Method Article
* Эти авторы внесли равный вклад
В этой статье мы опишем метод избирательного изменения экспрессии генов в сосудистом сплетении, избегая при этом какого-либо воздействия на другие области мозга.
Сосудистое сплетение (ЧП) служит важнейшими воротами для инфильтрации иммунных клеток в центральную нервную систему (ЦНС) как при физиологических, так и при патологических состояниях. Недавние исследования показали, что регуляция активности ChP может обеспечить защиту от заболеваний ЦНС. Тем не менее, изучение биологической функции ChP, не затрагивая другие области мозга, является сложной задачей из-за его тонкой структуры. В этом исследовании представлен новый метод нокдауна генов в тканях ChP с использованием аденоассоциированных вирусов (AAV) или белка рекомбиназы фермента циклизации (Cre), состоящего из последовательности TAT (CRE-TAT). Результаты показывают, что после введения AAV или CRE-TAT в боковой желудочек флуоресценция концентрировалась исключительно в ChP. Используя этот подход, исследование успешно сбило рецептор аденозинаА2А (A2AR) в ChP с помощью РНК-интерференции (РНК-интерференции) или Cre/локуса систем X-overP1 (Cre/LoxP) и показало, что этот нокдаун может облегчить патологию экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита (ЭАЭ). Этот метод может иметь важное значение для будущих исследований роли ChP в заболеваниях ЦНС.
Часто считалось, что сосудистое сплетение помогает поддерживать функциональный гомеостаз мозга за счет секреции спинномозговой жидкости (ликвора) и нейротрофического фактора головного мозга (BDNF)1,2. Растущее количество исследований за последние три десятилетия показало, что ChP представляет собой особый путь инфильтрации иммунных клеток в центральную нервную систему (ЦНС).
Плотные соединения (ТЖ) ChP, состоящие из монослойного эпителия ChP, поддерживают иммунологический гомеостаз, предотвращая проникновение макромолекул и иммунных клеток в мозг3. Однако при определенных патологических состояниях ткань ChP обнаруживает и реагирует на опасные молекулярные паттерны (DAMPs) в ликворе и крови, что приводит к аномальной иммунной инфильтрации и дисфункции мозга 4,5. Несмотря на его важнейшую роль, небольшой размер ChP и уникальное расположение в мозге затрудняют изучение его функции, не затрагивая другие области мозга. Таким образом, манипулирование экспрессией генов именно в ChP является идеальным подходом к пониманию его функции.
Первоначально трансгенные линии фермента циклизационной рекомбинации (Cre), экспрессирующие Cre под контролем промоторов, специфичных для генов, экспрессируемых в ChP, обычно использовались для удаления генов-мишеней путем скрещивания с флоксированными генами-кандидатами 6,7,8. Например, транскрипционный фактор Forkhead box J1 (FoxJ1) экспрессируется исключительно в эпителии ChP пренатального мозга мыши7. Так, линия FoxJ1-Cre часто использовалась для удаления генов, расположенных в ChP 6,9. Однако успех этой стратегии в значительной степени зависит от специфики промоутера. Постепенно было обнаружено, что паттерн экспрессии FoxJ1 был недостаточно отчетливым, поскольку FoxJ1 также присутствовал в реснитчатых эпителиальных клетках в других частях мозга и периферической системы7. Для преодоления этого ограничения была проведена интрацеребровентрикулярная (ИКВ) инъекция Cre-рекомбиназы для доставки рекомбиназы в желудочки флоксированных трансгенных линий. Данная стратегия показала высокую специфичность, о чем свидетельствует наличие флуоресценции tdTomato исключительно в ткани ChP10,11. Однако этот метод все еще ограничен наличием флоксированных трансгенных линий мышей. Чтобы решить эту проблему, исследователи использовали ICV-инъекцию аденоассоциированного вируса (AAV) для достижения ChP-специфического нокдауна или гиперэкспрессии генов-мишеней12,13. Комплексная оценка различных серотипов AAV на ChP-инфекцию показала, что AAV2/5 и AAV2/8 проявляют сильные инфекционные способности в ChP, не инфицируя при этом другие области мозга. Тем не менее, было обнаружено, что AAV2/8 инфицирует окружающие эпендиму желудочки, в то время как группа AAV2/5 не показала инфекции14. Преимущество этого метода заключается в преодолении ограничений, связанных с приобретением флоксированных трансгенных животных.
В данной статье описан пошаговый протокол нокдауна гена в ChP с использованием двух методов: ICV AAV2/5, несущей шРНК рецептора аденозина А2А (А2А R) и белкаCre-рекомбиназы, состоящего из последовательности ТАТ (CRE-TAT) рекомбиназы для достижения ChP-специфического нокдауна A2AR. Результаты исследования свидетельствуют о том, что сбивание A2AR в ChP может облегчить экспериментальный аутоиммунный энцефаломиелит (ЭАЭ). Этот подробный протокол содержит полезные рекомендации для изучения функции ChP и специфического нокдауна генов в ChP.
Все процедуры с животными, описанные в этом исследовании, были проведены в соответствии с рекомендациями, изложенными в Руководстве NIH по уходу и использованию лабораторных животных и одобренными Комитетом по уходу и использованию животных в Медицинском университете Вэньчжоу.
1. Животные
2. ChP-специфический нокдаун A 2ARs с AAV2/5-шРНК
3. ChP-специфичный нокдаун A 2AR с Cre/локусом системы X-overP1 (Cre/LoxP)
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие процедуры могут быть выполнены с помощью метода, описанного выше. Подробные методы впрыска см. в шагах 2.1-2.11.
4. Транскардиальная перфузия у мышей
5. Срезы и окрашивание замороженных тканей
6. Индукция ЭАЭ
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте индукцию ЭАЭ через 2 недели после инъекции шРНК или CRE-TAT рекомбиназы11.
7. Оценка неврологического дефицита
8. Окрашивание гематоксилин-эозином (H&E)
9. Количественный анализ полимеразной цепной реакции (кПЦР)
ChP-специфичный нокдаун A2AR путем ICV-инъекции AAV2/5-shRNA или CRE-TAT
РольА2АР в ЧП как мощного регулятора нейронной информации в патогенезе ЭАЭ остается неясной. Подавление экспрессии ChP-специфичного A 2A R может пролить свет на регуляторные эффекты A2AR на центральную иммунную систему при EAE и других воспалениях нервной системы. Вэтом исследовании использовалась внутривенная инъекция CRE-TAT для снижения экспрессии A 2A R в ChP мышей A2AR flox/flox. Для обеспечения специфичности ChP мы сначала вводили CRE-TAT в боковые желудочки мышей Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato (Ai9). Изображения показывают, что спонтанная флуоресценция tdTomato была ограничена тканью ChP (рис. 2). Аналогичным образом, исследование вводило AAV2/5-CMV-A2AR-shRNA-CMV-усиленный зеленый флуоресцентный белок (EGFP) мышам C57BL/6 и обнаружило, что флуоресценция EGFP была ограничена слоем эпителиальных клеток ChP и не инфицировала окружающие паренхиматозные клетки вблизи боковых желудочков (рис. 3).
Индукция EAE с MOG35-55
Для индуцирования стабильной ЭАЭ мышам подкожно вводили эмульсию, состоящую из MOG35-55 и CFA, с последующим внутрибрюшинным введением ПТ на 0-е и 2-е сутки после иммунизации (рис. 4). Шкала клинических симптомов использовалась для ежедневной оценки баллов EAE в зависимости от состояния хвоста и конечностей. Начало ЭАЭ определялось как первый день с оценкой ЭАЭ ≥1, в то время как продолжительность между началом и пиковыми показателями ЭАЭ называлась прогрессирующей стадией.
ChP-специфический нокдаун A2AR облегчает патологию ЭАЭ
Чтобыизучить участие сигнала A 2A R в патологии EAE, в исследовании использовался ChP-специфичный нокдаун A2A R. В исследовании специально сбивали A2AR в ChP с помощью ICV-инъекции CRE-TAT или AAV2/5-A2AR-шРНК. Через 2 недели после нокдауна ЭАЭ индуцировали иммунизацией MOG35-55. Результаты показали, что по сравнению с контрольной группой у мышей с нокдауном A2AR развилась более легкая патология EAE, о чем свидетельствуют более низкие баллы и сниженная инфильтрация иммунных клеток в спинном мозге (рис. 5A,B,E,F). Кроме того, случайным образом были выбраны пять мышей, индуцированных ЭАЭ, из каждой группы на 20-й день после иммунизации MOG35-55. После перфузии PBS ЧП выделяли для экстракции РНК и кПЦР. АнализкПЦР показал, что уровни мРНК A 2A R были явно снижены в группах AAV2/5-shRNA (A2AR-Kd) и CRE-TAT по сравнению с каждой контрольной группой (рис. 5C, D).
Рисунок 1: Анатомическая локализация места инъекции бокового желудочка. (A) Схематическая схема, показывающая точку внедрения вируса. (B) Место инъекции бокового желудочка расположено на 0,58 мм ниже брегмы и на 1,1 мм латеральнее сагиттального шва, как указано красной точкой. (C) Изображение, показывающее место внедрения вируса в мышь. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Локализация флуоресценции tdTomato в ChP . (A,B) Репрезентативное изображение мышей Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato, получавших ICV-инъекцию CRETAT. Через 2 недели аутофлуоресценция tdTomato была специфически локализована в ткани ChP (n = 3/группа). (С,Д) Объединенные изображения автофлуоресценции tdTomato и DAPI. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Репрезентативные изображения мышей C57BL/6, сделанные через 2 недели после введения ICV AAV2/5-scramble-EGFP или AAV2/5-shRNA-EGFP. (A,B) Репрезентативные изображения мышей, которым вводили AAV2/5-scramble-EGFP (n = 3/группа). (С,Д) Репрезентативные изображения мышей, которым вводили AAV2/5-shRNA-EGFP (n = 3/группа). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Индукция модели EAE. (А) Во-первых, эмульсия антигена MOG вводится подкожно в четыре различных места (шея, спина, левое и правое бедра), которые обозначаются красными точками. (Б) ПТ вводится внутрибрюшинно во время иммунизации и повторяется через 2 дня. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: ChP-специфический нокдаун A 2A R облегчал патологию EAE. (A) ChP-специфичный нокдаун A 2A R у мышей A 2AR flox/flox, достигнутый путем введения ICV CRE-TAT, приводил к снижению клинических показателей EAE (n = 6-7/группа). Статистический анализ проводили с использованием двустороннего RM ANOVA с последующим множественным сравнительным тестом Сидака. (B) ChP-специфичный нокдаун A2AR у мышей дикого типа (WT), достигнутый с помощью ICV-инъекции AAV2/5-shRNA, снижал клинические показатели EAE (n = 7-8/группа). Статистический анализ проводили с использованием двустороннего RM ANOVA с последующим множественным сравнительным тестом Сидака. (С,Д) Результаты кПЦР-анализа уровней мРНКА2АР в ткани ХП (n = 5/группа). Статистический анализ проводили с помощью непарного t-критерия. (Д,Ж) Окрашивание H&E. ChP-специфический нокдаун A2AR ослаблял инфильтрацию иммунных клеток в спинной мозг. Статистическая значимость представлена как ###p < 0,001, **p < 0,01 и ***p < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
В исследовании были представлены два различных подхода к направленному нокдауну генов ChP. Первый подход включал в себя ICV-инъекцию CRE-TAT, содержащей Cre-рекомбиназу, мышам линии A2AR flox/flox . Второй подход заключался в введении ICV AAV2/5, несущей шРНКA2AR. Используяэти две стратегии, в работе был достигнут селективный нокдаун A 2A R в ChP и удалось продемонстрировать защитные эффекты ингибирования передачи сигналов A2AR в ChP на патологию EAE. Следует отметить, что этот протокол включает в себя два важных этапа. Во-первых, необходима операция стереотаксической локализации, и значительное отклонение от предложенных координат может привести к случайным сбоям. Во-вторых, объем вводимого вируса имеет решающее значение, так как было обнаружено, что введение менее 1 мкл вируса (~6 x 1012) также имеет определенную вероятность неудачи. Возможно, это связано с необходимостью достаточного количества вирусных частиц для достаточного заражения.
Использование системы Cre/LoxP не позволило наблюдать точное распределение CRE-TAT-рекомбиназы в головном мозге после инъекции ICV. В результате в исследовании использовались мыши Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato для отслеживания распределения CRE-TAT с использованием автофлуоресценции белка tdTomato. Флуоресценция tdTomato была локализована исключительно в тканях ChP через 2 недели после инъекции CRE-TAT интрацеребровентрикулярно, что указывает на то, что рекомбиназа в первую очередь поглощалась ChP. Далее мышам линии A 2A R flox/flox вводили CRE-TAT, и в ткани ChP наблюдалось снижение уровня мРНК A2AR. Эта стратегия направленного нокдауна была использована для изучения роли кортикостероидной сигнализации в ChP в опосредовании психологического стресса17. В качестве альтернативы в исследовании использовался AAV2/5 для доставки шРНК, предназначенной для нацеливания на гены ChP. Предыдущие исследования оценивали инфекционную способность различных серотипов AAV и лентивирусов в тканях ChP и обнаружили, что AAV2/5 и AAV2/8 былинаиболее эффективными. Исследование показало, что AAV2/5 способен инфицировать ChP, не вызывая явных инфекций в других областях мозга. Эти два метода менее трудоемки, чем классические нокаутные стратегии, требующие двух трансгенных линий (Cre и Flox)6,18. Одним из ограничений этого исследования является отсутствие эксперимента с усилением функции с гиперэкспрессией генов. Тем не менее, возможный подход к достижению этой цели заключается в клонировании полной кДНК и упаковке ее в вирус AAV2/5, который будет вводиться через ICV-инфекцию. В предыдущем исследовании было обнаружено, что гиперэкспрессия NKCC1 в ChP с использованием AAV2/5 способствует клиренсу ликвора и уменьшает вентрикуломегалию in vivo9. Важно отметить, что стратегия AAV2/5 или Cre/LoxP имеют свое преимущество. Внутривенное введение CRE-TAT трансгенным мышам обеспечивает высокую эффективность нокдауна, так как ген-мишень удаляется непосредственно из ДНК клеток. Однако этот метод зависит от производства и разведения флоксированных мышей. С другой стороны, инъекция AAV2/5 ICV позволяет избежать трудоемкого процесса разведения трансгенных мышей. Однако нокдаунная эффективность этого метода во многом зависит от производительности спроектированной шРНК. Таким образом, исследователи могут выбрать подходящий метод, исходя из условий эксперимента.
Рассеянный склероз (РС) – это аутоиммунное заболевание, которое вызывает воспаление и демиелинизацию белого вещества в ЦНС19. Для изучения патологических механизмов рассеянного склероза исследователи использовали модель EAE, которая имитирует симптомы заболевания, такие как демиелинизация и иммунная инфильтрация. Эта модель считается идеальной для понимания рассеянного склероза. В 2009 году было обнаружено, что иммунные клетки проникают в ЦНС через ChP, что является ключевым путем проникновения иммунных клеток при патологии рассеянного склероза. «Первая волна» иммунных клеток проникает в ликвор через ЧП, за ней следует «вторая волна», которая проникает в паренхиму головного мозга через ГЭБ20. «Первая волна» иммунных клеток способствует воспалению и ускоряет утечку ГЭБ, поэтому ингибирование иммунной инфильтрации в ChP может быть полезно для раннего вмешательства при рассеянном склерозе. Хемокины и молекулы адгезии регулируют стробящую активность ChP, контролируя способность лимфоцитов проникать через него21,22,23.
В предыдущих исследованиях для изучения сигнальных молекул в ChP, но эти методы не позволяли точно определить их биологическую функцию в патологическом процессе РС. Внедавнем исследовании ученые сбили A 2A R, расположенный в ChP мышей A2AR flox/flox, и обнаружили, что показатели EAE и иммунная инфильтрация былизначительно снижены. Данное исследование подтверждает роль передачи сигналовА2АР в ЧП при патологии ЭАЭ и демонстрирует, что ЧП-специфические методы нокдауна являются полезными инструментами для изучения функции ЧП при патологиях ЦНС.
В заключение, протокол манипуляций, специфичный для ChP, является идеальным инструментом для изучения биологической функции ChP, участвующей в дегенеративных заболеваниях ЦНС, таких как болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера, рассеянный склероз и так далее.
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов или другой информации, которую они могли бы декларировать.
Мы выражаем признательность за поддержку этой работы Национальному фонду естественных наук Китая (грант No 31800903, присужден В. Чжэну) и Вэньчжоускому научно-техническому проекту (No Y2020426, присужден Ю. Ю. Вэну).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
A2ARflox/flox mice | State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Wenzhou Medical University | ||
AAV2/5-A2AR-ShRNA virus | Shanghai Heyuan Biotechnology Co. LTD | pt-4828 | |
antifade mounting medium | Beyotime Biotechnology | 0100-01 | |
borosilicate glass capillary | Beijing Meiyaxian Technology Co. Ltd | B100-50-10 | |
brain stereotaxic apparatus | RWD, Shenzhen | 69100 | |
C57BL/6 mice | Beijing Vital Charles River Laboratory Animal Technology Company | ||
CRE-TAT recombinase | Millipore | SCR508 | |
DAPI | Absin | B25A031 | |
frozen slicing machine | Leica | CM1950 | |
H37Ra | Becton Dickinson and company | 231141 | |
Hamilton syringe | Hamilton, American | P/N: 86259 | |
Incomplete Freunds adjuvant | Sigma | F5506 | |
Laser confocal microscope | Zeiss | LSM900 | |
MOG35-55 | Suzhou Qiangyao Biotechnology Co., LTD | 4010006243 | |
OCT glue | Epredia | 6502p | |
paraformaldehyde | Chengdu Kelong Chemical Reagent Company | 30525-89-4 | |
pentobarbital sodium | Boyun Biotech | PC13003 | |
Pipette gun | Eppendorf | N45014F | |
PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit | Takara | 6110A | |
Real- Time PCR System | BioRad | CFX96 | |
Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato mice | Jackson Laboratory | ||
sucrose | Sangon Biotech | A502792-0500 | |
super high speed homogenizer | IKA | 3737025 | |
Trizol | Invitrogen | 15596026 | |
xylene solution | Chengdu Kelong Chemical Reagent Company | 1330-20-7 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены