Скрининг для Термотога маритима Мембрана-Связанные пирофосфаза ингибиторы

Здесь мы представляем метод скрининга для мембранной связаны пирофосфатазы (от Thermotoga maritima) ингибиторы на основе молибдена синяя реакция в 96 хорошо пластины формате.

Мембрана связаны пирофосфазазов (mPPases) являются димерические ферменты, которые встречаются в бактериях, археях, растений и протист паразитов. Эти белки расщепивают пирофосфат на две молекулы ортофосфата, которые соединяют с протоном и/или ионом натрия, перекачивающимися по мембране. Поскольку никаких гомологических белков не происходит у животных и людей, mPPases являются хорошими кандидатами в разработке потенциальных целей наркотиков. Здесь мы представляем подробный протокол для проверки ингибиторов mPPase с использованием молибдена синяя реакция в 96 хорошо пластины системы. Мы используем mPPase из термофильной бактерии Thermotoga maritima (TmPPase) в качестве образцового фермента. Этот протокол прост и недорог, что дает стабильный и надежный результат. Завершение протокола оценки активности занимает всего около часа с начала ассеидов до измерения абсорбции. Так как синий цвет, произведенный в этом анализе, стабилен в течение длительного периода времени, последующий анализ (ы) может быть выполнен сразу после предыдущей партии, а абсорбция может быть измерена позже для всех партий сразу. Недостатком этого протокола является то, что это делается вручную и, таким образом, может быть утомительным, а также требуют хороших навыков пайпеттинга и хранения времени. Кроме того, раствор арсенита,цитрата, используемый в этом ассее, содержит арсенит натрия, который является токсичным и должен быть обработан с необходимыми мерами предосторожности.

Приблизительно 25% от общего количества клеточных белков являются мембранными белками и около 60% из них являются лекарственными целями^1,2. Одной из потенциальных целей препарата³, мембранно-связанных пирофосфатазы (mPPases), являются димерические ферменты, которые перекачивают протон и / или ион натрия через мембрану путем гидролизза пирофосфата в два ортофосфата⁴. mPPases можно найти в различных организмах^5, таких как бактерии, археи, растения и протеистовые паразиты, за исключением людей и животных⁴. В протеист паразитов, например Plasmodium falciparum, Toxoplasma gondii и Trypanosoma brucei, mPPases имеют важное значение для паразита вирулентности⁶ и нокаут этого выражения у паразитов привести к сбою в поддержании внутриклеточного рН при воздействии на внешние основные рН⁷. Из-за их важности и отсутствия гомологиального белка, присутствующем у позвоночных, mPPases можно рассматривать в качестве потенциальных целей препарата для протистальных заболеваний³.

Скрининг ингибиторов mPPase в пробирке в этой работе основан на модели системы TmPPase. TmPPase является натрия ионнасоса и калий ионзависимых mPPase от T. maritima и имеет свою оптимальную активность на 71 C⁸. Преимуществами этого фермента являются, например, его легкость в производстве и очистке, хорошая тепловая устойчивость и высокая специфическая активность. TmPPase показывает как высокое сходство в дополнение к полному сохранению позиции, так и идентичность всех каталитических остатков к протеистам mPPases^3,9 и к разрешенной структуре Vigna radiata¹⁰ mPPase. Доступные структуры TmPPase в различных конформациях также полезны для эксперимента по проектированию лекарств на основе структуры (как виртуальный скрининг и de novo design).

Здесь мы сообщаем подробный протокол для скрининга ингибиторов TmPPase в формате 96 хорошо пластины (Рисунок 1). Протокол основан на колоритном методе молибдена голубой реакции, который был впервые разработан Fiske и Subbarow¹¹. Этот метод включает в себя образование 12-фофофомолибдовой кислоты из ортофосфата и молибдата в кислых условиях, которая затем уменьшается, чтобы дать характерные синего цвета фофофомолибдин видов¹².

1. Препарат протеина

ПРИМЕЧАНИЕ: Выражение и очищение TmPPase было описано в другом месте¹³.

1. Приготовьте 10 мл буферного раствора реактивации, содержащего 20 мМ2-(N-морфолино)этанесульфоновая кислота (MES) pH 6.5, 3.5% (v/v) глицерол, 2 мМ дитиотрейтол (DTT), и 0,05% dodecyl maltoside (DDM).
2. Приготовьте 10 мл реакционной смеси, содержащей 200 мм Tris-Cl pH 8.0, 8.0 mM MgCl₂, 333 мМ KCl, и 67 мм NaCl.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Mg^{2 "требуется,} чтобы хелат пирофосфат, как субстрат mPPase, K^q требуется для увеличения активности фермента, как TmPPase является калий зависимых mPPase, и Na^q необходимо для фермента деятельности во время ионного транслокации натрия TmPPase.
3. Приготовьте 30 мг/мл липосом для реактивации ферментов.
   1. Добавьте 10 мл 20 мм Tris-HCl pH 8.0 с 1 мМ DTT до 0,3 г L-й-фосфатидиилхолина из сои до 10 мл 20 мм Tris-HCl pH 8.0 с 1 мм DTT.
   2. Положите липосому на лед, и sonicate с 1 секунды интервал импульса в течение 1 минуты, пауза в течение 1 минуты, и повторить, пока раствор становится прозрачным желтым.
   3. Aliquot липосомы, заморозить в жидком азоте и хранить при -80 градусов по Цельсию до использования.
4. Реактивируйте фермент.
   1. Смешайте 40 зл раствора липосом с 22,5 л 20% ДДМ.
   2. Нагрейте смесь при температуре 55 градусов по Цельсию в течение 15 минут и дайте ей остыть до комнатной температуры.
   3. Добавьте 36,5 л раствора буфера реактивации, смешайте и добавьте 1 кл/л концентрированного белка (13 мг/мл), чтобы сделать общую концентрацию 0,13 мг/мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Белок обычно замораживается в 10 аликотах после очистки и оттаивает на льду перед использованием.
5. Возьмите 20 qL реактивированного фермента и добавьте к 1480 л реакционной смеси, затем аккуратно перемешайте.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление реактивированного фермента в реакционную смесь должно быть выполнено непосредственно перед его усвоение.

2. Комплексная подготовка

1. Растворите соединения в диметилсульфодоксид (DMSO), чтобы сделать запас решения 25-100 мМ в 50-200 мл, на основе наличия соединений.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все соединения, используемые здесь (Рисунок 2A) были опубликованы ранее⁹. Если растворимость соединения низкая, концентрация запасов может быть соответствующим образом скорректирована.
2. Подготовьте три различные концентрации каждого соединения в воде.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательные концентрации в реакционной смеси будут 1, 5 и 50 микромоляров или 1, 5 и 20 микромолярных для растворимых и экономно растворимых соединений, соответственно.
   1. Разбавить бульонраствора водой до 1 мл в микротрубках, чтобы дать 2 ММ, 10 мкм и 100 мкм для растворимых соединений, или же 2 мкм, 10 мкм и 40 мкм для экономно растворимых соединений.
   2. Vortex раствор соединения мгновенно после разбавления бульона раствор для правильного смешивания.
3. Проверьте наличие агрегации соединений с помощью нефелометра.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это было изучено как трипликируется в трех концентрациях (1 МКм, 5 мкм и 20 мкм) и нормализовалось до заготовки в 96 скважинной пластине.
   1. Распределите 75 л реакционной смеси в каждую скважину с помощью многоканального пипетки.
   2. Добавьте 75 кл.с каждого соединения (для пустого, используйте 75 л воды вместо) и смешайте путем pipetting вверх и вниз 5 ".
   3. Измерьте каждый колодец при 300 В с помощью микроплитного нефелометра.

3. Реагенты для подготовки к ассею

1. Приготовьте раствор арсенитов-цитрата.
   1. Взвесить 5 г арсенита натрия и 5 г тринатриевого цидрара.
      ВНИМАНИЕ: Арсенит натрия является токсичным, поэтому используйте надлежащее защитное оборудование и ручку с особой осторожностью. В качестве меры предосторожности, не обрабатывать, прежде чем все необходимые меры предосторожности были прочитаны и поняты. Ручка только в дым овой капот, чтобы не вдыхать пыль / пары соединения или его решения (ы). При вдыхании, перейти на свежий воздух и получить медицинскую помощь. Носите соответствующие химические защитные очки безопасности, защитные перчатки и одежду, чтобы избежать приема и глаз / кожи контакта. При проглатывании немедленно позвоните в токсикологический центр или к врачу/врачу. Если он попадает на кожу или в глаза (ы), мыть с большим количеством воды и получить медицинскую помощь.
   2. Растворите в 100 мл воды.
   3. Добавьте 5 мл ледниковой уксусной кислоты, перемешайте и добавьте воду до 250 мл.
   4. Хранить при комнатной температуре, защищенной от света.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Решение стабильно уже более года.
2. Подготовьте решение А и решение B.
   1. Для раствора А добавьте 10 мл ледяного холода 0,5 м ЛЦ до 0,3 г аскорбиновой кислоты. Растворите аскорбиновую кислоту путем вихря.
   2. Для раствора B добавьте 1 мл ледяной воды в 70 мг гептамолибта аммония тетрагидрат и вихрь для растворения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Храните оба раствора на льду до использования. Для согласованности результата, оба решения могут храниться на льду в течение максимум одной недели.
3. Подготовьте фосфат (P_i) стандарт с концентрацией 0 мкм, 62,5 мкм, 250 мкм и 500 мкм для калибровки.
   1. Добавьте к четырем микротрубам, содержащим 370 л реакционных смесей, 0 qL, 25 qL, 50 л и 100 мКм 5 мМ Na₂HPO₄ dihydrate.
   2. Сверху до 1 мл с водой.

4. Деятельность асссы для одного 96 хорошо пластины

ПРИМЕЧАНИЕ: См. Рисунок 1 для схематического рабочего процесса асссея.

1. Добавьте 1 мл раствора B до 10 мл раствора А, перемешайте путем вихря и храните раствор на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это решение должно быть прозрачным и желтым. Храните раствор А и В на льду в течение не менее 30 минут до его использования. Тем не менее, использовать решение в течение 3 ч, как это будет идти плохо после длительного хранения.
2. Добавьте 40 qL 0 мкм, 62.5 мкм, 250 мкм и 500 мкм P_i стандарт к прокладкам трубки в тройнике с помощью многоканального пипетка.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Реакция смесь без P_я добавил будет использоваться в качестве пробела.
3. Добавьте 25 зл и слой катактного раствора к прокладке трубки с помощью многоканального пипетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Каждое соединение имеет три различных концентрации в тройной, которая достаточна для первоначальной оценки половины максимальной ингибирующей концентрации (IC_50). Для более точного определения IC₅₀ можно использовать восемь различных концентраций соединений. Для раскованного фермента раствор соединения заменяется равным количеством воды. В качестве положительного контроля были использованы 2,5 мкм, 25 мкм и 250 мкм соли натрия имидодифосфата (ВПЛ).
4. Добавьте 15 юртей смеси раствора mPPase к прокладкам пробки (за исключением трубок, содержащих стандарт P_i) с помощью многоканальной пипетки.
5. Печать полоски трубки с клейу уплотнения листа. Вырезать уплотнения лист, чтобы отделить каждую полосу трубки.
6. Предварительно инкубировать образцы в течение 5 мин при 71 градусах Цельсия. Поместите образцы на нагревательный блок с интервалом 20 с интервалом между каждой полосой, чтобы свести к минимуму время потребления во время последующих шагов.
7. Для каждой полосы откройте клейгерие. Добавьте 10 л из 2 мМ пирофосфата натрия dibasic с помощью многоканальной пипетки и перемешайте трубацией вверх и вниз в течение 5 ". Печать полосы трубки снова с помощью того же уплотнения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может быть первоначально трудно выполнить в 20 с; однако, это станет легче после некоторых анализов.
8. Инкубировать при 71 градусах по Цельсию в течение 5 мин.
9. Поместите образцы на охлаждающий аппарат с интервалом 20 с интервалом между каждой полосой. Дайте им остыть в течение 10 мин, но центрифуга каждой полосе кратко после 5 минут охлаждения, чтобы decant капли воды под уплотнительного листа, а затем положить его обратно в охлаждающий аппарат и удалить уплотнения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Охлаждающий аппарат может быть просто сделано путем размещения 96 хорошо ПЦР пластины на полистирол Петри блюдо (размер 150 мм и 15 мм) заполнены водой и заморожены, по крайней мере 1 ч. Аппарат должен быть вывезен из морозильной камеры около 5 минут до начала асссе. Не вынимайте охлаждающий аппарат прямо перед охлаждением образца, так как он заморозит реакционную смесь и затруднит развитие цвета.
10. После 10 минут охлаждения добавьте 60 л раствора А и В, смешайте трубачат вверх и вниз в течение 5 "и держите прокладки трубки на охлаждающем аппарате в течение 10 минут.
11. Добавьте 90 л раствора арсенита и держите при комнатной температуре не менее 30 минут, чтобы создать стабильный синий цвет.
    ВНИМАНИЕ: Из-за своей токсичности все растворы, содержащие арсенит натрия, должны быть обработаны с дополнительной осторожностью в любое время. Таким образом, добавление раствора арсенита-цитрата должно быть сделано в дымовом капюшоне.
12. Распределите 180 л каждой реакционной смеси в чистую 96 скважину полистирола микроплитой.
13. Измерьте абсорбцию каждой скважины на уровне 860 нм с помощью микроплитного спектрофотометра.

5. Анализ результатов

1. Среднее трипликации каждого образца и стандарты P_i. Затем вычесть с пустым для устранения фонового сигнала.
2. Сделайте кривую калибровки, назначая значения абсорбции (A₈₆₀₎на фоне значения стандарта P_i (nmol) и выполните линейную регрессию для получения функции тренда с помощью следующей формулы:
   
3. Рассчитайте количество фосфатов (нмол), высвобожденое из ферментатической реакции на основе формулы линейной регрессии выше.
4. Рассчитайте конкретное занятие с помощью следующей формулы:
   
   где nP_i - это количество фосфатов, выделяемых в результате реакции (нмол), т время реакции (мин), а m_TmPPase - это количество чистого TmPPase, используемого в ассе (мг).
5. Рассчитайте процентную активность для каждой концентрации ингибитора, используя следующую формулу:
   
   где SA_isспецифическая деятельность образца с ингибитором и SA_un специфическая деятельность раскованного образца.
6. Рассчитайте logIC₅₀ (оценка) и IC₅₀ (оценка) с нелинейным регрессией, подходящей из кривой доза-реакции из четырех параметров, используя следующую формулу:
   
   где X является журнал концентрации (ММ), Y является активность (%), Сверху и снизу являются плато в том же блоке, как Y (100% и 0%, соответственно), logIC₅₀ имеет те же единицы журнала, как X, и HillSlope - фактор наклона или склон аплода, который является безеленным.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение (Таблица материалов) используется для установки. Используйте концентрацию 0,01 мкм (вместо 0,00 мкм) для образца без ингибитора, так как logarithm нуля не определен.

В этом протоколе, восемь соединений (рисунок 2A ) были протестированы(Рисунок 2A) вместе с ВПЛ, общим ингибитором пирофосфатаз, в качестве положительного контроля. Каждое соединение было протестировано в трех различных концентрациях (1 МКм, 5 мкм и 20 мкм) в тройном. Рабочий процесс скрининга изображен на рисунке 1,начиная с подготовки образца и реагента до измерения абсорбции на уровне 860 нм.

В конце этого протокола, после добавления раствора А З В и арсенит-цитрат, растворы развивают стабильный синий цвет с максимальным поглощением на уровне 709 нм и 860 нм¹⁴ благодаря сложному образованию фосфатных ионов с молибдатом, которые можно наблюдать и показывает возникновение ферментатической реакции. Для этого эксперимента, мы используем абсорбцию на 860 нм для измерения P_I количество освобождено, как он имеет лучший предел обнаружения и чувствительность по сравнению с абсорбцией на 709 нм¹⁵. Синий цвет полностью развит в 30 минут инкубации при комнатной температуре и стабилен, по крайней мере 5 ч^14. Анализ имеет чувствительность до P_i концентрации 10 мкм и абсорбции является линейным в течение диапазона концентрации 10-800 мкм¹⁴. В репрезентативном результате здесь, скважины E1'E3(Рисунок 2C) содержат реакционную смесь без ингибитора и синий раствор может наблюдаться в конце ассе. Это также можно наблюдать при низких концентрациях соединения, где полное ингибирование не было достигнуто, как и в скважинах F1-F3 для ВПЛ и скважин A4-A6 для соединения 1 (ATC, недавно известный неконкурентоспособный ингибитор TmPPase⁹) при концентрации 2,5 мкм и 1 МКм, соответственно. Чем выше концентрация ВПЛ и соединения 1,тем меньше синего цвета можно наблюдать (G1-G3 и H1-H3 для ВПЛ и B4-B6 и C4-C6 для соединения 1),что указывает на ингибирование ферментатической активности. Все три концентрации неингибирующих соединений(2, 3и 8)отображаются с той же интенсивностью синего цвета, что и скважины E1-E3 без ингибитора(рисунок 2С).

