Method Article
Dieser Artikel beschreibt Verfahren zur Herstellung von Schnitten des Hippocampus von Ratten und transgenen Mäusen für die Untersuchung der synaptischen Veränderungen mit Gehirn Altern und altersbedingte neurodegenerative Erkrankungen wie Alzheimer-Krankheit.
Das Nagetier Hippocampus Scheibe Vorbereitung ist vielleicht die am weitesten verwendete Werkzeug zur Untersuchung von Säugetieren synaptische Funktion und Plastizität. Der Hippocampus kann schnell und einfach von Ratten und Mäusen gewonnen werden und Scheiben bleiben für Stunden in Sauerstoff künstlichen Liquor lebensfähig. Darüber hinaus werden grundlegende Techniken electrophysisologic leicht auf die Untersuchung der synaptischen Funktion im Hippocampus Scheiben aufgebracht und haben lieferte einige der besten Biomarker für kognitive Beeinträchtigungen. Der Hippocampus Scheibe ist besonders beliebt für das Studium der synaptischen Plastizität Mechanismen für Lernen und Gedächtnis beteiligt. Änderungen in der Induktion der Langzeit-Potenzierung und Depression (LTP und LTD) der synaptischen Wirksamkeit in Schnitten des Hippocampus (oder deren Fehlen) werden häufig verwendet, um den neurologischen Phänotyp der kognitiv-beeinträchtigten Tieren und / oder beschreiben die Wirkungsweise von bewerten nootropische Verbindungen. Dieser Artikel beschreibt die Verfahren verwenden wir für die Vorbereitung Schnitten des Hippocampus von Ratten und transgenen Mäusen für die Untersuchung der synaptischen Veränderungen mit Gehirn Altern und Alzheimer-Krankheit (AD) 1-3 verbunden. Verwenden von gealterten Ratten und AD-Modell Mäuse bieten eine einzigartige Reihe von Herausforderungen für Forscher daran gewöhnt, mit jüngeren Ratten und / oder Mäuse in ihrer Forschung. Aged Ratten haben dickere Schädel und härter Bindegewebe als jüngere Ratten und Mäusen, die Hirn-Extraktion und / oder Dissektion Verzögerung und damit zu negieren oder zu übertreiben wirkliche Alter-Unterschiede in der synaptischen Funktion und Plastizität können. Altern und Amyloid-Pathologie kann auch verschärfen Hippocampus Schaden während der Dissektion Verfahren nachhaltig, wieder verkompliziert keine Rückschlüsse aus physiologischen Beurteilung erstellt. Hier diskutieren wir die Schritte während der Dissektion Verfahren, um diese Probleme zu minimieren. Beispiele der synaptischen Antworten in "gesund" und "ungesund" Scheiben von Ratten und Mäusen gewonnen vorgesehen sind, sowie Vertreter der synaptischen Plastizität Experimente. Die möglichen Auswirkungen der anderen methodologischen Faktoren auf die synaptische Funktion in diesen Tiermodellen (zB Aufnahme-Lösungskomponenten, Stimulationsparameter) werden ebenfalls diskutiert. Während der Schwerpunkt dieses Artikels basiert auf der Verwendung von alten Ratten und transgenen Mäusen, Novizen auf die Physiologie Scheibe finden sollten detailliert genug hier, um auf ihre eigenen Studien zu beginnen, mit einer Vielzahl von Tiermodellen.
1. Vorbereitung Eiskalte Oxygeniertes Artificial Liquor (ACSF)
2. Brain-Removal-und Hippocampus Dissection in Aged (> 20-Monate alten Ratten-)
3. Brain-Removal-und Hippocampus Dissection in Aged transgenen Mäusen
4. § Hirngewebe in Scheiben mit einer Vibrating Mikrotom (Vibratom) und Transfer zum Aufnahmekammer *
5. Elicit und Record CA3-CA1 Synaptic Responses
6. Repräsentative Ergebnisse
Unsere Arbeit und die Arbeit von anderen Gruppen, legt nahe, dass Veränderungen in Astrozyten-basierte entzündlichen Signalisierung auslösen können und / oder zu beschleunigen neurologische Dysfunktion während des Alterns und AD 13,20,21. Vor kurzem haben wir synaptischen Stärke, LTP und LTD als Endpunkt Maßnahmen verwendet werden, um die Wirksamkeit und Wirkmechanismen von mehreren neuartigen anti-inflammatory Reagenzien in Mitte im Alter APP/PS1 Mäusen (siehe 22 für die Beschreibung dieses Modells) zu untersuchen und im Alter von Fischer 344 Ratten. Die Ergebnisse lieferten unten wurden unter Verwendung der Protokolle in diesem Artikel beschrieben.
Einer der neuen anti-inflammatory Adeno-assoziierte Viren (AAV) Reagenzien, die von unserem Labor entwickelt hat in Pilotstudien konnte gezeigt werden deutlich erhöhen synaptischen Stärke (p <0,05) und verhindern, dass LTP Defizite (p <0,05) in Mitte im Alter (16 Monate alt) APP/PS1 Mäusen (n = 4-6 Scheiben pro Behandlung Zustand). Vertreter synaptischen Stärke Kurven und LTP Experimente aus zwei verschiedenen Scheiben, collected aus dem gleichen 16-Monate alten APP/PS1 Maus, sind in Abbildung 5A-C gezeigt. Eine Scheibe wurde von der Hemisphäre mit unserem neuartigen AAV behandelt extrahiert (Reagenz A), während die andere Scheibe mit einer Kontrollgruppe AAV-Reagenz (Control) behandelt wurde. LTP wurde in beiden Scheiben mit zwei 1 sec Züge von 100 Hz Stimulation (10 sec intertrain Intervall) induziert. Beachten Sie, dass die synaptische Stärke-Kurve für das Reagenz A-behandelten Scheiben auf der linken Seite der Steuerung Scheibe, was auf höhere synaptische Stärke verschoben wird. Beachten Sie auch, dass typisch für Mitte im Alter APP/PS1 Mäuse, LTP schnell zerfallen zum Ausgangswert in der Kontrollgruppe Scheibe (zB 23). Umgekehrt zerfallen LTP wenig in die Scheibe mit unserem neuartigen Reagenz behandelt.
In einer zweiten Studie beobachteten wir signifikante LTD in Vehikel-behandelten Ratten im Alter (85% der pre-LTD Baseline, p <0,05). Im Gegensatz dazu war keine LTD in alten Ratten mit neuartigen anti-inflammatory "Drug A" (97% der pre-LTD Grundlinie, nicht signifikant) behandelten Patienten beobachtet. Kein Medikament Auswirkungen auf die synaptische Stärke beobachtet. Vertreter LTD Experimente aus diesem Datensatz (n = 8-10 Ratten pro Gruppe) sind in Abbildung 5D-F dargestellt.
Abbildung 1. Werkzeuge und Materialien für Gehirn Dissektion verwendet. A, Papiertuch. B, Skalpell. C, Beebee Schere. D-, Knochen-Rongeure (für Ratten). E-, Knochen-Rongeure (für Mäuse / Ratten). F, Plastiklöffel. G-, Kunststoff-Transferpipette. H, Hippocampus-Tool. I, Spachtel. J, chirurgische Scheren. K-, Glas-Petrischale.
Abbildung 2. Benutzerdefinierte Hirnschnitt Aufnahmekammer. A, macrochamber. B, Deckel. C, H 2 O-Reservoir mit perforierten Silikonschlauch. D, Mikrokammer. E, ACSF Zuführungsrohr (Polyethylen). F, O 2 Zuführungsrohr. G, Port für die Temperaturregelung. H, saldiert Mikrokammer einzufügen.
Abbildung 3. RC22 Versenkkammer. A, Recording Kammer. B, Ground-Elektrode. C, Aspiration Nadel.
Abbildung 4. Hippocampus Scheibe Illustration und extrazellulären Signalen. A, Cartoon einer transversalen Hippocampus Abschnitt in der Elektrophysiologie Experimente verwendet. CA = Ammonshorn. DG = Gyrus dentatus. SC = Schaffer-Kollateralen. S radiatum = Stratum radiatum. B, elektrische Stimulation des SC (a CA3 Axon-Darm-Trakt) ein Stimulus Artefakt hervorruft, folgte fast sofort durch einen präsynaptischen Bevölkerung spike oder Faser-Volley (FV). Die Amplitude der FV ist direkt proportional zu der Anzahl der SC-Fasern aktiviert. Die Steigung der negativen laufenden Phase des Feldes exzitatorischen postsynaptischen Potentials (EPSP) bezieht sich direkt auf die Aktivierung von depolarisierende synaptische Ströme in CA1 pyramidalen Neuronen in Reaktion auf Entlassung aus dem SC-Terminals Glutamat. C, Overlapping Vertreter extrazellulären Signalen in CA1 Stratum radiatum in Reaktion auf neun verschiedene Stimuluspegeln (3-50 uA) in eine "gesunde" (linkes Bild) aufgenommen, "ungesund" und "hypererregbarer" Scheibe. Fünf Kurven wurden pro Stufe gemittelt. Gesunde Scheiben reagieren dynamisch auf dieses Stimulus-Bereich und weisen eine einzige positive laufenden Bevölkerung spike (reflektierende CA1 neuronaler Entladung) auf den höheren Ebenen Reiz. In der RC22 Versenkkammer, maximal EPSPs typischerweise im Bereich von 1,5 bis 3 mV Amplitude. Ungesunde Scheiben (Mitte) zeigen oft eine große FV, aber eine kleine maximale EPSP (<1 mV) und in der Regel eine schlechte Plastizität. Hypererregbarer Scheiben (rechts) zeigen zwei oder mehr regenerative Bevölkerung Spikes in den aufsteigenden Teil des EPSP. Responses in hypererregbarer Scheiben sind oft labil und sind variabel LTD / LTP Stimulation beeinflusst.
Abbildung 5. Vertreter Elektrophysiologie Experimente an akuten Schnitten ab Mitte im Alter (16 mos) APP/PS1 Mäusen und Alter (22 mos) Fisher 344 Ratten durchgeführt. Panels AB zeigen Daten aus APP/PS1 Mäusen mit einer Kontrollgruppe Adeno-assoziierte (AAV) viral behandelt gesammelt Konstrukt (Control) oder eine neuartige AAV (Reagenz A), die von unserem Labor Gruppe entwickelt wurde. Bezogen auf die Kontrolle Scheibe, die Scheibe mit Reagenz behandelt A weist eine deutliche Linksverschiebung in der EPSP: FV-Kurve (A), was auf höhere synaptische Stärke. Das Reagenz-A-behandelten Scheibe zeigt auch robust und stabil LTP (B) nach der Lieferung von zwei 1 sec, 100 Hz Stimulus Züge, während die Kontrollgruppe Scheibe weist mangelhafte LTP, die typisch für dieses Tiermodell. Panels DF zeigen Daten aus zwei einzelnen alten Ratten, dass eine chronische (4 Wochen) intrahippocampal Perfusionen eines Fahrzeugs oder einer neuartigen anti-inflammatory Droge (Drug A) erhielt gesammelt. Basal synaptischen Stärke war relativ unbeeindruckt von medikamentösen Behandlung(D). Allerdings Drug A war sehr wirksam bei der Verhinderung der Induktion von LTD (E). Panels C und F zeigen repräsentative EPSP Wellenformen aus einzelnen Scheiben, bevor aufgezeichnet (pre) und 60 min nach (post) die Lieferung von LTP / LTD Stimulation. Beachten Sie, dass Stimulus Artefakte sind nicht dargestellt.
Die Schritte in diesem Protokoll beschriebenen hilft sicherzustellen, dass Gehirn Dissektionen out sind mindestens so schnell und effizient in Jahren durchgeführt, wie in jungen erwachsenen Ratten. Wir bieten auch ausreichend detailliert für den Anfänger für die Errichtung ihrer eigenen Slice Studien LTP und LTD. Wenn die weitere Erforschung des Alterns und AD Veränderungen der synaptischen Funktion und Plastizität ist eines Ihrer Ziele, gibt es mindestens zwei weitere methodische Fragen, oben angedeutet, dass weitere Beachtung verdienen. Zunächst in verschiedenen Laboren haben gezeigt, dass die Ca 2 +: Mg2 +-Verhältnis in der Aufnahme ACSF eine deutliche Wirkung auf die Induktion synaptischer Plastizität im Hippocampus Scheiben 2,10,24,25 können. In Säugetierzellen CSF, die Ca 2 +: Mg2 +-Verhältnis von rund eins (siehe zB 26). Allerdings ACSF Ca 2 +: Mg2 +-Verhältnisse näher zu 2 werden in der Regel in Scheiben Studien der synaptischen Funktion und Plastizität eingesetzt. In frühen Studien, diese Praxis wahrscheinlich wurde angepasst, um die Induktion von LTP zu optimieren, anschließend wurden zur Routine für alle Plastizität Studien. Allerdings kann diese Praxis in Alterungs-und AD-Studien problematisch, weil der gut charakterisierten Unterschiede in der neuronalen Ca 2 +-Regulation. Genauer gesagt, Ca 2 +-Einstrom und / oder Ca 2 +-induzierte Ca 2 +-Version ist in alten Ratten und / oder AD-Modell-Mäusen während der neuronalen Aktivierung 3,27-31 erhöht. Induktion von LTD ist besonders empfindlich auf subtile Veränderungen in ACSF Ca 2 +-Spiegel. Unser Protokoll, das 2 mM Ca 2 + und 2 mM Mg2 +, führt häufig zu LTD für ältere, nicht aber junge Tiere 2, während Studien mit einem Ca 2 + verwendet: Mg2 + Verhältnis näher bei zwei, haben robuste LTD bei Erwachsenen beobachtet in der Abwesenheit von einem Altersunterschied 2,10 oder in Verbindung mit reduzierten LTD in alten Ratten 32. Diese Beobachtungen unterstreichen die Notwendigkeit, sorgfältig zu prüfen, ACSF Ca 2 + und Mg2 +-Konzentrationen beim Vergleich Ca 2 +-abhängige Plastizität in alten und jungen erwachsenen Tieren.
Das zweite methodische Problem betrifft die starke Abhängigkeit von LTP auf postsynaptische Depolarisation 33 und die Alterung / Genotyp Unterschiede in der synaptischen Stärke. In einem typischen Experiment LTP, Baseline und LTP Stimulationsintensität ist in der Regel eingestellt, um eine halbmaximale (oder drei Viertel maximal) EPSP Amplitude zu erzeugen. Das mögliche Problem ist, dass im Alter von Ratten und Mäusen APP/PS1 zeigen meist synaptischen Stärke im Verhältnis zu ihren jüngeren und / oder Wildtyp-Gegenstücke reduziert, so dass Baseline EPSP Werte werden auch kleinere in alten Ratten und Mäusen APP/PS1. Kleinere EPSPs kann auf weniger Depolarisation während LTP Stimulation zu übersetzen, was zu einer verringerten Wahrscheinlichkeit für die Induktion LTP 33. Aufgrund dieser potenziellen verwechseln, ist es schwierig, festzustellen, ob diese Tiere einen Durchsatz Defizit, eine Plastizität Defizit oder beides aufweisen. Das heißt, LTP Induktion Mechanismen in Alter und / oder APP/PS1 Mäusen funktionell intakt (keine Plastizität Defizit), aber nicht ausreichend stimuliert (Durchsatz Defizit) unter diesen Bedingungen. Diese Unterscheidung ist wichtig, da die Mechanismen für den Durchsatz und Mechanismen für die Plastizität sehr unterschiedlich reagieren können, um eine spezifische pharmakologische Behandlung. Wir versuchen, die Auswirkungen eines geringeren Durchsatz auf LTP-Induktion durch die Normalisierung der EPSP Amplitude auf der gleichen Ebene (z. B. 1 mV) über alle Scheiben vor der LTP Stimulation zu minimieren. Andere Strategien können wirksam sein, als auch (zB Verwendung von Spannung oder Strom Klemme an das Membranpotential zwischen Gruppen auszugleichen während LTP-Stimulation), und sollte bei der Untersuchung von LTP in diesen Tiermodellen werden.
Arbeit unterstützt durch NIH AG027297, eine Auszeichnung von der Kentucky Spinal Cord und Head Injury Research Trust, und ein Geschenk der Kleberg Foundation.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Name des Reagenzes | Firma | Katalog-Nummer | |
NaCl | Fischer | BP358-1 | |
KCl | Fischer | BP366-500 | |
KH 2 PO 4 (einbasischen) | Sigma | P5379-100G | |
MgSO 4 | Sigma | M2643-500G | |
CaCl 2 (Dihydrat) | Sigma | C3306-250G | |
NaHCO 3 | Fischer | S233-500 | |
C 6 H 12 O 6 (Dextrose) | Fischer | BP350-1 |
Tabelle 1. Reagenzien erforderlich
Bezeichnung des Geräts | Firma | Katalog-Nummer | Kommentare |
Erlenmeyerkolben | Fischer | FB-500-2000 FB-500-1000 | |
Aquarium Bubbler | Wird für sauerstoffartig Medien. Erhältlich in den meisten Zoohandlungen | ||
50 ml Becherglas | Fischer | 02-540G | Für Gehirn storarge in ACSF |
Parafilm | Fischer | 13-374-10 | |
Small Animal Guillotine | World Precision Instruments (WPI) | DCAP-M | |
Flache Papiertuch | |||
Nr. 11 Feather Skalpell | Fischer | 08 bis 916-5B | |
Beebee Knochen Schere | Feine Science Tools (FST) | 16044-10 | |
Lempert Rongeure | Roboz | RS-8321 | Verwenden Sie für Ratten |
Friedman-Pearson Rongeure | FST | 16020-14 | Verwenden Sie für Mäuse oder Ratten |
Hippocampus-Tool | FST | 10099-15 | |
Löffel | Ein Kunststoff Teelöffel tun | ||
Spachtel | Fischer | 21 bis 401-25A | Spachtel |
Chirurgische Iris Schere | FST | 14058-09 | |
Kunststoff-Transfer Pipetten | Fischer | 13-711-43 | |
110mm Whatman Filterpapier | Fischer | 09-805E | Whatman Katze. 1001-110 |
Glas-Petrischale | Fischer | ||
Leica VT1000P Manuelle Vibrating Mikrotom | Vibratom | ||
0.1mm FA-10 Feather S Klinge | Ted Pella | 121-9 | 0.1mm FA-10 Feather S Klinge |
Borosilikatglas Pasteur-Pipette (mit Gummiball) | Fischer | 13 bis 678-20A | Für die Übertragung von Scheiben: Tip abgebrochen und Wärme-poliert für größere Öffnung |
35 mm Polysterine Kulturschale | Corning | 430588 | Wird für das Sammeln Scheiben nach der Sektion |
Tabelle 2. Werkzeuge und Materialien für die Präparation
Ausstattung / Werkstoffe | Firma | Kommentare (optional) |
Aufnahmekammer | Custom Built | |
P-97 Horizontal Pipette Puller | Sutter Instrument Co. | |
Schwingungsisolierung Tabelle | Technische Manufacturing Corporation (TMC) | |
Faraday-Käfig | Maßarbeit | |
Pyrex Aspirator Flasche mit Bottom Sidearm (Product # 1220-1L) | Corning | |
Gravity-kontrollierter IV Set mit Regler (Product # 2C8891) | Baxter | |
Zentrale Vakuum-Leitung | Erhältlich in den meisten modernen Labors | |
95% O 2 / 5% CO 2 Gas Mix | Schottet-Gross Co. | |
TygonTM Lab Schlauch Für O 2 / CO 2 Lieferung | Fisher Scientific | Nicht giftig, nicht oxidierenden, kommt in einer Vielzahl von Größen. |
Eclipse-E600FN Mikroskop | Nikon | mit 10x und 40x-Objektive, in der Nähe infared Filter und GFP, DS-Red2 Filter |
Coole Snap-ES Digital Camera | Photometrics | Coole Snap-ES Digital Camera |
X-Cite Fluorescent Illuminator | EXFO | X-Cite Fluorescent Illuminator |
Mikroskop-Plattform | Siskiyou | Benutzerdefinierte montiert |
RC-22 Submersible Aufnahme Kammer (Product # 64-0228) | Warner Instruments (WI) | Benötigt P-1-Plattform und Bühne Adapter (Product # 64-0277 Von Warner) |
TC2BIP 2/3Ch Temperaturregler | Zell Microcontrols | TC2BIP 2/3Ch Temperaturregler |
4-Achsen-Handbuch Miniature Manipulator | Siskiyou | |
Platinum Iridium-Draht (0,002 in) (Teil # PTT0203) | WPI | |
A365 Stimulus Isolator | WPI | A365 Stimulus Isolator |
Multiclamp 700b Verstärker | Axon Instruments | |
Digidata 1322a A / D-Wandler | Axon Instruments | |
PClamp Software | Axon Instruments | |
Personal Computer (Pentium 4) | Dell |
Tabelle 3. Elektrophysiologie Ausrüstung und Materialien
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