *, düşük katıksız sıkıca tutmak, ve daha sonra parietal plakaların, orta hat dikiş boyunca. Rostrally frontal kafatası plakaları kesti kadar devam edin.
   * Basınç yanlışlıkla ölçüm önlemek için beyinden kritik önem taşımaktadır.
6. Oksipital, parietal ve beynin temporal kafatası plakaları ayırın. Istikrar ve kaldıraç için tezgah baş sıkıca tutmaya devam edin ve alt çene kafatasının iç yüzeyi karşı sol parietal plaka korumak basınç altında rongeurs slayt. Sonra, birlikte rongeurs çeneleri sıkmak ve uzak beyin parietal ve oksipital plakaları çekmek için bileğinizin yukarı ve kendinize doğru döndürün. Bu çoğu sol hemisfer dorsal yüzeyi göstermelidir. Gerekirse rongeurs, hem de sol frontal plaka kaldırmak için kullanın. Diğer yarımkürede için bu işlemi tekrarlayın. Plakalar yerinden sonra, temporal plakaları takılı ve beynin yüzeyine yayılmış olabilir herhangi bir dura konuda hızlı bir şekilde kontrol edin. Yavaşça rongeurs bu çekin ya da makasla kesip *. Şimdi, tekrar kafatası doğru ve beyin uzak tutmak basıncı, beyin ve sağ temporal plaka arasındaki rongeurs üst çene kaydırın. Beynin temporal plaka sıkıştırın ve bükün. Bunu gibi bir "crunch" duymak / hissetmeniz gerekir. Sol taraf için tekrarlayın.
   * Dura hayvan transcardially ACSF ile perfüze olmuştur, özellikle eğer fark etmek zor olabilir. Ancak dura kaldırıldı değilseniz, bunlar geçici tabak kaldırılır bir jilet gibi beyin (ve büyük olasılıkla hipokampus) aracılığıyla dilim olacaktır. Temporal plakaları yakın uzak dura Snipping beyin bıçaklama olasılığını en aza indirecektir.
7. Beyin Özü *. Ca ^{2 +} ücretsiz ACSF "ıslak" parafilm hızla çıkarın. Şimdi, beyin ve alt kafatası plakaları ventral yüzeyi arasındaki Hipokampal aracı geniş spatula baş beyin altında tamamen kadar kaydırın. Bozulmadan kranial sinirler koparmaya spatula yanal yan-yan ve daha sonra birkaç kez ileri ve geri hareket ettirin. Şimdi, ^{Ca 2} + ücretsiz ACSF ve parafilm kapak Hipokampal aracı ve batığın beyin kepçe . Yaklaşık bir dakika boyunca beyin soğuk olsun. Bu kapalı temiz, giyotin, karkas imha ve disseksiyon alanında yeniden bir fırsat.
   * Adımlar 2,3-2,7 için, hız özü. 30-35 sn (dekapitasyon ACSF altında kalma, beyin) bu prosedürü tamamlamak için deneyin. Deneyimlerimize göre, ekstraksiyon, özellikle yaşlı sıçanlarda hipokampal dilim sağlığı olumsuz etkileyecek bir dakika daha uzun sürüyor. Bu prosedürleri kullanarak, ekstraksiyon zamanlarda çalışmalar için yaşlı ve genç sıçanlar arasında hiçbir fark gözlemledik.
8. Hippocampi ayıklayın. Whatman filtre kağıdı buz petri kapağının üzerine koyun ve plastik transfer pipet kullanarak ACSF kağıt nemlendirin. Nemlendirilmiş whatman kağıt yer ve bir kaşık kullanarak ACSF beyin al. Neşter bıçak kullanarak, rostral frontal lob, beyincik ve yaklaşık dörtte biri çıkarın. Tamamen ayrı iki yarımküresinin intrahemispheric fissür yoluyla neşter bıçak çalıştırın. ACSF ıslak ve içine geri yerleştirin yarımkürede bir "stand" frontal lob koronal düzlemde aşağı baktığından emin gibi diseksiyon sahnede kadar. Beyin sapı ve orta beyin (ki beyaz) üstteki korteks (grimsi / pembe) açık bir şekilde ayırt etmek gerekir. Orta beyin superior ve inferior colliculi bulun; bu iki beyaz "düğme" gibi görüneceğini ve bu yönde beyin "top" olacak. Cerrahi makas kullanarak, yavaşça yerine Ortabeyin tutun ve boşluğu tartım spatula slaytarasında colliculi ve neokorteks. Çok spatula yavaşça aşağıya doğru kaymaya devam edecek ve orta beyin, beyin sapı / / uzak lateral ventrikül ve hipokampus medial yüzeyi iç ifşa talamus çekin. Sorunsuz forniks koparmak için keskin kenar spatula kullanın; hipokampus ön / sırt kısmı bulunan beyaz bir elyaf demeti. Makasla hafifçe orta beyin, beyin sapı / / uzakta talamus beynin geri kalanından tamamen kesilmesinin olmadan çekmeye devam edin. Hipokampus ile korteks beyin serbestçe geri koymak gerekir *. Sonra, sagital bir bölümü (eksi talamus) sanki medial hipokampus ve örten korteks bakarak böylece diseksiyon sahne açmak. Artık bu düzlemde hipokampüsün altındaki sığ bir Hiperbol oluşturan beyaz fimbria lifleri göreceksiniz. Korteks, hipokampus ayrı fimbria altındaki boşluğa plastik transfer pipet, hafifçe fışkırtma bazı ACSF kullanma. Spatula bu boşluğu içine yavaşça kaydırın spatula uzun kenarı hipokampus uzun ekseni ile paralel çalıştığından emin. Spatula hipokampus altında tamamen sonra makas ile orta beyin, beyin sapı / / talamus sıkıca basılı tutun, fiziksel beynin geri kalanı hipokampus ayrı vücudunuzdan uzakta spatula rulo. Hipokampus sonra, kalan tüm korteks, kan damarları, ve beyaz cevher hafifçe kırpın. Diseksiyon sahne uzak yüzüne ACSF ıslak küçük bir miktar Scoop. Plastik transfer pipet kullanarak ACSF birkaç mililitre slush ve söndürmeye yanında hipokampus yavaşça yerleştirin. Sonra, diğer yarımkürede çıkarın ve diseksiyon tekrarlayın.
   * Makas, beyin sapı, korteks ayrımı önleyen ek bağ dokusu, beyaz cevher, ya da damarsal uzak snip gerekebilir. Makas noktaları hipokampus çok yakın olacak, bu yüzden çok hassas snips (keskin bir makas gerekir) teslim etmek için emin olun.

3. Yaşlı Transgenik Farelerde Beyin Kaldırma ve Hipokampal Diseksiyon

1. Euthanize ve başını kesmek fare ve bölüm 2.3 'de açıklandığı gibi, kafa derisi üzerinde orta hat kesi yapmak. Fareler büyük ölçüde beyin çıkarma kolaylaştırır sıçanlardan daha çok ince kafatasları var. Kafatası makasla kesen bu nedenle gereksiz. Oksipital, parietal ve temporal kafatası plakaları çekmek için, küçük çeneleri (Tablo 2) ile kemik rongeurs kullanın. Sıçan gibi, kontrollü hareketleri ve plakaları kaldırmak gibi sıkıca beyinden uzak rongeurs alt çene kafatasının iç yüzeyi içine çekin ve hatırlıyorum. Plakalar kaldırıldıktan sonra, kalan kraniyal sinirlerin sever ve buz Ca ^{2 +} ücretsiz ACSF beyin kepçe Hipokampal aracı dar ucu kullanın.
2. Beyin dilimleri hazırlayın. Sıçan kullanarak daha hippocampi diseksiyon fare beyni küçük boyutu nedeniyle biraz daha zor olabilir ama kesinlikle yapılabilir. Yani, şeyleri kolaylaştırmak için, serebellum ve frontal loblar rostral ipuçları kaldırmak, ancak hippocampi teşrih yok. Bunun yerine, beyin hemisferlerin fiziksel bir neşter bıçağı ile ayrılmış ve (bkz. Bölüm 4) Vibratome kesit değişmeden kalır.

4. Bölüm Beyin Into Titreşimli Mikrotom (Vibratome) kullanarak Dilimleri Doku ve Holding Odası * Transfer

1. Kesme aşamasında ve bıçak tamamen sular altında olduğunu buz Ca ^{2 +} ücretsiz ACSF, Vibratome rezervuar doldurun. Sıçan dilim yapmak için her hipokampus rostral ve kaudal ipuçları, bir neşter bıçağı ile kesti. Bu kesimler, dikey iki sütun gibi yakından birlikte hippocampi konumlandırmak için izin verecektir. Bu her hipokampus, dentat girus birbirleriyle karşı karşıya olduğu ve CA3 bölgeler aynı yönde odaklı eğer iyi çalışır. Fare dilim yapmak için, dikey frontal lob aşağı bakacak yakından birlikte her yarımkürede pozisyon. Tutkal bir montaj blok ve Vibratome kesit sahne transfer üzerine beyin dokusu. Biz genellikle ~ 400 UM bölümleri sinaptik fizyolojisi deneyleri için hazırlar. Tiner bölümleri, floresan görüntüleme (örneğin soruşturma ^{Ca 2} + düzeyleri ve geçici) yapılacaktır eğer hazırlıklı olmalıdır . Geniş ağızlı bir pipet veya # bir boya fırçası ile dilimleri toplayın ve buz gibi ^{Ca 2} + ücretsiz ACSF içeren küçük bir petri aktarmak .
   * Dilim alt ve üst yüzeylere Vibratome en aza indirir hasar kullanın ve kesinlikle dilim yüzeyi (örn. gerilim kelepçe ve Ca ^{2 +} görüntüleme çalışmaları) yakınındaki hücrelerin analizi gerektiren çalışmalar için tavsiye edilir. Ancak, daha ucuz alternatifler mevcuttur ve ekstrasellüler fizyolojisi deneyleri için dilimleri oluşturmak için uygundur. Biz küçük bir ağırlık kontrollü kıyıcı ^2,11 ve iyi bir başarı ile McIlwain Doku ^Chopper 12 kullandık . Thi içins prosedürü hippocampi dikey bir kıyıcı ile sahnelenen ve kesitli yerleştirilir. Bir fırça, buz ^{Ca 2} + ücretsiz ACSF dolu küçük bir holding çanak dilimleri (bir kerede bir) aktarmak için kullanılır . Bir sorun bu yaklaşım ile hippocampi düzensiz bölümlerde çıkan pirzola arasında taşıyabilirsiniz. Ayrıca, fazla beyaz madde, özellikle doğrama önce mümkün olduğunca çok damarsal gibi kaldırmak için dikkatli olun. Bu malzeme fırçası, tıraş bıçağı, ya da, dilim transferi çok zor ve doku germe veya zarar verme olasılığını artırarak hem sopa olacak.
   # Zaman bir fırça kullanarak, kıllar karşısında dilim boy-bilge dinlenmek için deneyin. Fırça ucu çevresindeki dilim Sarma gereksiz doku germe neden olabilir.
2. Oksijenli Ca ^{2 +} içeren ACSF yıkandığı tutarak odasına beyin dilimleri aktarın. Yavaş yavaş 32 ° C (+1 ° her beş dakikada bir) 27 ° 'den oda sıcaklığına getirmek. İzin dilimleri elektrofizyolojik deneylerde önce 1-1,5 saat süreyle inkübe.

5. CA3-CA1 Synaptic tepkiler ve Kayıt

1. Uyarıcı, kayıt, ve topraklama elektrotları; bir perfüzyon sistemi;> 4X büyütme özelliğine sahip bir mikroskop bir kayıt odasına makro ve mikromanipülatörler; sert bir titreşime dayanıklı: akut dilimleri temel ekstraselüler kayıtlar için, elektrofizyoloji istasyonu * dahil etmek gerekecektir masa üstü ve Faraday kafesi; stimülatörü, amplifikatör ve analog-dijital (A / D) çevirici, uygun satın alma yazılımı ile ve kişisel PC osiloskop (tercihen).
   * Kerr Scientific Instruments, bir dizi temel dilim elektrofizyoloji deneyleri yürütmek için bir fantastik ve ucuz elektrofizyoloji sistemi (yani Kerr Doku Kayıt Sistemi) sunmaktadır. Bu sistem, küçük bir ayak izi, taşınabilir uyarıcıları ve amplifikatörler ve hantal bir Faraday kafesi ihtiyaç duymadan standart bir laboratuvar tezgahı üzerinde kullanılabilir.
   Tabii ki, beyin dilimleri de ek ekipman ve malzeme gerektiren çok sayıda ayrıntılı elektrofizyolojik ve görüntüleme teknikleri, gerçekleştirmek için kullanılır. Örneğin, ana elektrofizyoloji istasyonu hızlı voltaj ve akım kelepçe yetenekleri, floresan aydınlatma sistemi ve bir dijital fotoğraf makinesi ile bir amplifikatör içerir. Bu istasyon yanı sıra beyin dilimleri, yama klemp kayıtları ve dilimleri ve hücre kültürleri ^3,12,13 floresan görüntüleme ekstrasellüler alan kayıtları için kullanılır. Tablo 3, teçhizat ve bileşenlerin tam bir liste için Bkz.
2. Geniş ağızlı bir pipet veya küçük boya fırçası kullanarak, kayıt odasına * stimülasyon / kayıt 10-15 dakika önce gelmesini sağlayan bir veya birden fazla dilim transferi. Çalışmalar için, dilimler (bkz. Şekil 3), Warner Instruments tarafından bir RC-22 odasına yerleştirilmiş file ACSF ve dinlenme batmış. ACSF ağırlık akış hızını ayarlamak için bir regülatör ile beslenen ve 32 prewarmed ° C kayıt odasına ulaşmadan önce bir satır içi mikro-ısıtıcı. Bir merkezi vakum hattı ASCF kaldırmak için kullanılır.
   Dalgıç ve tarzı arabirim kayıt odaları * Birçok farklı çeşitleri piyasada mevcut. Biz dilimleri (yani dilim nemlendirilmiş hava ve ACSF bir arayüz oturur) ^2,11 daha güçlü bir arayüz odasında sinaptik tepkiler sergilediklerini gözlemledik. Ancak, cevap verebilen dilim ACSF batık zaman genellikle daha istikrarlı. İlaç perfüzyon dalma odaları da daha verimli olur.
3. Pozisyonu uyarıcı ve elektrotlar kayıt. Stimülatörü veya uyaran izolatör açık, ancak çıkış konumu CA3 sınırına yakın CA2 stratum radiatum bölgesi (bkz. Şekil 4) dilimin üzerinde uyarıcı bir elektrot, 0 aşağı aranan. Biz CA3 Schaffer teminat (SC) lifleri 50-100 uS difazlı bakliyat teslim etmek için bir bükülmüş platin iridyum tel kullanıyoruz. Platin iridyum tel ve difazlı bakliyat kullanımı minimize elektrot kutuplaşma yardımcı olabilir. CA1 stratum radiatum içine bir kayıt elektrot Alt dilim çatlatabilir. Bizim kayıt elektrot Ag / AgCl ACSF dolu bir cam mikropipet (M ~ 7 ucu direnci) tel. Stimülatör çıkış orta düzeyde (~ 150 uA uyaran izolatör) açın ve uyaran bakliyat yönetmek ve yavaş yavaş küçük uyarıcı elektrot düşük Axon Instruments, Inc Clampex olarak satın alma yazılımı kullanarak faaliyet satın başlamak bir uyarıcı artificact kadar aralıklarla CA1 kaydedilir. Sonra, fiber voleybolu (FV) ve genlikleri (bkz. Şekil 4B) maksimum seviyelere ulaşmak eksitatör postsinaptik potansiyel (EPSP) kadar CA1 yanıtları elde edilirken aralıklarla yavaş yavaş ve kayıt uyarıcı elektrotlar hem düşük devam etmektedir.
4. Sinaptik gücü eğrisinin oluşturulması ve sinaptik plastisite araştırmak. Sinaptik gücü eğrisi oluşturmak için, giderek artan yoğunluğu ve kayıt inci SC uyaran bakliyat teslimCA1 e karşılık gelen aktivite. Kullanılan uyaran yoğunluğu seviyeleri aralığı ve sayısı değişebilir ama FV veya EPSP değerleri (Şekil 5) ya karşı çizilen bir sigmoid eğri oluşturmak için yeterli olmalıdır. EPSP eğim monosinaptik CA3 CA1 akımları kirlenmemiş bir önlem sağlar FV genlik, aktif presinaptik liflerin oranı güvenilir bir tahmin sağlar. Bu nedenle uyaran yoğunluğu seviyeleri arasında FV karşı EPSP yamacında plotlama aktif afferentleri numarası başına EPSP boyutunu yansıtır ve CA3-CA1 sinaptik gücü mükemmel bir tahmin sağlar. Tipik olarak, örneğin 4,14 görmek genç sıçanlar ve yaş eşleştirilmiş wild-tip farelerden göre yaşlı sıçanlar ve APP/PS1 fareler, alan CA1 sinaptik gücü düzeyleri önemli ölçüde azalır.
5. Sinaptik gücü eğrisi sırasında kötü sağlık işaretleri (yani maksimum bir EPSP genlik <1 mV) ya da (yani, 2 ya da daha fazla nüfus ani bir görünüm) hipereksitabilite göstermektedir Dilimler, istatistiksel analiz (bkz. Şekil 4C) dışındadır. Biz bu dilim nadiren 60 dk süre ve / veya sinaptik plastisite indüksiyonu sonrasında son derece değişken tepkiler karşısında kararlı tepkiler gösterirler bulduk. "Sağlıksız" kayıt odasına transfer edilen tüm dilim dilim sadece yaklaşık% 10-20 makyaj dikkati hak ediyor. Ayrıca, deneyimlerimiz, sağlıksız bir dilim tanımlayan sıklığı, yaş, cins, ve genotip karşısında çok benzer.
6. Dilimler halinde uzun vadeli potansiyasyonu (LTP) veya uzun süreli depresyon (LTD) uyarır. LTP ve LTD sinaptik aktivasyon farklı desen yanıt sinaptik fonksiyonu kalıcı artışlar (LTP) ve düşüşler (LTD). Süreçlerinin her ikisi de yaygın öğrenme ve memory15 için kritik mekanizmalar yansıtacak ve sinir fonksiyon bozukluğu ve / hücresel mekanizmaları araştırmak için ya da bellek kusuru ve ^{nörodejenerasyon} 16 iyileştirmede farmakolojik stratejileri değerlendirmek için yararlı sonuç önlemleri sağlamak için inanılıyor .
   Sinaptik plastisite deneyler için, her dilim için 1 mV * stimulus sıfırlamak ve 0.033 Hz frekansta bazal stimülasyon başlar. EPSP eğim değerleri LTP veya LTD indüksiyon önce en az 20 dakika süreyle sağlam olmalıdır. Bu süre boyunca yakından EPSPS izlemek ve eğimi% 10'dan fazla dalgalanır ve yeni bir temel başlangıç ​​stimulus sıfırlamak. Verilen her 200 ms, 100 Hz stimülasyon 100 Hz stimülasyon veya birden çok kısa patlamaları (~ 10 bakliyat) ikinci bir tren kullanarak LTP neden. LTD indüksiyonu için, 1 Hz hızında 900 uyaran bakliyat sunar. LTP ve LTD indüksiyonundan sonra, ek bir 60 dakika veya daha fazla sinaptik tepkiler toplamak. LTP ve LTD varlığını belirlemek için, öncesi ve yüksek / düşük frekanslı stimülasyon 60 dk sonra elde edilen EPSP eğim değerleri karşılaştırıldı.
   Yaşlı sıçanlar ve APP/PS1 fareler, eksik LTP ve gelişmiş LTD (bkz. Şekil 5) gösterme eğilimindedir ve bu değişikliklerin, bu ^hayvan modelleri 6,16 Bozulan algı katkıda bulunmak için öne sürülmüştür. Ancak, yaşlı sıçanlarda LTP / LTD değişikliklerin, APP/PS1 farelerin aksine laboratuarları boyunca değişkendir. Yaşlı sıçanlarda genellikle yetişkinler için "yoğun" (yani 100 Hz) stimülasyon yanıt benzer LTP seviyeleri gösterirler, ancak hafif stimülasyon parametreleri kullanılmıştır gösterisi açıkları (yani düşük uyaran frekansları veya daha az uyaran bakliyat) (inceleme için ^4,6 bkz. ^16). Ayrıca, bazı laboratuvarlar, bizimki de dahil olmak üzere, diğer gruplar, yaşlı hayvanlarda herhangi bir fark ya da azalmış duyarlılık bulduk, yaşlı sıçanlarda ^2,17-19 LTD indüksiyon artmış duyarlılık gözlemledik. Gibi (Tartışma) aşağıda kısaca ele, deneysel protokol ince ama kritik farklılıklar, bu farklılıklar hesaba olabilir.
   * Stimülasyon yoğunluğu ve EPSP genlik LTP indüksiyon etkisi ve literatürde çelişkili sonuçlar önemli bir neden olabilir. Tartışma bölümünde de dikkate alınacaktır.

6. Temsilcisi Sonuçlar

Bizim işimiz, ve diğer grupların çalışmaları, astrosit tabanlı inflamatuar sinyalizasyon değişiklikleri tetikleyebilir ve / veya yaşlanma ve AD ^13,20,21 sırasında nörolojik disfonksiyon acele olduğunu göstermektedir. Son zamanlarda, etkinliği ve (bu model açıklamasına için ^22), orta yaşlı APP/PS1 farelerde birkaç roman anti-inflamatuar reaktifler eylem mekanizmaları araştırmak için uç nokta önlemler olarak sinaptik gücü, LTP ve LTD kullanılan ve Fischer yaş var 344 sıçan. Bu makalede açıklanan protokolleri kullanarak aşağıda verilen sonuçlar elde edilmiştir.

Yeni anti-inflamatuar adeno-ilişkili laboratuvarı tarafından geliştirilen viral (AAV) reaktifler (sinaptik gücü önemli ölçüde artış (p <0.05) ve orta yaşlı LTP açıkları (p <0.05) engellemek için pilot çalışmalarda gösterilmiştir olmuştur 16 aylık) APP/PS1 fareler (n = 4-6 dilim tedavi durum başına). Iki farklı dilim, argo Temsilcisi sinaptik gücü eğrileri ve LTP deneyleraynı 16 aylık APP/PS1 fare Seniyye, Şekil 5A-C gösterilmiştir. Bir dilim, diğer dilim kontrol AAV reaktifi (kontrol) ile tedavi edildi, (Reaktif A) romanı AAV ile tedavi yarımkürede ekstrakte edildi. LTP 100 Hz stimülasyon (10 sn intertrain aralık) iki 1 sn trenleri kullanan her iki dilim indüklenen. Reaktif A ile tedavi edilen dilim sinaptik gücü eğrisi daha fazla sinaptik gücü gösteren kontrol dilim sol kayar unutmayın. Ayrıca LTP APP/PS1 orta yaşlı fareler için tipik kontrol dilim (örneğin ²³⁾ başlangıca hızla çürümesi dikkat edin. Tersine, LTP roman reaktifi ile tedavi dilim az çürümüş bir.

İkinci bir çalışmada, araç-tedavi edilen yaşlı sıçanlarda (pre-LTD bazal, p <0.05% 85) önemli LTD gözlemledi. Buna karşılık, hiçbir LTD yeni anti-inflamatuar "İlaç" (% 97 ön LTD bazal, anlamlı değil) ile tedavi edilen yaşlı sıçanlarda gözlendi. Sinaptik gücüne hiçbir ilacın etkileri gözlenmiştir. Bu veri seti (n = 8-10 sıçanlar grup başına) Temsilcisi LTD deneyler Şekil 5D-F gösterilmiştir.

Şekil 1. Beyin diseksiyon için kullanılan araç ve gereçleri, kağıt havlu. B, neşter bıçak. C Beebee makas. D, kemik rongeurs (sıçan). E, kemik rongeurs (fareler / sıçanlar için). F, Plastik kaşık. G, plastik transfer pipet. H Hipokampal aracı. Ben, spatula. J, cerrahi makas. K, cam petri.

Şekil 2. Özel beyin dilim odasına sahip. Macrochamber. B, kapağı. C, H ₂ O delikli silikon tüp rezervuar. D, microchamber. E ACSF teslim tüp (polietilen). F, O ₂ teslimat tüp. G, sıcaklık kontrolü için port. H düşülmektedir microchamber eklemek.

Şekil 3. RC22 dalma odası, Kayıt odasına. B, Zemin elektrot. C Aspirasyon iğne.

Şekil 4. Hipokampal dilim illüstrasyon ve ekstrasellüler dalga şekilleri. Elektrofizyoloji deneylerde kullanılan enine hipokampal bölümü, Çizgi Film. CA = cornu Ammonis. DG = dentat girus. SC = Schaffer teminatlar. S radiatum = stratum radiatum. B, SC (CA3 akson yolu) Elektrik stimülasyon, bir uyarıcı artifakı ortaya çıkarır, bir presinaptik nüfus artış, ya da fiber voleybolu (FV) ile neredeyse hemen sonra. FV genlik aktif SC liflerin sayısı ile doğru orantılıdır. Devam eden negatif faz alanında eksitatör postsinaptik potansiyel (EPSP) eğim SC terminallerinden serbest glutamat yanıt CA1 piramidal nöronlarda sinaptik akımları depolarizan aktivasyonu ile doğrudan ilişkilidir. C, bir "sağlıklı" (sol panel) dokuz farklı uyaran yoğunluğu düzeyleri (3-50 uA) yanıt CA1 stratum radiatum kaydedildi Çakışan temsilcisi ekstrasellüler dalga, "sağlıksız" ve "hyperexcitable" dilim. Beş dalga şekilleri seviye başına ortalamaları alındı. Sağlıklı dilimleri bu uyaran aralığında dinamik cevap ve tek bir olumlu devam eden nüfus başak (CA1 nöronal deşarjı yansıtan) yüksek teşvik düzeyde sergilemek. RC22 dalma kamara, maksimum EPSPS genellikle 1.5 genlik 3 mV arasında değişmektedir. Sağlıksız dilim (orta panel), genellikle büyük bir FV, ancak küçük bir maksimal EPSP (<1 mV) sergi ve genellikle kötü plastisite gösterir. Hyperexcitable dilimleri (sağ panel) iki veya daha fazla EPSP artan uzuv rejeneratif nüfusun ani göstermektedir. Hyperexcitable dilimleri tepkiler çoğu labil ve değişken LTD / LTP stimülasyon tarafından etkilenir.

Şekil 5. Temsilcisi elektrofizyoloji deneyleri akut dilim orta yaşlı (16 ay) APP/PS1 fareler ve Fisher 344 sıçanlarda (22 ay) yaşlı üzerinde yapılan bir kontrol adeno-ilişkili (AAV) viral tedavi APP/PS1 fareler toplanan Panelleri AB gösteren veriler inşa (Kontrol) ya da bir roman AAV reaktif (Reaktif A) laboratuar grup tarafından geliştirilmiştir. Daha fazla sinaptik gücü göstergesi FV eğrisi (A): Bağıl> kontrol dilim dilim, bir sergiler Reaktif EPSP belirgin bir sola doğru bir kayma tedavi. Reaktif-A-tedavi dilim de, (B) iki 1 sn, 100 Hz uyaran trenler tesliminden sonra, sağlam ve istikrarlı LTP gösterirken, bu hayvan modelinde tipik kontrol dilim sergiler eksik LTP. Paneller, araç ya da bir roman anti-enflamatuar ilaç (İlaç) kronik (4 hafta) intrahippocampal perfüzyonları alan iki ayrı yaşlı sıçanlarda toplanan gösteren veriler DF. Bazal sinaptik gücü ilaç tedavisi nispeten etkilenmemiş(D). Ancak, İlaç LTD (E) indüksiyon önlemede çok etkili oldu. Paneller C ve F gösterisi temsilcisi EPSP önce tek tek dilimler kaydedilen dalga şekilleri (ön) ve 60 dk sonra (post) LTP / LTD stimülasyon teslim. Uyaran eser gösterilir unutmayın.

Bu protokolde belirtilen adımları beyin diseksiyonları, yaşlı, genç erişkin sıçan gibi en azından hızlı ve verimli bir şekilde yapılmaktadır sigorta yardımcı olacaktır. Biz de LTP ve LTD kendi dilim çalışmalar kurmak için yeni başlayanlar için yeterli ayrıntı sağlar. Yaşlanma ve sinaptik fonksiyon ve plastisite AD değişiklikleri daha fazla arama hedeflerinden biri ise, bir daha görüşülmek hak yukarıda ima en az iki metodolojik konular, vardır. İlk olarak, çeşitli laboratuvarlar gösterilen Ca ^{2 +:} Mg2 + ACSF hipokampal dilim ^2,10,24,25 indüksiyon sinaptik plastisite üzerinde belirgin bir etkisi olabilir kayıt oranı. Memeli BOS, Ca ^{2 +:} Mg2 + oranı yaklaşık biri (örneğin ²⁶ görmek). Ancak, ACSF Ca ^{2 +:} Mg2 + yakın 2 oranları sinaptik fonksiyon ve plastisite dilim çalışmaları yaygın olarak kullanılmaktadır. Erken çalışmalarda, bu uygulama muhtemelen LTP indüksiyon optimize etmek için adapte oldu, ardından tüm plastisite çalışmaları için bir rutin haline geldi. Ancak, bu uygulama nöronal Ca ^{2 +} düzenleme iyi karakterize farklılıklar nedeniyle yaşlanma ve AD çalışmaları sorunlu olabilir. Özellikle, Ca ^{2 +} akını ve / veya Ca ^{2 +-indüklenen} Ca ^{2 +-sürüm 3,27-31} nöronal aktivasyon sırasında yaşlı sıçan ve / veya AD modeli fareler yüksek. LTD İndüksiyon ACSF Ca ^{2 +} düzeyleri ince değişiklikler özellikle duyarlıdır. Mg2 yakın iki + oran, erişkinlerde sağlam LTD gözlenen var içinde: 2mm Ca ^{2 +} ve 2 mM Mg2 +,, yaşlı, ama ² yetişkin hayvanların genç değil LTD yaygın sonuçları ise bir Ca ² kullanarak çalışmalar ⁺ kullanan Bizim protokol, ³² yaşlı sıçanlarda azaltılmış LTD ile birlikte bir yaş farkı ^2,10 ya da yokluğu. Bu gözlemler, yaşlı ve genç erişkin hayvanlarda Ca ^{2 +} bağımlı plastisite karşılaştırırken dikkatle ACSF Ca ^{2 +} ve Mg2 + düzeyleri dikkate almak gerektiğini vurgulayın.

Ikinci metodolojik sorunu postsinaptik depolarizasyon ³³ ve sinaptik gücü yaşlanma / genotip farklılıklar LTP güçlü bağımlılık ilgilidir. Tipik bir LTP deney, temel ve LTP stimülasyon yoğunluğu, genellikle bir buçuk maksimal (veya üç çeyrek) EPSP maksimum genlik üretmek için ayarlanır. Potansiyel bir sorun, yaşlı sıçanlar ve APP/PS1 fareler, genellikle bazal EPSP değerleri de yaşlı sıçanlar ve APP/PS1 fareler daha küçük olacağı anlamına, genç ve / veya yabani tip meslektaşları göre sinaptik gücü azalır göstermektedir. Daha küçük EPSPS ^LTP 33 indüklemesi için daha düşük bir olasılık, LTP stimülasyon sırasında daha az depolarizasyon çevirmek olabilir . Çünkü bu potansiyel bulandırabilir, bu hayvanların verim açığı, bir plastisite açığı ya da her iki sergi belirlemek zordur. Yani, yaşlı ve / veya APP/PS1 fareler LTP indüksiyon mekanizmaları (hayır plastisite açığı) işlevsel sağlam olabilir, ama yetersiz, bu koşullar altında (verim açığı) uyarılır. Bu ayrım, hacmi ve plastisite mekanizmaları mekanizmaları belirli bir farmakolojik tedavi çok farklı tepki olarak kritik öneme sahiptir. Biz LTP stimülasyon öncesinde tüm dilimleri boyunca aynı seviyede (örneğin 1 mV) EPSP genlik normalleştirilmesi LTP indüksiyon azaltılmış throughput etkisini en aza indirmek için çalışıyoruz. Diğer stratejiler de etkili olabilir (örneğin, voltaj ya da akım kelepçe kullanımı LTP stimülasyon sırasında gruplar arasında membran potansiyeli eşitlemek için) ve bu hayvan modellerinde LTP soruşturma zaman düşünülmelidir.

NIH hibe AG027297, bir ödül Kentucky Omurilik ve Kafa Travması Araştırma Güven, ve hediye Kléberg Vakfı tarafından desteklenen çalışın.