遊泳用ゼブラフィッシュ運動装置による多様なトレーニングアプローチ

恵まれない魚のために設計された運動装置は、レオタキシスによって達成可能な水流速度を操作することにより、さまざまな強度の多様な運動プロトコルの実装を容易にします。

運動が健康や病気に及ぼす影響を包括的に調査するためには、動物モデルが重要な役割を果たします。ゼブラフィッシュは、脊椎動物のモデル生物として広く利用されており、このような研究のためのユニークなプラットフォームを提供しています。この研究では、入手しやすい材料を利用したゼブラフィッシュの運動研究に適した費用対効果の高い装置の開発を紹介しました。この装置は、水泳トンネルの原理に基づいており、水中ポンプにリンクされたパイプとバルブのネットワークを包含しています。水の流れはセンサーによって細心の注意を払って監視され、バルブ を介して 調整されます。装置の有効性を評価するために、中強度の連続トレーニング(MICT)と高強度インターバルトレーニング(HIIT)の2つのトレーニングプロトコルが実装されました。魚は集団で訓練され、その遊泳能力は持久力テストを通じて評価されました。どちらのトレーニングプロトコルも、30日間のトレーニング後に水泳パフォーマンスの改善につながり、座りがちな対照群と比較して運動に対する分子反応の変化を誘発しました。特に、HIITはMICTよりも優れた効率を示しました。ゼブラフィッシュのトレーニングシステムは、運動生理学の研究に貴重なツールであることが証明され、この分野におけるゼブラフィッシュモデルの有用性をさらに前進させます。

身体運動には、骨格筋によって行われる身体の動きが含まれ、エネルギー消費が増加するため、運動は身体活動の構造化された反復的なサブセットです¹。運動は、全身を巻き込む多因子的で費用対効果の高い活動であり、メタボリックシンドロームやサルコペニア^の予防など、多くの健康上の利点をもたらします2。したがって、運動生理学の分野は、運動の急性ストレス、身体トレーニングの慢性ストレス、および運動が健康に及ぼす全体的な影響に対して身体がどのように適応するかを解明しようとするため、大きな関心を集めています¹。

ヒトで運動生理学研究を行うことは、実験デザインと^{参加者モニタリングの課題}により、費用と時間がかかる可能性があります3。したがって、実験室環境での動物モデルの使用は、その遺伝的および生理学的均一性のために強く推奨されてきました。さらに、制御された実験室条件下では、動物は通常、座りがちな生活を送り、食物摂取量が規制されています⁴。動物モデルの中で、げっ歯類は身体運動を含む研究で最も広く採用されています¹。しかし、ゼブラフィッシュ(Danio rerio;Hamilton, 1822)は、^{運動研究のための}マウスや他の種を補完するモデルである5,6,7,8。

ゼブラフィッシュの研究では、市販の遊泳トンネルや特注の遊泳トンネルを使用して運動を行うことができます。市販のオプションの中で、Loligo Systemによって開発されたBlazkaタイプのトンネルは、最も頻繁に利用されています^7,9,10。このシステムは、電気モーターに結合されたプロペラを介して強制遊泳を誘発し、トンネル内で連続的な水流を生成します。この遊泳能力は、魚が水流に逆らって泳ぎ、位置を維持するように駆り立てる生来の行動であるレオタキシスの原理に根ざしています¹¹。レオタキシス(Rheotaxis)は、魚が特定の期間に維持できる最大速度を表す臨界遊泳速度(Ucrit)の測定を可能にします。ただし、この機器は、水泳行動と酸素消費量を評価するために価値がありますが、かなりのコスト^{がかかることに注意してください12}。

研究者たちは、ゼブラフィッシュを運動させるための代替装置を開発しており、その多くはブラスカ型のメカニズム10,13,14またはより単純なメカニズム^8,15,16に基づいている。それにもかかわらず、これらの方法は、長期間の延長、多額の機器費用、スループットと精度の制限など、プロトコルの技術的要求によって制約される場合があります。したがって、この研究の主な目的は、容易に入手できる材料を使用して、手頃な価格でユーザーフレンドリーなゼブラフィッシュ運動システムを設計し、魚の運動のための新しい代替装置を提供することでした。副次的な目標は、ゼブラフィッシュに有酸素運動と無酸素運動の両方を実施し、運動研究への介入戦略としてのゼブラフィッシュモデルの利用をさらに進めることでした。

この手続きは、サンパウロ連邦大学の動物使用倫理委員会(CEUA/UNIFESP no. 9206260521)から事前承認を得ています。この研究では、生後6か月、体重2.5〜3gの成体女性の野生型 Danio rerioのみが使用されました。本試験に必要な機器および試薬は、 資料表に記載されています。

1.カスタムメイドゼブラフィッシュ運動器具

注:運動器具は特注でした。詳細については、 図1、 補足表1、 補足ファイル1、 および補足ファイル2を参照してください。

1. 水中ポンプ(N)を水タンク(O)(≥30 L)の中に置きます。水が次の条件を満たしていることを確認してください:pH 7.2 ± 0.5および400 ± 50 μS、28 ± 1°C。
2. 流 動補助表1 及び 図1は、ポイントT字パイプ(B)にパイプ(I)を接続し、Bの側面に細いパイプ(G)を取り付ける。Gからグローブバルブ(F)、次に別のG、パイプエルボー(A)とIの順に接続を確立し、システム内の水圧の調整を担当するセグメントを完成させます。この調整は、水タンク(O)への戻り流によって達成されます。
3. Bの代替セクションで、パイプ(J)にリンクし、続いてAとGに接続します。
4. 魚のエントリーポートをシステムに統合するには、一方の端でBをGに接続し、もう一方の端で別のGを取り付けます。続いて、ソケットパイプフィッティング(C)をこの2番目のGに接続し、遊泳行動を視覚化するために重要なアクリルパイプ(K)に接続するシーケンスを確立します。
   1. Kを水流センサー(M)に接続するには、パイプC、G、およびDを使用しますDを使用してMをGに接続し、次にA、G、およびHを統合して、貯水池への水の戻りを容易にします。
      注意: ゲートとグローブバルブ(F2)の間の短いパイプセグメントに蚊帳を挿入して、魚が装置の他のセクションにアクセスするのを防ぎます。グローブバルブ(F)には2つの目的があります。第1のグローブバルブ(F1)は、装置の残りの部分に入る前にリザーバーに戻る水の流れを制御し、システム圧力制御バルブとして機能します。グローブバルブ(F2)は、システム内のゼブラフィッシュの入口と出口です。
5. アクリルパイプの下流に水流センサーを取り付けます。
   注:フローセンサーはLCDディスプレイに接続し、Arduinoを使用してプログラムする必要があります(図1)。Arduinoのセットアップの詳細については、 補足ファイル2を参照してください。

2. 装置の操作

1. 魚を安全にシステムに導入するには、水の流れを遮断することが不可欠です。これを実現するには、グローブバルブ(F1)を開いたままゲートバルブ(E)を閉じます。その後、システムの入り口となるグローブバルブ(F2)を開き、魚を静かに導入し、すぐにF2バルブを閉じます。最後に、Eバルブを開いて、エクササイズエリアを水で満たします。
2. グローブバルブを使用して流速を制御し、必要に応じて水を貯水池に戻します。
3. ゲートバルブ(F2)を使用して、正確な流量調整と魚のアクセス管理を行います。
4. テストの最後に魚を取り除くには、疲労基準を観察したらバルブ(E)を閉じます。次に、バルブFを開き、アクリルチューブの軸に対して180°回転させます。これにより、疲れ果てた魚を運ぶ水の排水が容易になります。
5. フロー監視を実行します。
   注:Arduino Nano、16 x 2 LCDスクリーン、10 kΩ、0.25 Wのスルーホール抵抗器、および10kΩポテンショメータを組み込んだシステムを介して水の流速を監視する必要があります。フローセンサーは、ホール効果技術¹⁷に基づいて水の流速を連続的に監視します。電流の各パルスはセンサーフロッパーの1回転に対応し、周波数(Hz)は6.6 x Q(L/minの流量)になります。
   1. フローセンサーの適切なワイヤをArduinoNanoの5V、GND、およびD2ピンに接続します(補足表1)。提供されたスケッチ(補足ファイル1)をArduinoIDEを使用してArduinoにロードします。ArduinoUSBポートを介してシステムに電力を供給します。
      注意: 流量測定値は、16 x 2 LCD画面に表示されます。水流センサーのキャリブレーションを 図2に示します。LCDへのArduino接続の概略図を 図3に示します。

3.耐久試験

注:このステップでは、ゼブラフィッシュの最大遊泳速度(Umax)を決定するための耐久テストの手順を概説します。

1. まず、魚が1日60分間、遊泳トンネル内の低水流速度(0.06 m / s)に2週間適応するのを待ちます。
   注:24時間のプレコンディショニング期間の後、個々のゼブラフィッシュは持続的な遊泳パフォーマンステストを受けます。このテストの目的は、各魚のUmaxを確立することです。
2. ゼブラフィッシュを装置に個別に置きます。
3. 試験条件:初速0.06m/sの水流に10分間、魚を逆らわせます。
4. 速度の増分:水の流れを離散的に増加させ、0.02 m / sの速度増分が毎分40〜50分間発生します。
5. Umaxの決定:魚が枯渇基準を満たしたときに、最大遊泳速度(Umax)をレコポッドします。
   注:消耗は、次の状況の最初の状況が観察された場合に定義されます:(1)水流に対して3回以上位置を維持できない、または(2)5秒を超えてその位置を維持できない。
6. 消耗基準を観察したら、バルブ(E)を閉じます。次に、バルブFを開き、アクリルチューブの軸に対して180°回転させます。これにより、疲れ果てた魚を運ぶ水の排水が容易になります。

4. エクササイズグループと手順

注:明確な運動プロトコルを確立するには、高強度の運動を受けなくても、運動プロトコルの効果を比較するために、同一の実験条件にさらされた座りがちなグループを含めることが不可欠です。また、運動プロトコルの強度を決定するためにUmax値の分数が必要であるため、Umaxを確立することも不可欠です。

1. 座りがち(SED)グループ:魚を0.06 m / sの水流に逆らって60分間強制的に泳がせます。
   注:装置は連続的な水流を生成し、レオタキシス¹¹の原理に基づいて魚にこの流れに逆らって泳ぐように強制します。
2. 中強度連続トレーニング (MICT) グループ: 最大容量テストで決定された Umax の 60% の水流に逆らって、魚を 35 分間強制的に泳がせます。
   注:このプロトコルは、Húngaro et ^al.18から採用されました。最初の10分間、魚は座りがちなグループと同じ速度(0.05 m / s)に順応しました。
3. 高強度インターバルトレーニング(HIIT)グループ:魚を交互に遊泳速度で強制水泳させます:Umaxの90%で2分、続いてUmaxの30%で2分、18分間(9サイクル)繰り返します。このプロトコルは、Marcinko et ^al.19 から採用されました。
   注:運動期間の最初の10分間は、魚を座りがちなグループと同じ速度(0.06 m / s)に順応させる必要があります。
4. すべての運動プロトコルを週5日、4週間にわたって実施します。
   注:魚は適切な条件を提供する水槽に収容されるべきであり、指定された運動期間中にのみ運動装置に導入されるべきです。魚には熱帯魚のフレーク状の餌を1日3回提供し、維持水槽の水は2日ごとに部分的に交換する必要があります。
5. 毎週末に持久力テストを繰り返し、疲労点でのレイテンシと速度のデータをフィジカルコンディショニングパラメータの指標として使用します。
6. オーバートレーニング効果を誘発するには、トレーニングの各4日間のサイクル後に実施される耐久テストの結果に基づいて、毎週水流速度を上げます。トレーニング時間は、移動距離(速度×時間)を考慮して調整する必要があり、これらの時間はエクササイズしたグループ間で一貫している必要があります。
7. 水流の増加に応じて遊泳時間を調整し、運動グループ全体でトレーニング負荷を標準化します。

5. 身体測定

1. 体測定(重量とサイズ)²⁰を行うための浸漬により、0.0075%トリカイン(w / v)で魚を麻酔します。
2. ImageJソフトウェアを使用して魚を撮影し、体重を量り、体の寸法を決定します。
3. データをBody Condition Indices(体重[g]/標準長さ[mm]2;BMI)とボディコンディションスコアリング(BCS)²⁰。
4. 卵の形成によって引き起こされるサイズと重量の変動を排除するために、魚を標準的な繁殖²⁰にかけ、続いて測定と計量を行います。

運動器具は、流速の調整において顕著な効率を示しました。遊泳速度を徐々に向上させるため、SEDグループを除くすべてのグループで水量を毎週段階的に増加させ、SEDグループでは0.06m/sの一定の流速を維持しました。特に、この装置は驚くべきレベルの精度を可能にし、0.001m/sの微細な流速調整を達成しました。しかし、0.06 m/sなどの低速では誤差率は30%でした。0.3 m/sや0.5 m/sなどの高速では、エラー率は3%〜4%でした(図2)。訓練中に到達した最大速度は、前回の耐久でSEDで0.4m/s、MICTで0.44m/s、HIITグループで0.49m/sでした。

ゼブラフィッシュの身体能力は、耐久試験でUmaxを使用して毎週評価されました。その結果、MICTおよびHIITを受けたゼブラフィッシュは、SED群と比較して、身体能力が有意に向上していることが明らかになりました(図4)。MICTとHIITはどちらも、トレーニング中に同じ移動距離に提出されました。しかし、HIITグループは急速な改善を誘発し、わずか2週間後にはUmaxの大幅な増加が観察されました(p = 0.0003)。トレーニング期間中、HIITグループは毎週一貫して10%の改善を示し、その結果、全体で約30%の向上が見られました。対照的に、MICTトレーニングはより緩やかな増加につながり、トレーニングの3週目でのみUmaxの顕著な~10%の増加が記録され、その後の週にはそれ以上の改善は見られませんでした(p = 0.0024)。これらの知見は、HIITとMICTのトレーニングプロトコルがゼブラフィッシュの身体能力に及ぼす影響の違いを浮き彫りにしています。

図1:装置の設計 (A)遊泳装置の概略図。青い矢印は水の流れの方向を示しています。関連するパイプの長さが示されています。文字は 、補足表1に記載されている各装置コンポーネントを表しています。(B)装置の写真。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:0.5Lの流量に必要な時間を測定することによる水流センサの校正。 SEMは0.06m/sで0.277、0.3m/sで0.123、0.5m/sグループで0.109であった。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:LCDへのArduino接続の回路図。 センサーの適切なワイヤは、ArduinoのD2ピンと10kΩ抵抗(信号線)、Arduinoのグランド(黒線)、およびArduinoの5V(赤線)の間に接続またははんだ付けする必要があります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:最大水泳速度(Umax)で表される水泳パフォーマンスa、 a、b、cは、各グループ内の毎週の水泳能力推定値の統計的差を示しています。*グループ間の違いを示し、二元配置分散分析(Tukey posthoc)を使用して比較します。*p = 0.01;**p = 0.001;p = 0.0001 です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:形態学的測定 (A)体調指数(重量[g]/標準長さ[mm]2;BMI)。(B)身体測定の代表的な画像。(C)ボディコンディションスコアリング(BCS)。エラーバーは、BMIの場合は0.026〜0.045、BCSの場合は0.4〜0.96の範囲に対応します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足表1:ゼブラフィッシュ運動器具の材料と組み立てガイド。 この表には、図に示されている組み立て順序と一致する文字があります。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル1:水速を測定するための注釈付きArduinoスケッチ。 コードの各行のコメントは、二重スラッシュの後に組み込まれます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル2:セットアップの詳細を含むArduinoファイル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

この研究では、ゼブラフィッシュの遊泳性能を包括的に検討するために、Loligo Systems²¹ の遊泳トンネル呼吸計と水路システム²² に触発されて、革新的で費用対効果の高い運動システムが開発されました。Umaxは、魚が枯渇するまで短い間隔(20〜30分)で速度の増加を伴い、離散的な段階で水の流れを体系的に増加させることによって決定されました。これらの決定は、2つの運動プロトコル(MICTとHIIT)の設計に役立ちました。比較的長いステージ期間(1時間から数時間の範囲)を含むプロトコルとは異なり、枯渇時の水流速度は臨界水泳速度(Ucri)¹²として知られています。この運動システムを用いて算出したUmax値は、他の研究でも観測された範囲内に収まっており⁷、このトンネル遊泳装置がゼブラフィッシュの身体能力評価に有効であることが確認されました。さらに、このコンパクトな装置は、水流速度の全範囲をカバーする汎用性を備えており、適用されるトレーニングプロトコルのカスタマイズを容易にします。

本装置開発では、水流速度を制御するだけで、異なる運動のプロトコルを作成することができます。水の流速を正確に測定することは、低速では課題となり、約30%のエラー率が発生していました。それにもかかわらず、中速および高速では精度が向上し、Umaxに近づき、速度測定の信頼性が向上し、エラー率が3%〜4%減少しました。その結果、低速でのデバイス精度の限界が特定されました。この制限にもかかわらず、この研究では、0.02 m/sの速度変動があっても、トレーニング中のSEDグループの身体能力に大きな影響は観察されなかったことがわかりました。このことは、少なくともこの研究で提示されたモデルでは、低強度トレーニングの変動が身体能力に大きな影響を与えない可能性があることを示唆しています。また、提案装置には酸素センサがないため、酸素消費量を測定できないという欠点もあります。

これまでの研究では、成体の雄と雌のゼブラフィッシュの遊泳速度に顕著な差があることが示されており、妊娠した雌の胴回りの増加などの形態学的な区別や、妊娠した魚の筋力出力の低下などの生理学的な違いなどの原因が示唆されています^5,23,24.この調査では、雌のゼブラフィッシュのみが訓練計画に服従し、これらの雌が訓練前、訓練中、訓練後に3回の繁殖サイクルを経て、一貫して身体測定に先行していたことを認めました。この戦略的アプローチは、インターセックスの身体の違いを効果的に緩和しました。さらに、この研究では、トレーニンググループ間(図5)や、女性のトレーニング前後の条件を比較する際に、身体パラメータに識別可能な違いは見られませんでした。個体間の年齢差の制御は行われなかったが、個体発生、繁殖、および老化により、泳ぐパフォーマンスと移動エネルギーの要求がライフサイクルを通じて著しく変動する可能性があることは十分に文書化されている25,26,27。各グループ内では年齢差がある可能性があるにもかかわらず、すべての動物は、サイズ、体重、および一貫した性的に成熟した成体段階に基づいて細心の注意を払ってグループ化されました。注目すべきは、運動療法を開始する前に、グループ間で統計的に有意な差が観察されなかったことです。その結果、観察された水泳能力の向上は、採用された運動プロトコルのみに自信を持って起因すると仮定されました。

この研究は、2つの異なる運動プロトコルを実装することにより、運動システムの有効性を評価することを目的としていました。MICTには持続的で継続的な運動療法が含まれますが、HIITには、最大強度の運動の短いバーストと、その後の短くて強度の低い回復期間が組み込まれています。どちらのプロトコルも、疲労を誘発することなく、トレーニング期間を通じて同等のトレーニング負荷を提供できるように細心の注意を払って調整されました。SEDグループは、他の運動グループと同様に、同じ持久力テストを週に1回4週間受けましたが、パフォーマンスの改善は最小限でした。持久力トレーニングは、心拍出量、最大酸素消費量、およびミトコンドリアの生合成を強化することで認識されています²⁸。しかし、毎週の運動頻度は、水泳パフォーマンスの大幅な変化を引き出すには不十分であることが証明されました。ゼブラフィッシュをMICTトレーニングにかけたところ、トレーニングの3週目以降、水泳パフォーマンスの顕著な向上が観察されました。しかし、その後の週にはそれ以上の改善は見られませんでした。MICTは、個人が最大以下の作業負荷を長期間維持することを含み、平均よりも高い電力出力^{を必要とする22}。最も注目すべきは、HIITグループが最も大幅な改善を示し、わずか2週間のトレーニングでパフォーマンスの大幅な向上が見られ、4週目まで持続したことです。短時間の高強度運動が持久力適応につながることは十分に文書化されていますが、表現型の筋肉シフトを誘発する原因となる特定の運動タイプは、依然として進行中の調査のトピック^です28。

この原稿で提示された研究に関連する競合する金銭的利益がないことを明確にすることが重要です。この作業の結果に影響を与えたり偏ったりする可能性のある組織や団体との金銭的なパートナーシップや提携は確立されていません。この声明は、研究プロセスが単純明快で正直であり、結果に影響を与える財政的対立がなかったことを保証するものです。この作品のプレゼンテーションは、学問への愛情と科学的知識の追求にのみ駆り立てられた、主題に対する真の情熱によって動機付けられています。

オマール・マーティンズ博士には、魚の飼育と検査の実施のために実験室へのアクセスを寛大に提供してくださったことに感謝の意を表します。さらに、この研究を支援するためのフェローシップを授与したFAPESP、CNPq、およびCAPESに謝辞が与えられています。