Method Article
* These authors contributed equally
במאמר זה אנו מתארים שיטה לשינוי סלקטיבי של ביטויי גנים במקלעת הכורואידים, תוך הימנעות מכל השפעה באזורים אחרים במוח.
מקלעת הכורואיד (ChP) משמשת שער קריטי לחדירת תאי מערכת החיסון למערכת העצבים המרכזית (CNS) בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים כאחד. מחקרים אחרונים הראו כי ויסות פעילות ChP עשוי להציע הגנה מפני הפרעות במערכת העצבים המרכזית. עם זאת, חקר התפקוד הביולוגי של ChP מבלי להשפיע על אזורי מוח אחרים הוא מאתגר בשל המבנה העדין שלו. מחקר זה מציג שיטה חדשנית להפלה גנטית ברקמת ChP באמצעות וירוסים הקשורים לאדנו (AAVs) או חלבון רקומבינאז רקומבינאז (Cyclization recombination enzyme (Cre) המורכב מרצף TAT (CRE-TAT). התוצאות מראות כי לאחר הזרקת AAV או CRE-TAT לחדר הצידי, הפלואורסצנטיות התרכזה באופן בלעדי ב- ChP. באמצעות גישה זו, המחקר הפיל בהצלחה את קולטן אדנוזין A 2A (A2A R) ב- ChP באמצעות הפרעותRNA (RNAi) או Cre/locus של מערכות X-overP1 (Cre/LoxP), והראה כי הפלה זו יכולה להקל על הפתולוגיה של אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE). טכניקה זו עשויה להיות השלכות חשובות על מחקר עתידי על תפקיד ChP בהפרעות CNS.
מקלעת הכורואיד (ChP) נחשבה לעתים קרובות כמסייעת בשמירה על הומאוסטזיס תפקודי במוח על ידי הפרשת נוזל מוחי שדרתי (CSF) וגורם נוירוטרופי מוחי (BDNF)1,2. מחקר הולך וגובר בשלושת העשורים האחרונים גילה כי ChP מייצג מסלול ברור לחדירת תאי מערכת החיסון למערכת העצבים המרכזית (CNS).
הצמתים הצפופים (TJs) של ChP, המורכבים מאפיתל ChP חד-שכבתי, שומרים על הומאוסטזיס חיסוני על ידי מניעת כניסת מקרומולקולות ותאי חיסון למוח3. עם זאת, בתנאים פתולוגיים מסוימים, רקמת ChP מזהה ומגיבה לדפוסים מולקולריים הקשורים לסכנה (DAMPs) ב- CSF ובדם, מה שמוביל לחדירה חיסונית חריגה ולתפקוד לקוי של המוח 4,5. למרות תפקידו הקריטי, גודלו הקטן של ה-ChP ומיקומו הייחודי במוח מקשים על חקר תפקודו מבלי להשפיע על אזורי מוח אחרים. לכן, מניפולציה של ביטוי גנים במיוחד ב- ChP היא גישה אידיאלית להבנת תפקידו.
בתחילה, קווים טרנסגניים של אנזים רקומבינציה מחזורית (Cre), המבטאים Cre תחת שליטתם של מקדמים ספציפיים לגנים המבוטאים ב- ChP, שימשו בדרך כלל למחיקת גני מטרה על ידי רבייה עם גנים מועמדים floxed 6,7,8. לדוגמה, גורם השעתוק תיבת Forkhead J1 (FoxJ1) מתבטא באופן בלעדי באפיתל ChP של מוח העכבר לפני הלידה7. לפיכך, קו FoxJ1-Cre שימש לעתים קרובות למחיקת גנים הממוקמים ChP 6,9. עם זאת, ההצלחה של אסטרטגיה זו מסתמכת במידה רבה על הספציפיות של המקדם. בהדרגה התגלה כי דפוס הביטוי של FoxJ1 אינו ייחודי מספיק, שכן FoxJ1 היה נוכח גם בתאי אפיתל ריסניים בחלקים אחרים של המוח והמערכת ההיקפית7. כדי להתגבר על מגבלה זו, בוצעה הזרקה תוך-מוחית (ICV) של Cre recombinase כדי להעביר רקומבינאז לחדרים של קווים טרנסגניים פלוקסים. אסטרטגיה זו הראתה ספציפיות גבוהה, כפי שמעידה נוכחות של פלואורסצנטיות tdTomato אך ורק ברקמת ChP10,11. עם זאת, שיטה זו עדיין מוגבלת על ידי הזמינות של קווי עכבר טרנסגניים floxed. כדי לטפל בבעיה זו, חוקרים השתמשו בהזרקת ICV של וירוס הקשור לאדנו (AAV) כדי להשיג הפלה ספציפית ל- ChP או ביטוי יתר של גני מטרה12,13. הערכה מקיפה של סרוטיפים שונים של AAV עבור זיהום ChP גילתה כי AAV2/5 ו- AAV2/8 מפגינים יכולות זיהום חזקות ב- ChP, בעוד שאינם מדביקים אזורי מוח אחרים. עם זאת, AAV2/8 נמצא כמדביק את האפנדימה סביב החדרים, בעוד שקבוצת AAV2/5 לא הראתה זיהום14. שיטה זו יש את היתרון של התגברות על המגבלות של רכישת בעלי חיים טרנסגניים floxed.
מאמר זה מתאר פרוטוקול שלב אחר שלב להפלה גנטית ב- ChP באמצעות שתי שיטות: ICV של AAV2/5 הנושא shRNA של קולטן אדנוזין A 2A (A 2A R) וחלבון Cre recombinase המורכב מרקומבינאז רצף TAT (CRE-TAT) כדי להשיג הפלה ספציפית ל- ChP של A2A R. ממצאי המחקר מצביעים על כך שהפלת A2AR ב- ChP יכולה להקל על אנצפלומיאליטיס אוטואימונית ניסיונית (EAE). פרוטוקול מפורט זה מספק הדרכה שימושית למחקרי תפקוד ChP ולפירוק הספציפי של גנים ב- ChP.
כל ההליכים בבעלי חיים המתוארים במחקר זה נערכו בהתאם להנחיות המפורטות במדריך NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטה הרפואית וונג'ואו.
1. בעלי חיים
2. הפלת ChP ספציפית של A2ARs עם AAV2/5-shRNA
3. הפלת ChP ספציפית של A2AR עם Cre/locus של מערכת X-overP1 (Cre/LoxP)
הערה: ניתן להשיג את ההליכים הבאים באמצעות השיטה שתוארה קודם לכן. עיין בשלבים 2.1-2.11 לקבלת שיטות הזרקה מפורטות.
4. זילוח קרום הלב בעכברים
5. חתך רקמות קפואות והכתמה
6. אינדוקציה EAE
הערה: בצע השראת EAE לאחר שבועיים של הזרקת shRNA או CRE-TAT רקומבינאז11.
7. ציון גירעון נוירולוגי
8. צביעת Hematoxylin-eosin (H&E)
9. ניתוח תגובת שרשרת פולימראז כמותי (qPCR)
ChP-specific A2AR knockdown על ידי הזרקת ICV של AAV2/5-shRNA או CRE-TAT
תפקידו של A2AR ב- ChP כמווסת רב עוצמה של מידע עצבי בפתוגנזה של EAE נותר לא ברור. הפלת ביטוי A 2A R ספציפי ל-ChP יכולה לשפוך אור על ההשפעות הרגולטוריות של A2AR על מערכת החיסון המרכזית ב-EAE ודלקות אחרות במערכת העצבים. מחקר זה השתמש בהזרקת ICV של CRE-TAT כדי להפחית ביטוי A 2A R ב- ChP של עכברי A2AR flox/flox. כדי להבטיח את הספציפיות של ChP, הזרקנו תחילה CRE-TAT לחדרים הצדיים של עכברי Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato (Ai9). התמונות מצביעות על כך שהפלואורסצנטיות הספונטנית של tdTomato הוגבלה לרקמת ChP (איור 2). באופן דומה, המחקר נתן חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר AAV2/5-CMV-A2AR-shRNA-CMV (EGFP) לעכברי C57BL/6 ומצא שהפלואורסצנטיות של EGFP הייתה מוגבלת לשכבת תאי האפיתל של ChP ולא הדביקה את התאים הפרנכימליים שמסביב ליד החדרים הצדיים (איור 3).
אינדוקציה EAE עם MOG35-55
כדי לגרום ל-EAE יציב, עכברים הוזרקו באופן תת-עורי עם תחליב המורכב מ-MOG35-55 ו-CFA, ולאחר מכן הזרקה תוך-צפקית של PT בימים 0 ו-2 לאחר החיסון (איור 4). סולם הסימפטומים הקליניים שימש להערכת ציוני EAE מדי יום, בהתבסס על מצב הזנב והגפיים. תחילת EAE הוגדרה כיום הראשון עם ציון EAE ≥1, בעוד שמשך הזמן בין תחילת ציוני EAE לשיא EAE נקרא השלב המתקדם.
ChP-specific A2AR knockdown מקל על פתולוגיה EAE
כדי לחקור את מעורבותו של אות A 2A R בפתולוגיה של EAE, המחקר השתמש בהפלת A2AR ספציפית ל- ChP. המחקר הפיל באופן ספציפי A 2A R ב- ChP באמצעות הזרקת ICV של CRE-TAT או AAV2/5-A2AR-shRNA. שבועיים לאחר ההפלה, EAE הושרה על ידי חיסון MOG35-55. התוצאות הראו שבהשוואה לקבוצת הביקורת, עכברים עם הפלה של A2AR פיתחו פתולוגיה מתונה יותר של EAE, כפי שמעידים ציונים נמוכים יותר וחדירה מופחתת של תאי מערכת החיסון לחוט השדרה (איור 5A,B,E,F). בנוסף, חמישה עכברים שקיבלו EAE מכל קבוצה ביום ה-20 לאחר חיסון MOG35-55 נבחרו באופן אקראי. לאחר זילוח עם PBS, ChPs בודדו עבור מיצוי RNA ו qPCR. ניתוח qPCR הראה כי רמות ה-mRNA של A 2A R ירדו בבירור בקבוצות AAV2/5-shRNA (A2AR-Kd) ו-CRE-TAT, בהשוואה לכל קבוצת ביקורת (איור 5C,D).
איור 1: לוקליזציה אנטומית של אתר הזרקת החדר הצידי. (A) תרשים סכמטי המציג את נקודת הזרקת הנגיף. (B) מקום ההזרקה של החדר הצידי נמצא 0.58 מ"מ מתחת לברגמה ו-1.1 מ"מ רוחבי לתפר הסגיטלי, כפי שמצוין בנקודה האדומה. (C) תמונה המציגה את אתר הזרקת הווירוסים על עכבר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: לוקליזציה של פלואורסצנטיות tdTomato ב-ChP . (A,B) תמונה מייצגת של עכברי Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato שטופלו בהזרקת ICV של CRETAT. שבועיים לאחר מכן, tdTomato autofluorescence היה מקומי במיוחד לרקמת ChP (n = 3 / קבוצה). (ג,ד) התמונות הממוזגות של tdTomato autofluorescence ו- DAPI. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תמונות מייצגות של עכברי C57BL/6 שצולמו שבועיים לאחר הזרקת ICV של AAV2/5-scramble-EGFP או AAV2/5-shRNA-EGFP. (A,B) התמונות המייצגות של עכברים שהוזרקו להם AAV2/5-scramble-EGFP (n = 3/group). (ג,ד) התמונות המייצגות של עכברים שהוזרקו AAV2/5-shRNA-EGFP (n = 3/group). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: אינדוקציה של מודל EAE. (A) ראשית, תחליב האנטיגן MOG מוזרק תת עורית לארבעה מקומות שונים (צוואר, גב, ירכיים שמאליות וימניות), המסומנים בנקודות אדומות. (B) PT מוזרק תוך צפקית בזמן החיסון וחוזר על עצמו יומיים לאחר מכן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: הפלה ספציפית ל-ChP של A 2A R הקלה על פתולוגיית EAE. (A) הפלה-ספציפית ל-ChP של A 2A R בעכברי A2AR flox/flox, שהושגה באמצעות הזרקת ICV של CRE-TAT, הובילה לירידה בציונים הקליניים של EAE (n = 6-7/group). הניתוח הסטטיסטי בוצע באמצעות RM ANOVA דו-כיווני ואחריו מבחן ההשוואה המרובה של סידאק. (B) הפלה ספציפית ל-ChP של A2AR בעכברי בר (WT), שהושגה עם הזרקת ICV של AAV2/5-shRNA, הפחיתה את התוצאות הקליניות של EAE (n = 7-8/קבוצה). הניתוח הסטטיסטי בוצע באמצעות RM ANOVA דו-כיווני ואחריו מבחן ההשוואה המרובה של סידאק. (ג,ד) תוצאות ניתוח qPCR של רמות mRNA A2AR ברקמת ChP (n = 5/group). הניתוח הסטטיסטי בוצע באמצעות מבחן t לא מזווג. (ה,ו) צביעת H&E. ChP ספציפי A2AR להפיל חדירה מוחלשת של תאי החיסון לתוך חוט השדרה. מובהקות סטטיסטית מיוצגת כ- ###p < 0.001, **p < 0.01 ו- ***p <- 0.001. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
המחקר הציג שתי גישות שונות להפלה ממוקדת של גנים ChP. הגישה הראשונה כללה הזרקת ICV של CRE-TAT, המכיל Cre recombinase, לעכברי A2AR flox/flox. הגישה השנייה כללה הזרקת ICV של AAV2/5 הנושא shRNA של A2AR. על ידי שימוש בשתי אסטרטגיות אלה, העבודה השיגה את ההפלה הסלקטיבית של A 2A R בתוך ChP והצליחה להדגים את ההשפעות המגינות של עיכוב איתות A2AR ב- ChP על פתולוגיה של EAE. יש לציין כי פרוטוקול זה כולל שני שלבים מכריעים. ראשית, פעולת הלוקליזציה הסטריאוטקסית היא חיונית, וסטייה משמעותית מהקואורדינטות המוצעות עלולה לגרום לכשלים אקראיים. שנית, נפח הנגיף המוזרק הוא קריטי, שכן נמצא כי הזרקת פחות מ 1 μL של וירוס (~ 6 x 1012) יש גם סיכוי מסוים לכישלון. ייתכן שהסיבה לכך היא הצורך בכמות מספקת של חלקיקי נגיף להדבקה מספקת.
השימוש במערכת Cre/LoxP לא איפשר תצפית על הפיזור המדויק של רקומבינאז CRE-TAT במוח לאחר הזרקת ICV. כתוצאה מכך, המחקר השתמש בעכברי Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato כדי לעקוב אחר התפלגות CRE-TAT באמצעות אוטופלואורסצנטיות של חלבון tdTomato. פלואורסצנטיות tdTomato הייתה ממוקמת באופן בלעדי ברקמות ChP שבועיים לאחר הזרקת CRE-TAT תוך רצית, מה שמצביע על כך שהרקומבינאז נספג בעיקר על ידי ChP. לאחר מכן, CRE-TAT ניתן לעכברי A 2A R flox/flox, ונצפתה ירידה ברמות A2AR mRNA ברקמת ChP. אסטרטגיית הפלה ממוקדת זו שימשה לחקר התפקיד של איתות קורטיקוסטרואידים ב- ChP בתיווך מתח פסיכולוגי17. לחלופין, המחקר השתמש ב- AAV2/5 כדי לספק shRNA שנועד להתמקד בגנים ChP. מחקרים קודמים העריכו את יכולת ההדבקה של סרוטיפים שונים של AAVs ולנטי-וירוסים ברקמת ChP ומצאו כי AAV2/5 ו-AAV2/8 היו14 היעילים ביותר. המחקר גילה כי AAV2/5 היה מסוגל להדביק את ChP באופן ספציפי מבלי לגרום לזיהומים ברורים באזורים אחרים במוח. שתי שיטות אלה פחות מייגעות מאסטרטגיות נוקאאוט קלאסיות הדורשות שני קווים טרנסגניים (קווי Cre ו- Flox)6,18. מגבלה אחת של מחקר זה היא היעדר ניסוי רווח של תפקוד עם ביטוי יתר של גנים. עם זאת, גישה אפשרית להשיג זאת תהיה לשכפל את ה- cDNA המלא ולארוז אותו לתוך וירוס AAV2/5, אשר ינוהל באמצעות זיהום ICV. במחקר קודם, ביטוי יתר של NKCC1 ב- ChP באמצעות AAV2/5 נמצא כמקדם פינוי CSF ומפחית את החדריות in vivo9. חשוב לציין כי לאסטרטגיית AAV2/5 או Cre/LoxP יש יתרון משלהם. הזרקת ICV של CRE-TAT לעכברים טרנסגניים מבטיחה יעילות הפלות גבוהה, מכיוון שגן המטרה נמחק ישירות מהדנ"א של התאים. עם זאת, שיטה זו תלויה בייצור ורבייה של עכברים פלוקסים. מצד שני, הזרקת ICV של AAV2/5 מונעת את התהליך הגוזל זמן של גידול עכברים טרנסגניים. עם זאת, יעילות הפליטה של שיטה זו תלויה במידה רבה בביצועים של shRNA מתוכנן. לכן, החוקרים יכולים לבחור שיטה מתאימה על סמך תנאי הניסוי שלהם.
טרשת נפוצה (MS) היא מחלה אוטואימונית הגורמת לדלקת ודה-מיאלינציה של החומר הלבן במערכת העצבים המרכזית19. כדי לחקור את המנגנונים הפתולוגיים של טרשת נפוצה, חוקרים השתמשו במודל EAE המדמה את תסמיני המחלה, כגון דמיאלינציה וחדירה חיסונית. מודל זה נחשב אידיאלי להבנת טרשת נפוצה. בשנת 2009 התגלה כי תאי מערכת החיסון חודרים למערכת העצבים המרכזית דרך ChP, שהוא נתיב מפתח לכניסת תאי מערכת החיסון בפתולוגיה של טרשת נפוצה. "הגל הראשון" של תאי החיסון נכנס CSF דרך ChP, ואחריו "הגל השני", אשר נכנס פרנכימה המוח דרך BBB20. "הגל הראשון" של תאי מערכת החיסון מקדם דלקת ומאיץ דליפת BBB, כך שעיכוב חדירת מערכת החיסון ב- ChP יכול להיות שימושי להתערבות מוקדמת בטרשת נפוצה. כימוקינים ומולקולות הידבקות מווסתים את פעילות ה- gating של ChP, ושולטים ביכולתם של לימפוציטים לחדור דרכו21,22,23.
מחקרים קודמים השתמשו בנוקאאוט של כל הגוף או בטכנולוגיה פרמקולוגית (כגון נוגדנים מנטרלים) כדי לחקור מולקולות איתות ב- ChP, אך שיטות אלה לא הגדירו במדויק את תפקידן הביולוגי בתהליך הפתולוגי של טרשת נפוצה. במחקר שנערך לאחרונה, חוקרים הפילו A 2A R, הממוקם ב- ChP של עכברי A2AR flox/flox, ומצאו כי ציוני EAE וחדירה חיסונית הופחתו באופן משמעותי11. מחקר זה מאשר את התפקיד של איתות A2AR ב- ChP במהלך פתולוגיה של EAE ומדגים כי שיטות דפיקה ספציפיות ל- ChP הן כלים שימושיים לחקר תפקוד ChP בפתולוגיות CNS.
לסיכום, פרוטוקול המניפולציה הספציפי ל- ChP הוא כלי אידיאלי לחקור את הפונקציה הביולוגית של ChP המעורב במחלות ניווניות במערכת העצבים המרכזית, כגון מחלת פרקינסון, מחלת אלצהיימר, טרשת נפוצה וכן הלאה.
המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים או גילויים אחרים להצהיר.
אנו מודים בהכרת תודה על תמיכתן של הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק מס '31800903, שהוענק ל- W. Zheng) ופרויקט המדע והטכנולוגיה של וונג'ואו (מס 'Y2020426, הוענק ל- Y. Y. Weng) על עבודה זו.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
A2ARflox/flox mice | State Key Laboratory of Ophthalmology, Optometry and Visual Science, Wenzhou Medical University | ||
AAV2/5-A2AR-ShRNA virus | Shanghai Heyuan Biotechnology Co. LTD | pt-4828 | |
antifade mounting medium | Beyotime Biotechnology | 0100-01 | |
borosilicate glass capillary | Beijing Meiyaxian Technology Co. Ltd | B100-50-10 | |
brain stereotaxic apparatus | RWD, Shenzhen | 69100 | |
C57BL/6 mice | Beijing Vital Charles River Laboratory Animal Technology Company | ||
CRE-TAT recombinase | Millipore | SCR508 | |
DAPI | Absin | B25A031 | |
frozen slicing machine | Leica | CM1950 | |
H37Ra | Becton Dickinson and company | 231141 | |
Hamilton syringe | Hamilton, American | P/N: 86259 | |
Incomplete Freunds adjuvant | Sigma | F5506 | |
Laser confocal microscope | Zeiss | LSM900 | |
MOG35-55 | Suzhou Qiangyao Biotechnology Co., LTD | 4010006243 | |
OCT glue | Epredia | 6502p | |
paraformaldehyde | Chengdu Kelong Chemical Reagent Company | 30525-89-4 | |
pentobarbital sodium | Boyun Biotech | PC13003 | |
Pipette gun | Eppendorf | N45014F | |
PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit | Takara | 6110A | |
Real- Time PCR System | BioRad | CFX96 | |
Rosa-LSL (Lox-StoP-Lox)-tdTomato mice | Jackson Laboratory | ||
sucrose | Sangon Biotech | A502792-0500 | |
super high speed homogenizer | IKA | 3737025 | |
Trizol | Invitrogen | 15596026 | |
xylene solution | Chengdu Kelong Chemical Reagent Company | 1330-20-7 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved