Тренажер для рыбок данио-рерио, вызванный плаванием, для универсальных подходов к тренировкам

Тренажеры, предназначенные для менее удачливых рыб, облегчают выполнение различных протоколов упражнений с различной интенсивностью, манипулируя скоростью потока воды, достижимой с помощью реотаксиса.

Чтобы всесторонне исследовать влияние физических упражнений на здоровье и болезни, животные модели играют ключевую роль. Рыбки данио, широко используемые позвоночные модельные организмы, предлагают уникальную платформу для таких исследований. Это исследование положило начало разработке экономически эффективного аппарата, предназначенного для исследований упражнений рыбок данио-рерио с использованием легкодоступных материалов. Устройство основано на принципах плавательного туннеля и включает в себя сеть труб и клапанов, соединенных с погружным насосом. Расход воды тщательно контролируется датчиком и регулируется с помощью клапанов. Для оценки эффективности аппарата были реализованы два протокола тренировок: непрерывная тренировка умеренной интенсивности (MICT) и высокоинтенсивная интервальная тренировка (HIIT). Рыбы тренировались коллективно, а их плавательные способности оценивались с помощью теста на выносливость. Оба протокола тренировок привели к улучшению результатов плавания после 30 дней тренировок и вызвали изменения в молекулярном ответе на упражнения по сравнению с контрольной группой, ведущей сидячий образ жизни. Примечательно, что HIIT продемонстрировал более высокую эффективность по сравнению с MICT. Система дрессировки рыбок данио оказалась ценным инструментом для исследований в области физиологии упражнений и еще больше расширяет возможности модели рыбок данио в этой области.

Физические упражнения включают в себя любые движения тела, выполняемые скелетными мышцами, которые приводят к увеличению расхода энергии, при этом упражнения являются структурированным и повторяющимся подмножеством физических упражнений¹. Физические упражнения, многофакторная и экономически эффективная деятельность, вовлекающая весь организм, приносят множество преимуществ для здоровья, таких как профилактика метаболического синдрома и саркопении^. Следовательно, область физиологии упражнений представляет значительный интерес, поскольку она стремится выяснить, как организм адаптируется к острому стрессу от физических упражнений, хроническому стрессу от физических упражнений и общему влиянию физических упражнений^{на здоровье.}

Проведение исследований физиологии упражнений на людях может быть как дорогостоящим, так и трудоемким из-за сложностей в планировании экспериментов и мониторинге участников³. Поэтому использование животных моделей в лабораторных условиях было настоятельно рекомендовано из-за их генетического и физиологического единообразия. Более того, в контролируемых лабораторных условиях животные, как правило, ведут сидячий образ жизни и регулируют потребление пищи⁴. Среди животных моделей грызуны были наиболее широко задействованы в исследованиях, связанных с^{физическими упражнениями}. Тем не менее, данио рерио (Danio rerio; Hamilton, 1822) является дополнительной моделью для мышей и других видов для исследований физических упражнений 5,6,7,8.

В исследованиях рыбок данио физические упражнения могут проводиться с использованием коммерчески доступных или специально построенных плавательных туннелей. Среди коммерчески доступных вариантов^{наиболее часто используется} тоннель типа Blazka, разработанный компанией Loligo System. ^7,9,10. Эта система вызывает принудительное плавание через гребной винт, соединенный с электродвигателем, создавая непрерывный поток воды в туннеле. Эта способность к плаванию коренится в принципе реотаксиса, врожденном поведении рыб, которое заставляет их плыть против водных течений и сохранять^{свое положение.} Реотаксис позволяет измерять критическую скорость плавания (Ucrit), представляющую собой максимальную скорость, которую рыба может поддерживать в течение определенного периода времени. Тем не менее, стоит отметить, что это оборудование, хотя и ценно для оценки поведения при плавании и потребления кислорода, имеет значительную стоимость^.

Исследователи разработали альтернативные приспособления для упражнений рыбок данио, часто основанные на механизме типа Блашки 10,13,14 или более простых механизмах ^8,15,16. Тем не менее, эти методы могут быть ограничены техническими требованиями протокола, включая увеличенную продолжительность, значительные затраты на оборудование и ограничения пропускной способности и точности. Следовательно, основной целью исследования была разработка доступной и удобной для пользователя системы упражнений для рыбок данио-рерио с использованием легкодоступных материалов, обеспечивая новый альтернативный снаряд для физических упражнений у рыб. Вторичной целью было внедрение как аэробных, так и анаэробных режимов упражнений у рыбок данио, что еще больше способствовало использованию модели рыбок данио в качестве стратегии вмешательства в исследования упражнений.

Процедуры получили предварительное одобрение Комитета по этике использования животных Федерального университета Сан-Паулу (CEUA/UNIFESP No 9206260521). В исследовании принимали участие только взрослые самки дикого типа Danio rerio в возрасте 6 месяцев и весом 2,5-3 г. Оборудование и реактивы, необходимые для проведения исследования, перечислены в Таблице материалов.

1. Изготовленный на заказ тренажер для рыбок данио-рерио

ПРИМЕЧАНИЕ: Тренажер был изготовлен по индивидуальному заказу. Для получения подробной информации см. Рисунок 1, Дополнительную таблицу 1, Дополнительный файл 1 и Дополнительный файл 2.

1. Поместите погружной насос (N) в резервуар для воды (O) (≥30 л). Убедитесь, что вода соответствует следующим условиям: pH 7,2 ± 0,5 и 400 ± 50 μS, 28 ± 1 °C.
2. Текучий дополнительный стол 1 и рисунок 1, соедините трубу (I) с точечной тройником (B) и прикрепите маленькую трубу (G) к боковой стороне B. От G установите соединения к шаровому клапану (F), затем к другому G, и последовательно к колену трубы (A) и I, тем самым завершив сегмент, отвечающий за регулирование давления воды в системе. Это регулирование достигается за счет обратного потока в резервуар для воды (О).
3. В альтернативной части B соедините его с трубой (J), а затем соедините с A и G. Используйте фитинг для трубной раструбы (D) для подключения задвижки водяной задвижки (E) к G.
4. Интегрируйте в систему входной порт для рыбы, подключив B к G на одном конце и присоединив другой G на противоположном конце. Затем подсоедините фитинг раструбной трубы (C) к этому второму G, установив последовательность, которая соединяется с акриловой трубой (K), что имеет решающее значение для визуализации поведения при плавании.
   1. Чтобы соединить K с датчиком расхода воды (M), используйте трубки C, G и D. Перейдите к соединению M к G с помощью D, а затем интегрируйте A, G и H, чтобы облегчить возврат воды в резервуар.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вставьте москитную сетку в короткий сегмент трубы между затвором и шаровым клапаном (F2), чтобы предотвратить доступ рыбы к другим секциям устройства. Шаровой клапан (F) выполняет двойную функцию. Первый шаровой клапан (F1) контролирует поток воды, возвращающийся в резервуар перед поступлением в остальную часть аппарата, действуя как клапан регулирования давления в системе. Шаровой клапан (F2) является точкой входа и выхода для рыбок данио в системе.
5. Прикрепите датчик расхода воды после акриловой трубы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Датчик расхода должен быть подключен к ЖК-дисплею и запрограммирован с помощью Arduino (Рисунок 1). Подробная информация о настройке Arduino представлена в дополнительном файле 2.

2. Работа аппарата

1. Чтобы безопасно ввести рыбу в систему, важно прервать поток воды. Для этого закройте задвижку (E), держа шаровой клапан (F1) открытым. Затем откройте шаровой клапан (F2), который служит входом в систему, аккуратно введите рыбу и быстро закройте клапан F2. Наконец, откройте клапан E, чтобы наполнить зону упражнений водой.
2. Используйте шаровой клапан для управления скоростью потока, отводя воду обратно в резервуар при необходимости.
3. Используйте задвижку (F2) для точной регулировки потока и управления доступом рыбы.
4. Чтобы удалить рыбу в конце испытания, закройте клапан (E) при соблюдении критериев разряжения. Затем откройте клапан F и поверните его на 180° относительно оси акриловой трубки; Это облегчит дренаж воды, уносящей с собой истощенную рыбу.
5. Выполнение мониторинга потока.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо контролировать скорость потока воды через систему, которая включает в себя Arduino Nano, ЖК-экран 16 x 2, резистор через отверстие 10 кОм, 0,25 Вт и потенциометр 10 кОм. Датчик расхода непрерывно контролирует скорость потока воды на основе технологии Холла¹⁷. Каждый импульс тока соответствует одному обороту флоппера датчика, в результате чего частота (Гц) составляет 6,6 x Q (расход в л/мин).
   1. Подсоедините соответствующие провода датчика расхода к контактам 5 В, GND и D2 Arduino Nano (дополнительная таблица 1). Загрузите предоставленный эскиз (дополнительный файл 1) в Arduino с помощью Arduino IDE. Питание системы осуществляется через USB-порт Arduino.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Измерения расхода отображаются на ЖК-экране с разрешением 16 x 2. Калибровка датчика расхода воды показана на рисунке 2. Схемы подключений Arduino к ЖК-дисплею показаны на рисунке 3.

3. Испытание на выносливость

ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе описывается процедура испытания на выносливость для определения максимальной скорости плавания (Umax) рыбок данио.

1. Во-первых, дайте рыбе в течение 60 минут в день адаптироваться к низкой скорости течения воды (0,06 м/с) внутри плавательного туннеля в течение двух недель.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После 24-часового периода предварительной подготовки отдельные рыбки данио проходят продолжительное испытание на плавательные характеристики. Цель этого теста – установить Umax каждой рыбы.
2. Поместите рыбок данио по отдельности в аппарат.
3. Условия испытания: Расположите рыбу против течения воды с начальной скоростью 0,06 м/с в течение 10 минут.
4. Приращения скорости: Увеличивайте расход воды дискретными этапами, с шагом 0,02 м/с, происходящим каждую минуту в течение 40-50 минут.
5. Определение Umax: Установите максимальную скорость плавания (Umax), когда рыба соответствует критериям истощения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Истощение определяется при первой из следующих ситуаций: (1) неспособность удерживать свое положение против потока воды более трех раз, или (2) неспособность удерживать свое положение более 5 с.
6. Закройте клапан (E) при соблюдении критериев разрядки. Затем откройте клапан F и поверните его на 180° относительно оси акриловой трубки. Это облегчит сток воды, вынося истощенных рыб.

4. Группы упражнений и порядок действий

ПРИМЕЧАНИЕ: Для создания четких протоколов упражнений важно включить сидячую группу, которая подвергалась воздействию идентичных экспериментальных условий, чтобы сравнить эффекты протоколов упражнений, хотя и без высокоинтенсивных упражнений. Также важно установить Umax, потому что дроби значения Umax необходимы для определения интенсивности протоколов упражнений.

1. Сидячая группа: Подвергайте рыбу принудительному плаванию против течения воды со скоростью 0,06 м/с в течение 60 минут.
   Примечание: Аппарат генерирует непрерывный поток воды, заставляя рыб плыть против этого течения на основе принципа реотаксиса¹¹.
2. Группа непрерывной тренировки умеренной интенсивности (MICT): Подвергайте рыбу принудительному плаванию против течения воды при температуре 60% Umax, как определено в тесте на максимальную мощность, в течение 35 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол был адаптирован из Húngaro et ^al.18. В течение первых 10 минут рыба акклиматизировалась до той же скорости, что и сидячая группа (0,05 м/с).
3. Группа высокоинтенсивных интервальных тренировок (HIIT): Подвергайте рыб принудительному плаванию, чередуя скорости плавания: 2 минуты при 90% Umax, затем 2 минуты при 30% Umax, повторяя в течение 18 минут (9 циклов). Этот протокол был адаптирован из Marcinko et ^al.19.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В течение первых 10 минут периода упражнений необходимо акклиматизировать рыб с той же скоростью, что и сидячая группа (0,06 м/с).
4. Выполняйте все протоколы упражнений в течение 5 дней в неделю в течение четырехнедельного периода.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рыб следует содержать в аквариумах, обеспечивающих подходящие условия, и их следует вводить в тренажеры только в специально отведенные для этого периоды. Рыбы должны быть обеспечены кормом из тропических рыб хлопьями три раза в день, а вода в аквариумах технического обслуживания должна подвергаться частичной подмене каждые 2 дня.
5. Повторяйте тест на выносливость в конце каждой недели, используя данные о задержке и скорости в точке усталости в качестве индикаторов параметров физической подготовки.
6. Чтобы вызвать эффект перетренированности, увеличивайте скорость потока воды еженедельно на основе результатов теста на выносливость, проводимого после каждого 4-дневного цикла тренировок. Продолжительность тренировок должна быть скорректирована с учетом пройденного расстояния (скорость × время), и эта продолжительность должна оставаться одинаковой между тренирующимися группами.
7. Корректируйте время плавания в зависимости от увеличения потока воды, тем самым стандартизируя тренировочную нагрузку в тренируемых группах.

5. Замеры тела

1. Обезболивайте рыб 0,0075% трикаином (w/v) путем погружения для проведения измерений тела (вес и размер)²⁰.
2. Сфотографируйте и взвесьте рыб, чтобы определить размеры тела с помощью программного обеспечения ImageJ.
3. Выразите данные в терминах индексов упитанности (вес [г]/стандартная длина [мм]2; ИМТ) и оценка упитанности (BCS)²⁰.
4. Чтобы исключить вариации размеров и веса, вызванные образованием яиц, подвергните рыб стандартному разведению²⁰ с последующими измерениями и взвешиванием.

Тренажер продемонстрировал замечательную эффективность в регулировании скорости потока. Для постепенного увеличения скорости плавания поток воды постепенно увеличивался еженедельно для всех групп, за исключением группы СЭД, которая поддерживалась при постоянной скорости течения 0,06 м/с. Примечательно, что аппарат обеспечил замечательный уровень точности, достигнув регулировки скорости потока до 0,001 м/с. Тем не менее, частота ошибок составляла 30% при низких скоростях, таких как 0,06 м/с. При высоких скоростях, таких как 0,3 м/с и 0,5 м/с, частота ошибок составляла 3%-4% (рис. 2). Максимальная скорость, достигнутая во время тренировки, составила 0,4 м/с в SED, 0,44 м/с в MICT и 0,49 м/с в группах HIIT в последней выносливости.

Физические показатели рыбок данио оценивались еженедельно с помощью Umax в тесте на выносливость. Результаты показали значительное улучшение физической работоспособности у рыбок данио, подвергшихся воздействию MICT и HIIT, по сравнению с группой SED (рис. 4). Как MICT, так и HIIT были пройдены на одно и то же расстояние, пройденное во время обучения; тем не менее, группа HIIT вызвала быстрые улучшения, при этом значительное увеличение Umax наблюдалось уже через две недели (p = 0,0003). В течение тренировочного периода группа HIIT демонстрировала стабильное еженедельное улучшение на 10%, что привело к общему улучшению примерно на 30%. Напротив, обучение MICT привело к более постепенному росту, при этом заметное увеличение Umax на ~10% было зафиксировано только на третьей неделе обучения, за которым последовало отсутствие дальнейшего улучшения на следующей неделе (p = 0,0024). Эти результаты подчеркивают дифференциальное влияние протоколов тренировок HIIT и MICT на физическую работоспособность рыбок данио.

Рисунок 1: Конструкция аппарата. (A) Схемы плавательного аппарата. Синими стрелками обозначено направление потока воды. На рисунке изображены соответствующие длины труб. Буквы обозначают каждый компонент устройства, описанный в Дополнительной таблице 1. (В) Фотография аппарата. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Иллюстрация 2: Калибровка датчика расхода воды путем измерения времени, необходимого для расхода 0,5 л. SEM составил 0,277 в группах 0,06 м/с, 0,123 в группах 0,3 м/с и 0,109 в группах 0,5 м/с. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Схемы подключений Arduino к ЖК-дисплею. Соответствующие провода датчика должны быть подключены или припаяны между выводом D2 Arduino и резистором 10 кОм (сигнальный провод), заземлением Arduino (черный провод) и напряжением 5 В Arduino (красный провод). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Эффективность плавания, выраженная в максимальной скорости плавания (Umax). a, b и c указывают на статистические различия между еженедельными оценками способности к плаванию в каждой группе. *Указывает на разницу между группами, сравнение с использованием двустороннего дисперсионного анализа (постхос Тьюки). *p = 0,01; **p = 0,001; p = 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5: Морфологические измерения. (A) Индексы упитанности (вес [г] / стандартная длина [мм]2; ИМТ). (В) Репрезентативное изображение измеренного тела. (c) Оценка упитанности (BCS). Погрешность соответствует диапазону от 0,026 до 0,045 для ИМТ и от 0,4 до 0,96 для БКС. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Дополнительная таблица 1: Материалы и руководство по сборке тренажеров для рыбок данио . В таблице есть буквы, которые соответствуют порядку сборки, показанному на рисунке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 1: Аннотированный эскиз Arduino для измерения скорости воды. Комментарии к каждой строке кода добавляются после двойных косых черт. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный файл 2: Файл Arduino, включая детали настройки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

В этом исследовании была разработана инновационная, экономически эффективная система упражнений, вдохновленная респирометром для плавательного туннеля от Loligo Systems²¹ и системой лотка²² для всестороннего изучения плавательных способностей рыбок данио. Umax определяли путем систематического увеличения потока воды дискретными стадиями, с увеличением скорости через короткие промежутки времени (20-30 мин) до тех пор, пока рыба не достигала истощения, которое характеризовалось тремя последовательными утомлениями или неспособностью преодолеть течение в плавательном туннеле. Эти выводы сыграли важную роль в разработке двух протоколов упражнений (MICT и HIIT). В отличие от протоколов, предполагающих относительно длительную продолжительность этапов (от одного до нескольких часов), скорость потока воды при истощении известна как критическая скорость плавания (Ucri)¹². Значения Umax, рассчитанные с помощью системы упражнений, находились в диапазоне, наблюдавшемся в других исследованиях⁷, что подтверждает эффективность этого туннельного плавательного аппарата для оценки физической работоспособности рыбок данио. Кроме того, этот компактный аппарат обладает универсальностью, позволяющей охватить весь спектр скоростей потока воды, что облегчает адаптацию применяемых протоколов обучения.

В данной разработке аппарата можно создавать различные протоколы упражнений, контролируя только скорость потока воды. Точное измерение скорости потока воды на низких скоростях создавало проблемы, что приводило к частоте ошибок около 30%. Тем не менее, точность улучшилась на средних и высоких скоростях, приближаясь к Umax, с более надежным измерением скорости и снижением процента ошибок на 3-4%. Следовательно, было выявлено ограничение точности устройства на низких скоростях. Несмотря на это ограничение, в ходе исследования было установлено, что даже при изменении скорости 0,02 м/с существенного влияния на физические возможности группы СЭД во время тренировки не наблюдалось. Это говорит о том, что вариации в тренировках низкой интенсивности могут не оказывать существенного влияния на физическую работоспособность, по крайней мере, в модели, представленной в этом исследовании. Еще одним ограничением предлагаемого аппарата является отсутствие датчика кислорода, что делает невозможным измерение потребления кислорода.

Предыдущие исследования продемонстрировали заметное несоответствие в скорости плавания между взрослыми самцами и самками данио-рерио, с предполагаемыми атрибутами, включающими морфологические различия, такие как увеличенный обхват самок, и физиологические различия, такие как снижение мышечной силы у приливных рыб ^5,23,24. В этом исследовании самки данио-рерио подвергались исключительно режиму дрессировки, признавая, что эти самки прошли три цикла размножения до, во время и после тренировки, последовательно предшествующих измерениям тела. Этот стратегический подход эффективно смягчал различия в телах между полами. Более того, это исследование не выявило заметных различий в параметрах тела между тренировочными группами (рис. 5) или при сравнении пред- и посттренировочных условий у женщин. Несмотря на то, что возрастные различия между людьми не контролировались, хорошо известно, что потребности в плавании и энергии для передвижения могут заметно колебаться на протяжении всего жизненного цикла из-за онтогенеза, размножения^{и старения.} Несмотря на потенциальные различия в возрасте внутри каждой группы, все животные были тщательно сгруппированы на основе размера, массы тела и постоянной половозрелой стадии взрослой особи. Примечательно, что статистически значимых различий между группами до начала режима физических упражнений не наблюдалось. Следовательно, было высказано предположение, что наблюдаемое увеличение способности к плаванию может быть с уверенностью связано исключительно с используемыми протоколами упражнений.

Это исследование было направлено на оценку эффективности системы упражнений путем внедрения двух отдельных протоколов учений. В то время как MICT включает в себя устойчивый, непрерывный режим упражнений, HIIT включает в себя короткие серии упражнений максимальной интенсивности, за которыми следуют короткие, менее интенсивные периоды восстановления. Оба протокола были тщательно скорректированы, чтобы обеспечить эквивалентную тренировочную нагрузку в течение всего тренировочного периода, не вызывая истощения. Группа SED проходила тот же тест на выносливость один раз в неделю в течение четырех недель, как и другие группы упражнений, но продемонстрировала минимальное улучшение производительности. Тренировка на выносливость признана для увеличения сердечного выброса, максимального потребления кислорода и митохондриального биогенеза²⁸; Тем не менее, еженедельная частота упражнений оказалась недостаточной для того, чтобы вызвать значительные изменения в плавательных результатах. Когда рыбки данио были подвергнуты тренировке MICT, заметное улучшение результатов плавания наблюдалось уже после третьей недели обучения. Однако на следующей неделе дальнейшего улучшения не произошло. MICT включает в себя индивидуумов, выдерживающих субмаксимальную рабочую нагрузку в течение длительного времени, что^{требует выходной} мощности выше среднего2. В частности, группа HIIT продемонстрировала наиболее существенное улучшение, при этом значительный рост производительности был заметен уже после двух недель тренировок, которые сохранялись до четвертой недели. Несмотря на то, что хорошо известно, что короткие высокоинтенсивные упражнения приводят к адаптации к выносливости, конкретный тип упражнений, ответственный за возникновение фенотипических мышечных сдвигов^{, остается} темой продолжающихся исследований.

Важно уточнить, что нет никаких конкурирующих финансовых интересов, связанных с исследованием, представленным в данной рукописи. Не было установлено никаких финансовых партнерств или аффилированных лиц с организациями или юридическими лицами, которые могли бы потенциально повлиять на результаты этой работы или повлиять на них. Это заявление служит гарантией того, что процесс исследования был прямым и честным, без финансовых конфликтов, влияющих на результаты. Презентация этой работы продиктована искренней страстью к предмету, движимой исключительно любовью к академическим кругам и стремлением к научным знаниям.

Выражаем благодарность доктору Омару Мертинсу за великодушное предоставление доступа в лабораторию для содержания рыб и проведения тестов. Кроме того, выражается благодарность FAPESP, CNPq и CAPES за присуждение стипендий для поддержки этого исследования.