Методы выявления кашля и воспаления дыхательных путей у мышей

В этой статье мы описываем измерение кашля с помощью неинвазивной системы плетизмографии всего тела (WBP) в режиме реального времени, а также нормативные процедуры сбора образцов тканей мышей, а также представляем некоторые методы оценки воспаления дыхательных путей.

Хронический кашель, который длится более 8 недель, является одной из наиболее распространенных жалоб, требующих медицинской помощи, и пациенты страдают от огромного социально-экономического бремени и заметного снижения качества жизни. Животные модели могут имитировать сложную патофизиологию кашля и являются важными инструментами для исследований кашля. Выявление чувствительности к кашлю и воспаления дыхательных путей имеет большое значение для изучения сложного патологического механизма кашля. В этой статье описывается измерение кашля с помощью неинвазивной системы плетизмографии всего тела (WBP) в режиме реального времени, а также нормативные процедуры сбора образцов тканей (включая кровь, легкие, селезенку и трахею) мышей. В нем представлены некоторые методы оценки воспаления дыхательных путей, включая патологические изменения в окрашенных гематоксилином и эозином (HE) срезах легких и трахеи, концентрацию общего белка, концентрацию мочевой кислоты и активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в надосадочной жидкости бронхоальвеолярного лаважа (BALF), а также лейкоциты и дифференциальное количество клеток BALF. Эти методы воспроизводимы и служат ценным инструментом для изучения сложной патофизиологии кашля.

Кашель является важным защитным поведением для поддержания проходимости дыхательных путей и защиты легких от потенциально вредных веществ. Однако, когда кашель нарушается, он становится патологическим состоянием¹. Хронический кашель, обычно определяемый как длящийся восемь или более недель, является одним из наиболее частых симптомов, требующих медицинской помощи^. Поскольку хронический кашель часто сохраняется в течение многих лет, пациенты страдают от огромного социально-экономического бремени и заметного снижения^{качества жизни.} Хронический кашель широко рассматривается как синдром гиперчувствительности к кашлю и характеризуется неприятным кашлем, часто вызванным низким уровнем термического, механического или химического воздействия⁶. Возникновение гиперчувствительности к кашлю тесно связано с воспалением дыхательных путей⁷. Тем не менее, патофизиологические механизмы, лежащие в основе модуляции чувствительности к кашлю, нуждаются в дальнейшем выяснении.

Животные модели могут имитировать сложную патофизиологию кашля и являются важными инструментами для исследований кашля ^8,9. Предыдущие исследования показали, что вирусная инфекция, внутрилегочная инстилляция интерферона-γ (ИФН-γ), перфузия соляной кислоты в пищеводе, воздействие загрязняющих веществ, сигаретный дым и лимонная кислота могут вызвать кашель у животных 10,11,12,13,14,15,16,17. Для того, чтобы лучше оценить кашель и воспаление дыхательных путей, в этом исследовании была создана мышиная модель кашля с использованием нелетальной дозы вируса H1N1. Для выявления кашля были созданы некоторые клинические инструменты измерения кашля, включая субъективные и объективные методы¹⁸. К субъективным оценочным инструментам для оценки тяжести кашля в первую очередь относятся визуальная аналоговая шкала, оценка кашля, опросники качества жизни и т.д.^19,20. Однако их вряд ли можно использовать для оценки кашля у животных. Кроме того, кашель можно объективно оценить с помощью теста на кашель и мониторинга частоты кашля. Провокационный тест на кашель с использованием системы плетизмографии всего тела (WBP) является объективным методом, широко используемым в исследованиях на животных для измерения чувствительности к кашлю и выявления основных механизмов кашля^13,16. Основываясь на нейроанатомических характеристиках кашлевого рефлекса, лимонная кислота, капсаицин, аденозин-5'-трифосфат (АТФ), аллилизотиоцианат (АИТК) и медиатор воспаления брадикинин обычно используются в качестве кашлевых агентов для индуцирования кашля^21,22. Лимонная кислота является одним из самых ранних и широко используемых противокашлевых агентов, вызывающих кашлевые рефлексы, который был валидирован для измерения чувствительности к кашлю. Кроме того, воздействие лимонной кислотой обладает хорошей безопасностью, осуществимостью и переносимостью, и рекомендуется для оценки чувствительности кашлевого рефлекса в ответ на терапию кашля²³. Поэтому в данной статье будет описан метод измерения чувствительности к кашлю в ответ на лимонную кислоту у мышей с использованием неинвазивной системы WBP в режиме реального времени.

Для изучения патофизиологии кашля требуются тестовые образцы, в том числе образцы крови, жидкости бронхоальвеолярного лаважа (BALF), а также тканей легких и трахеи для подтверждения изменений уровней ключевых факторов²⁴. В настоящее время отсутствуют нормативные процедуры для сбора образцов тканей мышей, и в соответствующих исследованиях используются различные подходы, которые усложняют оценку воспаления дыхательных путей. Бронхоальвеолярный лаваж является важным методом оценки воспаления дыхательных путей при респираторных заболеваниях²⁵. Различные методы бронхоальвеолярного лаважа приведут к отсутствию сопоставимости между родственными исследованиями. Кроме того, различные методы бронхоальвеолярного лаважа оказывают воздействие на воспалительные клетки и воспалительные цитокины в БАЛЬФ. Поэтому в данной статье будет описано создание мышиной модели кашля с нелетальной дозой вируса H1N1, измерение кашля с помощью системы WBP, а также надежный, безопасный и очень успешный метод бронхоальвеолярного лаважа у мышей.

Все процедуры были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Гуанчжоуского медицинского университета (20240248) и выполнялись в строгом соответствии с утвержденными рекомендациями. В данном исследовании использовались мыши-самцы C57BL/6 без патогенов массой 20-25 г. Все мыши содержались при контролируемой температуре (22 ± 2 °C), влажности (50% ± 20%) и освещении (с 6:30 утра до 6:30 вечера) в клетках с твердым дном, где еда и вода были доступны в неограниченном количестве. Временная шкала протокола показана на рисунке 1.

1. Создание мышиной модели кашля

1. Используйте вирус гриппа A/California/7/2009 (H1N1). Определение смертельной дозы вируса H1N1 у мышей.
   1. Вкратце, обезболить мышей (n = 10 в группе) пентобарбиталом натрия (80 мг·^кг-1), а затем интраназально инфицировать серийно разведенным в 10 раз вирусом.
   2. Наблюдайте за смертью в течение 15 дней. Рассчитайте медианную смертельную дозу (ЛД₅₀) по методу Рида-Мюнха²⁶.
2. Заразите мышь вирусом H1N1.
   1. Растворите 0,8 x LD₅₀ вируса H1N1 в 50 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS).
   2. Обезболивайте мышей пентобарбиталом натрия (80 мг·^кг-1).
   3. Когда мыши будут глубоко обезболены, поместите мышь в положение лежа на спине ноздрями вверх.
   4. Закапывайте 5-10 мкл раствора вируса H1N1 или раствора PBS (в качестве контроля) интраназально в одну ноздрю мышей с помощью пипетки (рис. 2A).
   5. Затем зажмите рот мыши закрытым большим пальцем, чтобы ее нос сильно вдохнул, чтобы раствор вируса H1N1 в носовой полости полностью вдохнул его в легкие (Рисунок 2B).
   6. Повторите шаги 1.2.4 и 1.2.5 в другой носовой полости мышей.
   7. Когда весь вирус H1N1, приготовленный на этапе 1.2.1, будет интраназально введен в легкие мыши, поместите его в положение лежа на спине для отдыха (рисунок 2C).
3. Измерьте чувствительность мыши к кашлю после создания модели с помощью системы плетизмографии всего тела мелких животных Buxco. На 21-е сутки внутрибрюшинную анестезию мыши пентобарбиталом натрия (150 мг·^кг-1). Сбор и обработка тканей крови, селезенки, BALF, легких и трахеи (рисунок 1).

2. Измерение чувствительности к кашлю

1. Приготовьте лимонную кислоту (0,4 М): Поместите 0,1537 мг лимонной кислоты в центрифужную пробирку объемом 5 мл и добавьте обычный физиологический раствор до объема 2 мл.
2. Контрольно-измерительный контроль
   1. Проверьте каналы: Подключите камеры плетизмографа всего тела в соответствии с инструкциями производителя и нажмите кнопку калибровки - кнопка калибровки изменится с оранжевого на зеленый, указывая на успешное выполнение калибровки (рисунок 3A).
   2. Калибруем небулайзер:
      1. После подключения небулайзера добавьте в небулайзер 500 μL обычного физиологического раствора и нажмите кнопку распыления.
      2. Когда жидкость в небулайзере полностью распылится, нажмите кнопку распыления еще раз, чтобы увидеть мощность небулайзера, которая обычно составляет около 0,3 мл/мин. Нажмите кнопку распыления еще раз, чтобы принять текущее распыленное питание.
   3. После проверки каналов убедитесь, что значение ошибки составляет менее 0,5%.
3. Настройка параметров
   1. Нажмите «Создать новое исследование», выберите опцию «Кашель», выберите «Мышь» в разделе «Виды» и нажмите «Далее».
   2. Выберите параметры CCnt : установите продолжительность периода акклиматизации равной 1 минуте, время отклика — 10 минут, объем аэрозоля — 1 мл, а продолжительность доставки — 10 минут.
   3. Поместите находящуюся в сознании обездвиженную мышь в отдельные пластиковые прозрачные камеры для плетизмографа всего тела. Введите Weight и Subject ID мыши и нажмите Next.
   4. Добавьте 1 мл раствора лимонной кислоты (0,4 М) в небулайзер и наблюдайте за изменениями CCnt в режиме реального времени (рис. 3B).
   5. После того как лимонная кислота будет полностью использована, нажмите «Файл » и «Завершить сеанс », чтобы завершить эксперимент.

3. Забор крови, селезенки, BALF, легких и тканей трахеи мыши (Рисунок 4)

1. Соберите кровь.
   1. После обнаружения кашля обезболить мышь пентобарбиталом натрия (150 мг·^кг-1) путем внутрибрюшинного введения. Соберите кровь с орбит мыши, находящейся под глубоким наркозом. Смешайте 1 мл крови с 0,1 мл антикоагулянтного буфера (9,9 мг/мл гепарина натрия, растворенного в PBS) при 4 °C (рис. 4A).
   2. Встряхните пробирку для сбора крови, чтобы полностью смешать кровь и антикоагулянт для предотвращения свертывания крови.
   3. Собранную кровь центрифугируют при концентрации 800 x g в течение 5 мин при 4 °C. Соберите надосадочную жидкость, храните ее при температуре -80 °C (используется для измерения цитокинов) и повторно суспендируйте гранулу в 1 мл раствора D-Hank. Распределите 10 мкл суспензии клеток крови на предметном стекле, чтобы определить профили клеток.
2. Соберите урожай из селезенки.
   1. Откройте грудную клетку мыши, соберите кровь и обескровливайте через артерию (Рисунок 4B).
   2. Удалите левое ушное предсердие, а затем перфузируйте легочный и системный кровоток 5 мл нормального физиологического раствора (рис. 4C, D). Удалите всю селезенку из мыши с помощью хирургических щипцов (рисунок 4E).
   3. Измерив вес селезенки, разрежьте ее на две половинки. Зафиксируйте первую половину с 4% параформальдегидом при комнатной температуре (RT) для гистопатологического анализа. Вторую половину хранить при температуре -80 °C для измерения цитокинов.
3. Бронхоальвеолярный лаваж
   1. Сделайте трубку для бронхоальвеолярного лаважа с помощью пипетки Пастера. Нагрейте пипетку Пастера с помощью спиртовой лампы. Когда он станет мягким, удлините его, чтобы получилась тонкая трубка. Длина трубки бронхоальвеолярного лаважа составляет 5 см. Верхний диаметр составляет 5 мм, а нижний диаметр – 1 мм (Рисунок 5).
   2. Для сбора BALF отделите правое легкое путем лигирования в правом главном бронхе. Соберите BALF из левого легкого путем трехкратного промывания 0,5 мл PBS, предварительно охлажденного на льду. Коэффициент извлечения BALF составляет более 80% (рисунок 4F).
   3. Собранный BALF центрифугирует при 800 x g в течение 5 мин при 4 °C. Соберите надосадочную жидкость и измерьте общую концентрацию белка, концентрацию мочевой кислоты, активность ЛДГ и концентрацию цитокинов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Маркеры воспаления, включая концентрацию общего белка, концентрацию мочевой кислоты и активность ЛДГ в надосадочной жидкости BALF, обнаруживают с помощью набора для анализа в соответствии с рекомендациями производителя²⁴.
   4. Повторно суспендируйте гранулу в 200 мкл PBS и подсчитайте лейкоциты в BALF с помощью счетного стекла.
   5. Чтобы определить профили клеток по дифференциальному подсчету, нанесите 50 мкл клеточной суспензии на предметное стекло и дайте ей высохнуть.
   6. Зафиксируйте предметное стекло 4% параформальдегидом на ночь, а затем закрасьте гематоксилин-эозином (HE). Классифицируйте не менее 400 клеток на нейтрофилы, макрофаги, лимфоциты или эозинофилы на предметное стекло.
4. Забор тканей легких и трахеи для гистопатологического анализа
   1. После сбора BALF удалите и зафиксируйте половину правого легкого (Рисунок 4G) и трахеи (Рисунок 4H) с 4% параформальдегидом в ЛТ для гистопатологического анализа. Храните вторую половину при температуре -80 °C для вестерн-блоттинга, количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (qPCR) и иммуноферментного анализа (ИФА).

На рисунке 6 представлены репрезентативные изображения патологических изменений в легких, окрашенных ПЭ (рисунок 6A, B), трахее (рисунок 6C, D) и селезенке (рисунок 6E, F). Инфекция, вызванная вирусом H1N1, привела к воспалительным изменениям в легких мышей, включая отек и инфильтрацию многих лимфоцитов и нейтрофилов. Инфекция, вызванная вирусом H1N1, также вызвала воспалительные изменения в трахеях мышей, включая выделение ресничек и воспалительные инфильтрации клеток (большое количество лимфоцитов и небольшое количество нейтрофилов). Кроме того, инфекция также значительно увеличила отношение площади белой пульпы ко всей площади селезенки мышей. Лимфоциты накапливаются в белой пульпе селезенки. Эта стандартизированная процедура сбора образцов тканей позволяет лучше оценить воспаление дыхательных путей.

Рисунок 1: Протокол создания мышиной модели кашля. Мышей анестезировали пентобарбиталом натрия и интраназально закапывали 0,8 x LD₅₀ вируса H1N1, растворенного в 50 мкл PBS один раз в 0-й день. Измерение кашля проводилось на 20-й день, а мышей приносили в жертву на следующий день. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Интраназальная инстилляция вируса H1N1. (A) Интраназальная инстилляция 0,8 x LD50 вируса H1N1 в 50 μл PBS. (В) Зажав рот мыши закрытым большим пальцем. (В) Размещение мышей в положении лежа на спине. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Измерение чувствительности к кашлю. (A) Оборудование для обнаружения кашля у мышей и (B) Кривая кашлевого рефлекса. Количество случаев кашля в ответ на распыленный раствор лимонной кислоты (0,4 М) определяли с помощью системы плетизмографии всего тела (WBP) после моделирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Репрезентативные изображения забора крови мыши, селезенки, BALF, легких и трахеи. (A) забор крови, (B) вскрытие грудной клетки, (C) отрезание левого предсердия, (D) перфузия в легочном кровообращении, (E) забор селезенки, (F) бронхоальвеолярный лаваж и (G) забор доли легкого и (H) трахея для гистопатологического анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5: Спецификация трубки для бронхоальвеолярного лаважа. Длина трубки бронхоальвеолярного лаважа составляет 5 см. Верхний диаметр составляет 5 мм, а нижний диаметр - 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Влияние вируса H1N1 на патологические изменения в легких, трахее и селезенке мыши. (A,B) Репрезентативные цифры патологических изменений в окрашенных HE срезах легких из контрольной группы (A) и (B) H1N1. Символ «↑» обозначает инфильтрацию лимфоцитов (красный) и нейтрофилов (синий). Масштабные линейки: 50 мкм. (C,D) Репрезентативные цифры патологических изменений в окрашенных HE срезах трахеи из групп (C) контроля и (D) H1N1. Символ «↑» обозначает инфильтрацию лимфоцитов (красный) и нейтрофилов (синий). Масштабные линейки: 20 мкм. (E,F) Репрезентативные цифры патологических изменений в окрашенных HE срезах селезенки из контрольной группы (E) и группы (F) H1N1. Символом «↑» обозначена белая мякоть (зеленая). Масштабные линейки: 500 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Некоторые хронические рефрактерные и постинфекционные кашель являются распространенными состояниями, связанными с респираторной вирусной инфекцией²⁷. Для того, чтобы лучше оценить чувствительность к кашлю и воспаление дыхательных путей, в этом исследовании была создана мышиная модель кашля с использованием вируса H1N1. Подходящие модели кашля у мышей должны быть выбраны для других исследований в соответствии с целью исследования. В большинстве предыдущих исследований морская свинка использовалась в качестве животной модели в механистических исследованиях или новых испытаниях лекарств от кашля 28,29,30. Недавние исследования показали, что мышей можно использовать для оценки патофизиологии кашля благодаря их более короткому репродуктивному циклу, большему количеству реагентов и готовности к генетическим манипуляциям, несмотря на то, что их поведение при кашле все еще обсуждается^. В этом исследовании лимонная кислота использовалась в качестве противоборствующего средства для вызывания кашля. Механизмы кашлевого рефлекса, индуцированного лимонной кислотой, могут быть связаны с активацией яремных С-волокон и нодозированных Аδ-волокон³². Кроме того, система WBP измеряет изменения кашлевого рефлекса у мышей неинвазивным способом и сводит к минимуму последствия психологического стресса. Влияние внешней среды на мышей должно быть сведено к минимуму при выявлении чувствительности к кашлю. Мышь следует поместить в помещение для тестирования, а затем накрыть полиэтиленовым пакетом, чтобы уменьшить раздражение, вызванное внешней средой.

В этом исследовании подробно описаны нормативные процедуры забора тканей крови, селезенки, BALF, легких и трахеи мышей, а также представлены некоторые измерения для оценки воспаления дыхательных путей. Для выявления воспаления дыхательных путей срезы легких и трахеи окрашивают гематоксилином и эозином для оценки общей гистопатологии²⁴. Повышенная концентрация общего белка и мочевой кислоты в надосадочной жидкости BALF связана с воспалением и повреждением клеток дыхательных путей³³. Активность ЛДГ в надосадочной жидкости BALF отражает повреждение клеток и некроз³⁴. Лейкоциты в БАЛЬФ и крови могут отражать степень воспаления заболевания³⁵. Дифференциальное количество клеток BALF широко используется для оценки воспаления дыхательных путей при хронических заболеваниях дыхательных путей и предоставляет важную информацию для изучения патогенеза, постановки диагнозов и стратегий ведения хронических^{респираторных заболеваний}.

Ограничение этого эксперимента заключается в том, что сбор большого количества образцов тканей заставляет мышей работать в течение длительного времени, что может повлиять на активность образцов тканей. Поэтому образцы тканей мышей нужно помещать на лед сразу после сбора. Кроме того, трубка для бронхоальвеолярного лаважа, используемая в этом исследовании, подходит для мышей, но не для более крупных животных.

Подводя итог, мы приводим подробное описание методов обнаружения кашля и воспаления дыхательных путей у мышей. Эти методы предоставляют исследователям инструменты для изучения сложной патофизиологии кашля.

Авторам нечего раскрывать.

Эта работа была поддержана Проектом планирования науки и технологий в Гуанчжоу (202002030151), Крупным проектом Гуанчжоуской национальной лаборатории (GZNL2024A02001) и грантом Государственной ключевой лаборатории респираторных заболеваний (SKLRD-Z-202202).