שיטות לאיתור שיעול ודלקת בדרכי הנשימה בעכברים

כאן, אנו מתארים את מדידת השיעול באמצעות מערכת פלטיסמוגרפיה לא פולשנית ובזמן אמת של כל הגוף (WBP) ואת ההליכים הנורמטיביים לקצירת דגימות רקמה של עכברים ומציגים כמה שיטות להערכת דלקת בדרכי הנשימה.

שיעול כרוני, הנמשך למעלה מ-8 שבועות, הוא אחת התלונות השכיחות ביותר הדורשות טיפול רפואי, והחולים סובלים מנטל סוציו-אקונומי עצום ומירידה ניכרת באיכות החיים. מודלים של בעלי חיים יכולים לחקות את הפתופיזיולוגיה המורכבת של השיעול והם כלים חשובים לחקר שיעול. לגילוי רגישות לשיעול ודלקת בדרכי הנשימה יש משמעות רבה לחקר המנגנון הפתולוגי המורכב של שיעול. מאמר זה מתאר את מדידת השיעול באמצעות מערכת פלטיסמוגרפיה לא פולשנית ובזמן אמת של כל הגוף (WBP) ואת ההליכים הנורמטיביים לאיסוף דגימות רקמה (כולל דם, ריאות, טחול וקנה נשימה) של עכברים. הוא מציג מספר שיטות להערכת דלקת בדרכי הנשימה, כולל שינויים פתולוגיים במקטעי ריאות וקנה נשימה מוכתמים בהמטוקסילין ובאוזין (HE), ריכוז החלבון הכולל, ריכוז חומצת השתן ופעילות דהידרוגנאז לקטט (LDH) בסופרנאטנט של נוזל שטיפה ברונכואלבאולרי (BALF), ולויקוציטים וספירות תאים דיפרנציאליות של BALF. שיטות אלה ניתנות לשחזור ומשמשות כלים יקרי ערך לחקר הפתופיזיולוגיה המורכבת של שיעול.

שיעול הוא התנהגות הגנה חשובה כדי לשמור על פטנט דרכי הנשימה ולהגן על הריאות מפני חומרים מזיקים פוטנציאליים. עם זאת, כאשר dysregulated, שיעול הופך למצב פתולוגי¹. שיעול כרוני, המוגדר בדרך כלל כנמשך שמונה שבועות או יותר, הוא אחד הסימפטומים השכיחים ביותר הדורשים טיפול רפואי². מכיוון ששיעול כרוני נמשך לעתים קרובות במשך שנים, החולים סובלים מנטל סוציו-אקונומי עצום ומירידה ניכרת באיכות החיים ^3,4,5. שיעול כרוני נחשב לתסמונת רגישות יתר לשיעול ומאופיין בשיעול מטריד המופעל לעתים קרובות על ידי רמות נמוכות של חשיפה תרמית, מכנית או כימית⁶. המופע של רגישות יתר לשיעול קשור קשר הדוק לדלקת בדרכי הנשימה⁷. עם זאת, יש להבהיר עוד יותר את המנגנונים הפתופיזיולוגיים העומדים בבסיס אפנון הרגישות לשיעול.

מודלים של בעלי חיים יכולים לחקות את הפתופיזיולוגיה המורכבת של השיעול והם כלים חשובים לחקר שיעול ^8,9. מחקרים קודמים מצאו כי זיהום ויראלי, החדרת אינטרפרון-γ תוך ריאתי (IFN-γ), זילוח הוושט של חומצה הידרוכלורית, חשיפה למזהמים, עשן סיגריות וחומצת לימון יכולים לגרום לשיעול בבעלי חיים 10,11,12,13,14,15,16,17. על מנת להעריך טוב יותר שיעול ודלקת בדרכי הנשימה, מודל עכבר של שיעול נקבע באמצעות מינון לא קטלני של וירוס H1N1 במחקר זה. לגילוי שיעול נקבעו באופן קליני כמה כלים למדידת שיעול, כולל שיטות סובייקטיביות ואובייקטיביות¹⁸. כלי ההערכה הסובייקטיבית להערכת חומרת השיעול כוללים בעיקר סולם אנלוגי חזותי, ציון שיעול, שאלוני איכות חיים וכו^'19,20. עם זאת, הם לא צפויים לשמש להערכת שיעול אצל בעלי חיים. בנוסף, שיעול ניתן להעריך באופן אובייקטיבי באמצעות בדיקת אתגר שיעול וניטור תדירות שיעול. מבחן אתגר השיעול באמצעות מערכת פלטיסמוגרפיה של כל הגוף (WBP) היא שיטה אובייקטיבית הנמצאת בשימוש נרחב במחקרים בבעלי חיים כדי למדוד רגישות לשיעול ולחשוף את המנגנונים הבסיסיים של שיעול^13,16. בהתבסס על המאפיינים הנוירו-אנטומיים של רפלקס השיעול, חומצה ציטרית, קפסאיצין, אדנוזין 5'-טריפוספט (ATP), אליל איזותיוציאנט (AITC), וברדיקנין מתווך דלקתי משמשים בדרך כלל כסוכנים הטוסיביים לגרימת שיעול^21,22. חומצת לימון היא אחד החומרים המוקדמים והנפוצים ביותר המעוררים רפלקסים לשיעול, אשר אומת למדידת רגישות לשיעול. חוץ מזה, לאתגר חומצת הלימון יש בטיחות, היתכנות וסבילות טובות והוא מוצע להעריך רגישות לרפלקס שיעול בתגובה לטיפולים בשיעול²³. לכן, מאמר זה יתאר את השיטה למדידת רגישות לשיעול בתגובה לחומצת לימון בעכברים באמצעות מערכת WBP לא פולשנית בזמן אמת.

המחקרים על הפתופיזיולוגיה של שיעול דורשים דגימות בדיקה, כולל דגימות מהדם, נוזל שטיפה ברונכואלבאולרי (BALF), ורקמות ריאה וקנה הנשימה כדי לאמת שינויים ברמות של גורמי מפתח²⁴. כיום, חסרים נהלים נורמטיביים לקצירת דגימות רקמה של עכברים, ומחקרים קשורים משתמשים בגישות שונות המסבכות את הערכת דלקת דרכי הנשימה. שטיפת סימפונות היא שיטה חשובה להערכת דלקת בדרכי הנשימה במחלות נשימה²⁵. שיטות שונות של שטיפה bronchoalveolar יוביל חוסר השוואה בין מחקרים קשורים. יתר על כן, שיטות שונות לשטיפת סימפונות משפיעות על תאים דלקתיים וציטוקינים דלקתיים ב- BALF. לכן, מאמר זה יתאר את הקמתו של מודל עכבר של שיעול עם מינון לא קטלני של וירוס H1N1, מדידת שיעול באמצעות מערכת WBP, ושיטת שטיפה סימפונות, בטוחה ומוצלחת מאוד של עכברים.

כל ההליכים אושרו על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של האוניברסיטה הרפואית גואנגזו (20240248) ובוצעו בהתאמה קפדנית להנחיות שאושרו. במחקר זה נעשה שימוש בעכברי C57BL/6 ספציפיים לזכרים במשקל 20-25 גרם. כל העכברים שוכנו תחת טמפרטורה מבוקרת (22 ± 2 מעלות צלזיוס), לחות (50% ± 20%) ותאורה (6:30 בבוקר עד 18:30 בערב) בכלובים תחתונים מוצקים עם מזון ומים זמינים עד לליביטום. ציר הזמן של הפרוטוקול מוצג באיור 1.

1. הקמת מודל עכבר לשיעול

1. השתמש בנגיף שפעת A/California/7/2009 (H1N1). לקבוע את המינון הקטלני של וירוס H1N1 בעכברים.
   1. בקצרה, להרדים עכברים (n = 10 לכל קבוצה) עם נתרן pentobarbital (80 מ"ג^·kg-1) ולאחר מכן להדביק intranasally עם וירוס מדולל סדרתי פי 10.
   2. עקוב אחר המוות במשך תקופה של 15 ימים. חשב את המינון הקטלני החציוני (LD₅₀) בשיטת ריד-מונץ'²⁶.
2. להדביק את העכבר עם וירוס H1N1.
   1. להמיס 0.8 x LD₅₀ של וירוס H1N1 ב 50 μL של מלוחים חוצצים פוספט (PBS).
   2. מרדימים את העכברים עם נתרן pentobarbital (80 מ"ג^·kg-1).
   3. כאשר העכברים היו מורדמים עמוק, הניחו את העכבר במצב שכיבה כאשר הנחיריים פונים כלפי מעלה.
   4. להחדיר 5-10 μL של תמיסת וירוס H1N1 או תמיסת PBS (כבקרה) תוך אפית לתוך נחיר אחד של עכברים באמצעות פיפטה (איור 2A).
   5. לאחר מכן, החזיקו את פיו של העכבר סגור עם האגודל כדי לגרום לאפו לשאוף חזק כך שתמיסת וירוס H1N1 בחלל האף תישאף לחלוטין לתוך הריאות (איור 2B).
   6. חזור על שלבים 1.2.4 ו- 1.2.5 בחלל האף השני של העכברים.
   7. כאשר כל וירוס H1N1 שהוכן בשלב 1.2.1 מוחדר דרך האף לריאות העכבר, הניחו אותו במצב שכיבה למנוחה (איור 2C).
3. מדוד את הרגישות לשיעול של העכבר לאחר הקמת המודל באמצעות מערכת הפלטיסמוגרפיה של כל הגוף של Buxco Small Animal . ביום 21, intraperitoneally להרדים את העכבר עם נתרן pentobarbital (150 מ"ג^·kg-1). לאסוף ולעבד רקמות דם, טחול, BALF, ריאות וקנה הנשימה (איור 1).

2. מדידת הרגישות לשיעול

1. הכינו חומצת לימון (0.4 מ'): הכניסו 0.1537 מ"ג חומצת לימון לצינור צנטריפוגה בנפח 5 מ"ל והוסיפו מי מלח רגילים לנפח של 2 מ"ל.
2. בדיקת מכשירים
   1. בדקו את הערוצים: חברו את תאי הפלטיסמוגרף של כל הגוף בהתאם להוראות היצרן ולחצו על כפתור הכיול – כפתור הכיול משתנה מכתום לירוק, מה שמעיד על כך שהכיול מוצלח (איור 3A).
   2. כיול הנבולייזר:
      1. לאחר חיבור נבולייזר, להוסיף 500 μL של מלוחים רגילים לתוך נבולייזר ולחץ על כפתור nebulization.
      2. כאשר הנוזל בנבולייזר מרוסס לחלוטין, לחץ שוב על לחצן הנבולייזר כדי לראות את עוצמת הנבולייזר, שהיא בדרך כלל כ- 0.3 מ"ל לדקה. לחץ שוב על לחצן הערפיליזציה כדי לקבל את צריכת החשמל הנוכחית של ערפיליזציה.
   3. לאחר בדיקת הערוצים, ודא שערך השגיאה נמוך מ- 0.5%.
3. הגדרת פרמטרים
   1. לחצו על 'צור מחקר חדש', בחרו באפשרות 'שיעול ', בחרו 'עכבר במינים' ולחצו על 'הבא'.
   2. בחר את הפרמטרים של CCnt : הגדר את משך תקופת ההתאקלמות לדקה אחת, את זמן התגובה ל- 10 דקות, את נפח התרסיס ל- 1 מ"ל ואת משך האספקה ל- 10 דקות.
   3. הניחו עכבר מודע וחסר רסן בתאי פלסטיק בודדים שקופים לכל הגוף. הזן את מזהה המשקל והנושא של העכבר ולחץ על הבא.
   4. הוסיפו 1 מ"ל של תמיסת חומצת לימון (0.4 M) לנבולייזר וצפו בשינויים בזמן אמת ב-CCnt (איור 3B).
   5. לאחר שימוש מלא בחומצת לימון, לחץ על קובץ וסיים הפעלה כדי להשלים את הניסוי.

3. קצירת דם, טחול, BALF, ריאות ורקמות קנה הנשימה של עכברים (איור 4)

1. לאסוף דם.
   1. לאחר זיהוי שיעול, להרדים את העכבר עם נתרן pentobarbital (150 מ"ג·^kg-1) על ידי הזרקה intraperitoneal. לאסוף דם מהמסלולים של העכבר מורדם עמוק. יש לערבב 1 מ"ל דם ב-0.1 מ"ל של מאגר נוגד קרישה (9.9 מ"ג/מ"ל הפרין נתרן מומס ב-PBS) ב-4°C (איור 4A).
   2. נערו את צינור איסוף הדם כדי לערבב באופן מלא את הדם ואת נוגדי הקרישה כדי למנוע קרישת דם.
   3. צנטריפוגה הדם שנאסף ב 800 x גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (75 °F). אספו את הסופרנאטנט, אחסנו אותו בטמפרטורה של -80°C (המשמש למדידת ציטוקינים), והשהו מחדש את הגלולה ב-1 מ"ל של תמיסת D-Hank. יש לפזר 10 μL של תרחיף תאי הדם על מגלשת הזכוכית כדי לקבוע את פרופילי התא.
2. קוצרים את הטחול.
   1. פתחו את חזהו של העכבר, אספו את הדם ויצאו דרך העורק (איור 4B).
   2. הסר את האוריקל השמאלי ולאחר מכן נקב את מחזור הדם הריאתי והמערכתי עם 5 מ"ל של מי מלח רגילים (איור 4C, D). הוציאו את כל הטחול מהעכבר באמצעות מלקחיים כירורגיים (איור 4E).
   3. לאחר מדידת משקל הטחול, לחתוך אותו לשני חצאים. תקן את המחצית הראשונה עם 4% paraformaldehyde בטמפרטורת החדר (RT) לניתוח היסטופתולוגי. אחסנו את המחצית השנייה בטמפרטורה של -80°C למדידת ציטוקינים.
3. שטיפה ברונכואלבאולרית
   1. הפוך את צינור שטיפה bronchoalveolar באמצעות pipet פסטר. מחממים את פיפטת פסטר באמצעות מנורת אלכוהול. כאשר הוא הופך רך, להאריך אותו כדי ליצור צינור דק. אורך צינור שטיפת bronchoalveolar הוא 5 ס"מ. הקוטר העליון הוא 5 מ"מ, והקוטר התחתון הוא 1 מ"מ (איור 5).
   2. לאיסוף BALF, יש להפריד את הריאה הימנית על ידי קשירה בסימפונות הראשיים הימניים. אספו את ה-BALF מהריאות השמאליות על ידי שטיפה שלוש פעמים עם 0.5 מ"ל של PBS מקורר מראש על קרח. יחס ההתאוששות של BALF הוא יותר מ-80% (איור 4F).
   3. צנטריפוגה BALF שנאסף ב 800 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. אספו את הסופרנאטנט ומדדו את ריכוז החלבון הכולל, ריכוז חומצת השתן, פעילות LDH וריכוזי הציטוקינים.
      הערה: הסמנים הדלקתיים, כולל ריכוז החלבון הכולל, ריכוז חומצת השתן ופעילות ה-LDH בסופרנטנט BALF, מזוהים באמצעות ערכת הבדיקה בהתאם להנחיות היצרן²⁴.
   4. להשעות מחדש את הגלולה ב 200 μL של PBS, ולספור את leukocytes ב BALF בעזרת שקופית ספירה.
   5. כדי לקבוע פרופילי תאים על ידי ספירות דיפרנציאליות, מרחו 50 μL של תרחיף התא על מגלשות הזכוכית ואפשרו לו להתייבש.
   6. תקן את השקופית עם 4% paraformaldehyde במשך הלילה, ולאחר מכן הכתים עם hematoxylin-eosin (HE). לסווג לפחות 400 תאים לנויטרופילים, מקרופאגים, לימפוציטים או אאוזינופילים בכל שקופית.
4. קצירת רקמות הריאה וקנה הנשימה לניתוח היסטופתולוגי
   1. לאחר איסוף BALF, יש להסיר ולתקן מחצית מהריאה הימנית (איור 4G) וקנה הנשימה (איור 4H) עם 4% פרפורמלדהיד ב-RT לצורך ניתוח היסטופתולוגי. אחסנו את החצי השני בטמפרטורה של -80°C עבור כתם מערבי, תגובת שרשרת כמותית בזמן אמת של פולימראז (qPCR) ובדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים (ELISA).

איור 6 מראה תמונות מייצגות של שינויים פתולוגיים בריאה מוכתמת ב-HE, קנה הנשימה (איור 6C,D) והטחול (איור 6E,F). זיהום בנגיף H1N1 גרם לשינויים דלקתיים בריאות עכברים, כולל בצקת ולימפוציטים רבים וחדירת נויטרופילים. זיהום בנגיף H1N1 גרם גם לשינויים דלקתיים בקנה הנשימה של עכברים, כולל השלת ריסונים וחדירת תאים דלקתיים (לימפוציטים רבים ומספר קטן של נויטרופילים). בנוסף, הזיהום גם הגדיל באופן משמעותי את היחס בין אזור מוך הלבן לכל אזור הטחול של עכברים. לימפוציטים מצטברים בעיסת הטחול הלבנה. הליך סטנדרטי זה לאיסוף דגימות רקמה יכול להעריך טוב יותר דלקת בדרכי הנשימה.

איור 1: פרוטוקול לביסוס מודל עכברי של שיעול. עכברים הורדמו עם נתרן pentobarbital והוחדר תוך אפית עם 0.8 x LD₅₀ של וירוס H1N1 מומס 50 μL של PBS פעם אחת ביום 0. מדידת שיעול בוצעה ביום ה-20, ועכברים הוקרבו למחרת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: החדרה תוך-אפית של נגיף H1N1. (A) החדרה תוך אפית של 0.8 x LD50 של וירוס H1N1 ב-50 מיקרוליטר של PBS. (B) החזקת פיו של העכבר סגור באמצעות האגודל. (C) הנחת העכברים במצב שכיבה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: מדידת רגישות לשיעול. (A) ציוד לזיהוי שיעול עכבר ו-(B) עקומת רפלקס שיעול. מספר אירועי השיעול בתגובה לתמיסת חומצת לימון ערפילית (0.4 M) זוהה באמצעות מערכת הפלטיסמוגרפיה של כל הגוף (WBP) לאחר מידול. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: תמונות מייצגות של קצירת הדם, הטחול, BALF, הריאה וקנה הנשימה של העכבר. (A) איסוף דם, (B) פתיחת בית החזה, (C) חיתוך האוריקל השמאלי, (D) זילוח של מחזור הדם הריאתי, (E) קצירת הטחול, (F) שטיפה ברונכואלבאולרית, ו-(G) קצירת אונת הריאה ו-(H) קנה הנשימה לצורך ניתוח היסטופתולוגי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: מפרט צינור שטיפה ברונכואלבאולרי. אורך צינור שטיפת bronchoalveolar הוא 5 ס"מ. הקוטר העליון הוא 5 מ"מ, והקוטר התחתון הוא 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: השפעות נגיף H1N1 על שינויים פתולוגיים בריאה, בקנה הנשימה ובטחול של עכבר. (A,B) נתונים מייצגים של שינויים פתולוגיים במקטעי ריאה מוכתמים ב-HE, מקבוצות הבקרה (A) ו-(B) H1N1. הסמל של "" (") מציין חדירה של לימפוציטים (אדום) ונויטרופילים (כחול). פסי קנה מידה: 50 מיקרומטר. (C,D) נתונים מייצגים של שינויים פתולוגיים בקטעי קנה הנשימה המוכתמים ב-HE, מקבוצת הבקרה (C) ו-(D) H1N1. הסמל של "" (") מציין חדירה של לימפוציטים (אדום) ונויטרופילים (כחול). פסי קנה מידה: 20 מיקרומטר. (E,F) נתונים מייצגים של שינויים פתולוגיים בקטעי הטחול המוכתמים ב-HE, מקבוצת הבקרה (E) ו-(F) H1N1. הסמל של "↑" מציין את העיסה הלבנה (ירוק). פסי קנה מידה: 500 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

כמה שיעולים עקשנים כרוניים פוסט-זיהומיות הם מצבים נפוצים הקשורים לזיהום וירוס בדרכי הנשימה²⁷. על מנת להעריך טוב יותר רגישות לשיעול ודלקת בדרכי הנשימה, נקבע מודל עכברי של שיעול באמצעות נגיף H1N1 במחקר זה. יש לבחור מודלים מתאימים לשיעול עכברים למחקרים אחרים בהתאם למטרת המחקר. רוב המחקרים הקודמים השתמשו בשרקן כמודל של בעלי חיים במחקרים מכניסטיים או בניסויים תרופתיים חדשים לשיעול 28,29,30. מחקרים אחרונים הציעו כי עכברים עשויים לשמש להערכת פתופיזיולוגיה של שיעול בשל מחזור הרבייה הקצר שלהם, ריאגנטים רבים יותר ונכונות למניפולציות גנטיות למרות שהתנהגות השיעול שלהם עדיין שנויה במחלוקת^16,31. חומצת הלימון שימשה כחומר טוסיבי לגרימת שיעול במחקר זה. המנגנונים של רפלקס שיעול המושרה על ידי חומצת לימון עשויים להיות קשורים להפעלת סיבי C jugular ו nodose Aδ-fibers³². חוץ מזה, מערכת WBP מודדת את השינויים ברפלקס השיעול בעכברים באופן לא פולשני וממזערת את ההשפעות של לחץ פסיכולוגי. יש למזער את השפעת הסביבה החיצונית על עכברים כאשר מתגלה רגישות לשיעול. העכבר צריך להיות ממוקם בחדר הבדיקה ולאחר מכן מכוסה בשקית ניילון כדי להפחית את הגירוי שנגרם על ידי הסביבה החיצונית.

מחקר זה מפרט את ההליכים הנורמטיביים לקצירת דם, טחול, BALF, ריאות ורקמות קנה הנשימה של עכברים ומציג כמה מדידות להערכת דלקת בדרכי הנשימה. כדי לזהות דלקת בדרכי הנשימה, קטעי הריאה וקנה הנשימה מוכתמים עם hematoxylin ו eosin כדי להעריך היסטופתולוגיה כללית²⁴. הריכוז המוגבר של סך החלבון וחומצת השתן בסופרנאטנט של BALF קשור לדלקת ולפגיעה בתאים בדרכי הנשימה³³. פעילות LDH בסופרנאטנט של BALF משקפת נזק לתאים ונמק³⁴. לויקוציטים ב BALF ובדם יכולים לשקף את מידת הדלקת של המחלה³⁵. ספירות תאים דיפרנציאליות של BALF נמצאות בשימוש נרחב בהערכת דלקת בדרכי הנשימה במחלות כרוניות של דרכי הנשימה ומספקות מידע חשוב בחקר פתוגנזה, ביצוע אבחנות ואסטרטגיות ניהול למחלות נשימה כרוניות³⁶.

המגבלה של ניסוי זה היא שאיסוף מספר רב של דגימות רקמה גורם לעכברים להיות מופעלים במשך זמן רב, מה שעשוי להשפיע על פעילות דגימות הרקמה. לכן, דגימות רקמת העכבר צריך להיות ממוקם על קרח מיד לאחר האיסוף. בנוסף, צינור השטיפה ברונכואלבאולרי המשמש במחקר זה מתאים לעכברים אך לא לבעלי חיים גדולים יותר.

לסיכום, אנו מספקים תיאור מפורט של שיטות הזיהוי של שיעול ודלקת בדרכי הנשימה בעכברים. שיטות אלה מספקות לחוקרים כלים לחקור את הפתופיזיולוגיה המורכבת של שיעול.

למחברים אין מה לחשוף.

עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט תכנון המדע והטכנולוגיה של גואנגזו (202002030151), הפרויקט הגדול של המעבדה הלאומית של גואנגזו (GZNL2024A02001), והמענק של מעבדת המפתח הממלכתית למחלות נשימה (SKLRD-Z-202202).