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Este artigo descreve procedimentos para preparar fatias do hipocampo de ratos e camundongos transgênicos para o estudo de alterações sinápticas do cérebro associadas ao envelhecimento e relacionadas com a idade as doenças neurodegenerativas, como doença de Alzheimer.
O roedor preparação fatia do hipocampo é talvez a ferramenta mais amplamente utilizado para investigar função sináptica mamíferos e plasticidade. O hipocampo pode ser extraído de forma rápida e facilmente de ratos e camundongos e fatias de permanecer viável por horas em oxigenado líquido cefalorraquidiano artificial. Além disso, técnicas básicas electrophysisologic são facilmente aplicadas à investigação da função sináptica em fatias do hipocampo e forneceram algumas das melhores biomarcadores para deficiências cognitivas. A fatia do hipocampo é especialmente popular para o estudo de mecanismos de plasticidade sináptica envolvida na aprendizagem e memória. Mudanças na indução de potenciação de longa duração e depressão (LTP e LTD) da eficácia sináptica em fatias do hipocampo (ou falta dele) são freqüentemente usados para descrever o fenótipo neurológico de animais com deficiência cognitiva e / ou para avaliar o mecanismo de ação da compostos nootropic. Este artigo descreve os procedimentos que usamos para preparar fatias do hipocampo de ratos e camundongos transgênicos para o estudo de alterações sinápticas do cérebro associadas com o envelhecimento ea doença de Alzheimer (AD) 1-3. Uso de ratos e camundongos com idade modelo AD pode apresentar um conjunto único de desafios para os pesquisadores acostumados a usar ratos mais jovens e / ou ratos em suas pesquisas. Ratos idosos têm crânios mais espessa e mais resistente do tecido conjuntivo de ratos mais jovens e camundongos, o que pode atrasar extração de cérebro e / ou dissecção e, conseqüentemente, negar ou exagerar verdadeira idade diferenças na função sináptica e plasticidade. Envelhecimento e patologia amilóide também pode agravar a lesão do hipocampo sustentada durante o processo de dissecação, novamente complicando qualquer inferências a partir da avaliação fisiológica. Aqui, discutimos as medidas tomadas durante o processo de dissecção para minimizar esses problemas. Exemplos de respostas sinápticas adquiridos em "saudável" e "insalubre" fatias de ratos e camundongos são fornecidos, bem como representante experimentos plasticidade sináptica. O possível impacto de outros fatores metodológicos sobre a função sináptica nestes modelos animais (por exemplo, componentes de gravação solução, parâmetros de estimulação) também são discutidos. Embora o foco deste artigo é sobre o uso de ratos idosos e camundongos transgênicos, os novatos para cortar fisiologia deve encontrar detalhes suficientes aqui para começar a fazer seus próprios estudos, usando uma variedade de modelos de roedores.
1. Preparando Ice-frio oxigenada Líquido Cefalorraquidiano Artificial (ACSF)
2. A remoção do hipocampo do cérebro e dissecção em idosos (> 20 meses de idade, ratos)
3. A remoção do hipocampo do cérebro e dissecção em Aged Ratos transgênicos
4. Tissue seção do cérebro em fatias usando um micrótomo vibratório (Vibratome) e Transferência à Holding Câmara *
5. Suscitar e Record CA3-CA1 Responses Synaptic
6. Resultados representante
Nosso trabalho, eo trabalho de outros grupos, sugere que as mudanças no astrócito baseado sinalização inflamatória podem desencadear e / ou acelerar a disfunção neurológica durante o envelhecimento e AD 13,20,21. Recentemente, temos usado a força sináptica, LTP e LTD como medidas de desfecho para investigar a eficácia e os mecanismos de ação de vários novos medicamentos anti-inflamatórios reagentes em meados de idade APP/PS1 camundongos (22 para ver descrição deste modelo) e com idades entre Fischer 344 ratos. Os resultados apresentados a seguir foram obtidas utilizando os protocolos descritos neste artigo.
Um dos novos anti-inflamatórios viral adeno-associado (AAV) reagentes desenvolvidos por nosso laboratório tem sido demonstrado em estudos-piloto para aumentar significativamente a força sináptica (p <0,05) e evitar déficits LTP (p <0,05) na meia-idade (16 meses de idade) APP/PS1 camundongos (n = 4-6 fatias por condição de tratamento). Representante sináptica curvas de força e experimentos LTP de duas fatias diferentes, collected do mouse de 16 meses de idade, mesmo APP/PS1, são mostrados na Figura 5A-C. Uma fatia foi extraído do hemisfério tratados com nosso romance AAV (Reagente A), enquanto outra fatia foi tratado com um reagente de controlo AAV (Control). LTP foi induzida em ambas as fatias com dois trens 1 seg de 100 Hz de estimulação (10 seg intertrain intervalo). Note que a curva de força sináptica para o reagente A-tratados fatia é deslocado para a esquerda da fatia de controle, indicativo de maior força sináptica. Observe também que, típico de meia-idade APP/PS1 camundongos, LTP deteriorado rapidamente a linha de base na fatia de controle (por exemplo, 23). Por outro lado, LTP decadente pouco na fatia tratados com reagente de nosso romance.
Em um segundo estudo recente, observamos LTD significativo em ratos tratados com veículo com idade (85% da linha de base pré-LTD, p <0,05). Em contraste, não LTD foi observado em ratos idosos tratados com o romance anti-inflamatório "Drogas A" (97% dos pré-LTD linha de base, não significativo). Nenhum efeito de drogas na força sináptica foram observados. Experimentos representante LTD deste conjunto de dados (n = 8-10 ratos por grupo) estão ilustrados na Figura 5D-F.
Figura 1. Ferramentas e materiais utilizados para a dissecação do cérebro. A toalha de papel,. B, lâmina de bisturi. C, Beebee tesoura. D, fórceps óssea (para ratos). E, fórceps óssea (para camundongos / ratos). F, colher de plástico. G, pipeta de plástico. H, ferramenta do hipocampo. I, espátula. J, tesouras cirúrgicas. K, placa de Petri de vidro.
Figura 2. Fatia do cérebro personalizado segurando câmara. Macrochamber A,. B, tampa. C, H 2 O reservatório com tubo de silicone perfurado. D, MicroChamber. E, ACSF tubo de entrega (polietileno). F, O tubo de entrada 2. G, porta para controle de temperatura. H, insira MicroChamber saldada.
Figura 3. RC22 câmara de submersão. A câmara de Gravação,. B, eletrodo de aterramento. C, a agulha de aspiração.
Figura 4. Ilustração fatia do hipocampo e formas de onda extracelular. Um dos desenhos animados, de uma seção transversal do hipocampo utilizados em experimentos de eletrofisiologia. CA = cornu Ammonis. DG giro denteado =. SC = colaterais Schaffer. S = radiatum estrato radiatum. B, a estimulação elétrica do SC (a CA3 axônio trato) provoca um artefato de estímulo, seguido quase imediatamente por um aumento da população pré-sináptica, ou vôlei de fibra (FV). A amplitude da FV é diretamente proporcional ao número de fibras SC ativado. A inclinação da fase negativa contínua do campo potencial excitatório pós-sináptico (EPSP) corresponde diretamente à ativação de correntes de despolarização sináptica em neurônios piramidais CA1 em resposta ao glutamato liberação dos terminais, SC. C, sobreposição de formas de onda representante extracelular registrado em CA1 estrato radiatum em resposta a estímulo nove níveis diferentes de intensidade (3-50 mA) em uma "saudável" (painel esquerdo), "não saudáveis", e fatia "hiper". Cinco formas de onda foram em média por nível. Fatias saudável responder de forma dinâmica em toda esta gama de estímulos e exibem uma única positiva curso população pico (refletindo CA1 descarga neuronal) nos níveis mais elevados de estímulo. Na câmara RC22 submersão, EPSPs máxima normalmente variam entre 1,5 e 3 mV em amplitude. Fatias insalubres (painel do meio), muitas vezes exibem um FV grande, mas um pequeno EPSP máxima (<1 mV) e, geralmente, mostram plasticidade pobres. Fatias hiperexcitável (painel direito) mostram dois ou mais picos de população regenerativa no ramo ascendente da EPSP. Respostas em fatias hiperexcitável são freqüentemente lábeis e são variavelmente afetados pela LTD / LTP estimulação.
Figura 5. Experimentos realizados representante eletrofisiologia em fatias aguda de meia-idade (16 meses) APP/PS1 ratos e idade (22 meses) Fisher 344 ratos. Painéis de dados coletados de AB mostrar APP/PS1 camundongos tratados com um controle adeno-associados (AAV) viral construção (Control) ou um reagente AAV romance (Reagente A) que tem sido desenvolvido pelo nosso grupo de laboratório. Em relação à fatia de controle, a fatia tratados com Reagente A apresenta uma mudança acentuada para a esquerda na EPSP: FV curva (A) indicativo de maior força sináptica. A fatia Reagente-A-tratados também mostra LTP robusto e estável (B) após a entrega de dois 1 seg, 100 trens de estímulo Hz, enquanto a fatia de controle exibe LTP deficiente, típico deste modelo animal. Painéis DF dados mostram coletados a partir de duas individuais ratos idosos que receberam crônica (4 semanas) perfusões intrahippocampal de veículo ou de uma droga anti-inflammatory romance (droga A). Força sináptica basal foi relativamente pouco afetado pelo tratamento de drogas(D). No entanto, a droga A foi muito eficaz na prevenção da indução de LTD (E). Painéis C e F mostram representante EPSP waveforms gravado a partir de fatias individuais antes (pré) e 60 min após (pós) a entrega de LTP / LTD estimulação. Note-se que artefatos de estímulo não são mostradas.
Os passos descritos neste protocolo vai ajudar a garantir que dissecações do cérebro são realizadas pelo menos tão rapidamente e eficientemente em idosos, como em ratos adultos jovens. Nós também fornecemos detalhes suficientes para o iniciante a criarem a sua própria fatia estudos sobre LTP e LTD. Se uma maior exploração do envelhecimento e as mudanças AD em função sináptica e plasticidade é um dos seus objetivos, existem pelo menos duas outras questões metodológicas, aludido acima, que merecem análise mais aprofundada. Primeiro, vários laboratórios têm mostrado que o Ca 2 +: Mg2 + taxa em gravação ACSF pode ter um efeito marcante sobre a plasticidade sináptica indução em fatias do hipocampo 2,10,24,25. CSF em mamíferos, o Ca 2 +: Mg2 + taxa é de aproximadamente um (por exemplo, ver 26). No entanto, ACSF Ca 2 +: Mg2 + taxas mais próximas a 2 são comumente usados em estudos fatia de função sináptica e plasticidade. Nos primeiros estudos, esta prática foi provavelmente adaptado para otimizar a indução da LTP e, posteriormente tornou-se rotina para todos os estudos de plasticidade. No entanto, esta prática pode ser problemático em estudos de envelhecimento e AD por causa das diferenças bem caracterizadas em Ca 2 neuronal regulação +. Especificamente, Ca 2 + fluxo e / ou Ca 2 + induzida por Ca 2 +-lançamento é elevada em ratos idosos e / ou camundongos modelo AD durante a ativação neuronal 3,27-31. Indução de LTD é particularmente sensível a mudanças sutis na ACSF Ca 2 + níveis. Nosso protocolo, que usa 2mM Ca 2 + e 2 mM Mg2 +, geralmente resulta em LTD para idosos, mas não jovens animais adultos 2, enquanto que estudos usando um Ca 2 +: Mg2 + relação próxima dos dois, observaram LTD robusta em adultos no ausência de uma diferença de idade 2,10 ou em conjunto com LTD reduzidos em ratos de 32 anos. Estas observações evidenciam a necessidade de considerar cuidadosamente ACSF Ca 2 + e Mg 2 + quando se comparam os níveis de Ca 2 + dependentes de plasticidade em animais adultos idosos e jovens.
A segunda questão metodológica diz respeito à forte dependência da LTP na despolarização pós-sináptica 33 e possíveis envelhecimento / genótipo diferenças na força sináptica. Em um experimento de LTP típica, linha de base e LTP a intensidade do estímulo é geralmente ajustada para produzir uma meia máxima (ou três quartos máxima) amplitude EPSP. O problema potencial é que os ratos idosos e APP/PS1 ratos geralmente mostram redução da força sináptica em relação aos seus colegas mais jovens tipo e / ou selvagens, o que significa que os valores EPSP base também será menor em ratos idosos e APP/PS1 camundongos. EPSPs menores podem traduzir para menos despolarização durante a estimulação LTP, resultando em uma menor probabilidade de induzir LTP 33. Devido a isso confundir potencial, é difícil determinar se esses animais apresentam um déficit de transmissão, o déficit de plasticidade, ou ambos. Ou seja, mecanismos de indução de LTP em idade e / ou APP/PS1 ratos podem ser funcionalmente intacto (sem déficit de plasticidade), mas insuficientemente estimuladas (déficit throughput) nessas condições. Esta distinção é fundamental, como mecanismos de transferência e os mecanismos de plasticidade podem responder de forma muito diferente a um tratamento farmacológico específico. Tentamos minimizar o impacto da vazão reduzida na indução de LTP através da normalização da amplitude EPSP ao mesmo nível (por exemplo, 1 mV) em todas as fatias anterior à estimulação LTP. Outras estratégias podem ser eficazes, bem como (por exemplo, utilização de tensão ou pinça de corrente para igualar o potencial de membrana entre os grupos durante a estimulação LTP), e devem ser considerados quando se investiga LTP nestes modelos animais.
Trabalho apoiado pelo NIH conceder AG027297, um prêmio do Cabo de Kentucky e Confiança Spinal Injury Research cabeça, e um presente da Fundação Kleberg.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Nome do reagente | Companhia | Número de catálogo | |
NaCl | Pescador | BP358-1 | |
KCl | Pescador | BP366-500 | |
KH 2 PO 4 (monossódico) | Sigma | P5379-100G | |
MgSO 4 | Sigma | M2643-500G | |
CaCl 2 (di) | Sigma | C3306-250G | |
NaHCO 3 | Pescador | S233-500 | |
C 6 H 12 O 6 (dextrose) | Pescador | BP350-1 |
Reagentes tabela 1. Necessárias
Nome do equipamento | Companhia | Número de catálogo | Comentários |
Erlenmeyers | Pescador | FB-500-2000 FB-500-1000 | |
Aquarium Bubbler | Usado para oxigenar mídia. Disponíveis na maioria das lojas de animais | ||
50 copo de vidro mL | Pescador | 02-540g | Para storarge cérebro em ACSF |
Parafilm | Pescador | 13-374-10 | |
Guilhotina de Pequenos Animais | Mundial Precision Instruments (WPI) | DCAP-M | |
Toalha de papel plano | |||
# Feather lâmina cirúrgica 11 | Pescador | 08-916-5B | |
Beebee osso tesoura | Multa Ferramentas da Ciência (FST) | 16044-10 | |
Lempert Rongeurs | Roboz | RS-8321 | Use para ratos |
Friedman-Pearson Rongeurs | FST | 16020-14 | Use para camundongos ou ratos |
Ferramenta hipocampo | FST | 10099-15 | |
Colher | Uma colher de chá vai fazer plástica | ||
Espátula | Pescador | 21-401-25A | Espátula |
Cirúrgica da íris tesoura | FST | 14058-09 | |
plástico pipetas de transferência | Pescador | 13-711-43 | |
110 milímetros de papel de filtro Whatman | Pescador | 09-805E | Whatman cat. 1001-110 |
Placa de Petri de vidro | Pescador | ||
Leica VT1000P manual vibratório micrótomo | Vibratome | ||
Lâmina de 0,1 milímetros FA-10 Feather S | Ted Pella | 121-9 | Lâmina de 0,1 milímetros FA-10 Feather S |
Vidro borosilicato Pipetar Pasteur (com bulbo de borracha) | Pescador | 13-678-20A | Para a transferência de fatias: Dica está quebrado e calor polida para maior abertura |
35 prato de Cultura milímetros Polysterine | Corning | 430588 | Utilizado para a recolha de cortes após a dissecção |
Tabela 2. Ferramentas e materiais para dissecção
Equipamentos / materiais | Companhia | Comentários (opcional) |
Segurando câmara | Custom Built | |
P-97 Horizontal Pipetar Puller | Sutter Instrument Co. | |
Mesa de isolamento de vibração | Técnico Manufacturing Corporation (TMC) | |
Gaiola de Faraday | Personalizado construído | |
Pyrex Garrafa Aspirador com Sidearm Inferior (Produto # 1220-1E) | Corning | |
Gravidade contolled set IV com regulador (Produto # 2C8891) | Baxter | |
Linha de Aspiração Central | Disponível na maioria dos laboratórios modernos | |
95% O 2 / 5% CO 2 Gas Mix | Escocêst-Gross Co. | |
TygonTM tubulação Lab Para O 2 / CO 2 de entrega | Fisher Scientific | Não-tóxica, não-oxidantes, vem em uma variedade de tamanhos. |
Microscópio Eclipse E600FN | Nikon | com os objetivos de 10x e 40x, perto do filtro infared e GFP, DS-Red2 filtros |
Legal snap ES Câmera Digital | Fotométricos | Legal snap ES Câmera Digital |
X-Cite Iluminador Fluorescente | EXFO | X-Cite Iluminador Fluorescente |
Plataforma microscópio | Siskiyou | Personalizado montado |
RC-22 submersíveis de gravação da câmara (Produto # 64-0228) | Warner Instruments (WI) | Requer P-1 adaptador de plataforma e palco (Produto # 64-0277 De Warner) |
TC2BIP controlador de temperatura 2/3Ch | Microcontrols celular | TC2BIP controlador de temperatura 2/3Ch |
4 Axis manipulador Miniature manual | Siskiyou | |
Fio de platina Iridium (0,002 in) (Item # PTT0203) | WPI | |
A365 Isolator Stimulus | WPI | A365 Isolator Stimulus |
Multiclamp Amplificador 700B | Axon Instruments | |
Digidata 1322A conversor A / D | Axon Instruments | |
Software PClamp | Axon Instruments | |
Computador pessoal (Pentium 4) | Dell |
Tabela 3. Eletrofisiologia equipamentos e materiais
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