После измерения абсорбции на уровне 860 нм данные могут быть обработаны и проанализированы (см. раздел протокола 5). На рисунке 2D показан калибровочный участок стандарта P_i с его линейной фитингом (y 0.0576x 0.0019; р² и 0,999). На рисунке 3 показан сюжет ферментативной деятельности (%) против концентрации каждого исследуемого соединения. Для соединений с ингибирующей активностью также показана нелинейная кривая установка. ВПЛ, используемые в качестве позитивного контроля, ясно свидетельствуют о снижении активности при более высокой концентрации. IC₅₀ (оценка), рассчитанная на основе трех различных концентраций, составляет 88,2 мкм(таблица 1),что аналогично предыдущему измерению (80,0 мкм) с восемью концентрационными точками^14. Соединения 1, 4, 5, 6, и 7 показали аналогичную тенденцию, как ВПЛ, так как концентрация увеличилась с IC₅₀ (оценка) примерно 1,3 мкм, 7,4 мкм, 19,0 мкм, 37,4 мкм, и 156,1 мкм, соответственно(таблица 1). Для соединений 2, 3и 8 не может быть замечено снижение активности или ингибирования при концентрациях асссе. Дополнительный ассс с восемью точками концентрации может быть сделано для создания точного IC_50. На рисунке 4 показана кривая торможения для соединений 1, 5, 6, 7 и 8 с IC₅₀ из 1,7 мкм, 21,4 мкм, 58,8 мкм, 239,0 мкм и йgt;500 мкм, соответственно⁹.

Рисунок 1: Схематический рабочий процесс ингибирования TmPPase в формате 96 скважин. Красная нумеровка показывает шаги ассеа в соответствии с протоколом, а синие стрелки показывают интервальный ордер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Образцы, их расположение и развитие цвета в 96 хорошо пластины. (A) Структуры соединений 1и8, используемых для асссе. Ингибирующая активность этих соединений была зарегистрирована в Vidilaseris и др.⁹. (B) Схема образца. (C) Развитие цвета, 30 мин после добавления раствора арсенита-цитрата. Концентрации контрольного ингибитора (IdP) и используемых образцов, расположенных сверху донизу, составляют 2,5 мкм, 25 мкм и 250 мкм концентрации и 1 МКм, 5 мкм и 20 мкм концентрации, соответственно. Интенсивность синего цвета соответствует количеству P_i, выпущенного из-за ферментативной реакции, а отсутствие цвета не соответствует ферментативной реакции. (D) Кривая калибровки для стандарта P_i (nmol) против A₈₆₀ с линейной фитингом (y 0.0576x 0.0019; р² и 0,999). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3: Кривая активности TmPPase процентов для трех различных концентраций ингибитора. Кривые нелинейной регрессии для расчета IC₅₀ (оценка) показаны для ВПЛ, а также для соединений 1, 4, 5, 6 и 7, но не для соединений 2, 3и 8, поскольку они не подавляют активность TmPPase в концентрациях. LogIC₅₀ и IC₅₀ (оценка) каждого соединения показаны в таблице 1. Все данные отображаются как средние SD с тремя репликациями. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 4: Кривая ингибирования из восьми точек концентрации соединений 1, 5, 6, 7 и 8. Эта цифра взята из Vidilaseris и др.⁹ с небольшими изменениями. Все данные отображаются как средние SD с тремя репликациями. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Таблица 1: LogIC₅₀ и IC₅₀ (оценка) ВПЛ и соединений 1'8 на основе данных на рисунке 3.

Здесь мы сообщаем подробный протокол для простого скрининга ингибиторов для мембранной пирофосфатазы от T. maritima в 96 хорошо пластины форматна на основе Vidilaseris и др.¹⁴. Этот протокол недорог и основан на 12-фофофофлибдной кислоте, которая образуется из ортофосфата и молибдата в кислых условиях и сводится к фофофомолибдному виду с отчетливым синим цветом¹². Этот метод является предпочтительным по сравнению с другими протоколами, такими как более чувствительный малахит зеленый ассса¹⁶, потому что этот метод не показывает вмешательства в наличие высокой концентрации фосфолипидов, которая необходима для реактивации TmPPase¹⁴.

Рабочий процесс протокола скрининга изображен на рисунке 1, и этот процесс может быть полностью выполнен в 1 ч. Этот протокол оптимизирован для TmPPase с оптимальной рабочей температурой в 71 градусов по Цельсию и 5 минут времени реакции. Поскольку вода будет испаряться при такой температуре от реакционной смеси, клейовый уплотнительный лист (нарезанный, чтобы соответствовать и покрывать полоски) применяется для предотвращения испарения¹⁴ и испаряется вода просто вспоминается с центрифугированием. 5 мин инкубации время выбрано, как он все еще находится в линейном диапазоне ферментативно выпустила фосфат и достаточно для надежного скрининга¹⁴. В этом протоколе, сроки и трубач ные навыки являются важными факторами для получения хорошего и надежного результата. Добавление реагентов во время асссеса с интервалом 20 с интервалом между полосами является оптимизированным вариантом синхронизации для удобства выполнения последующих шагов.

Для различных mPPases оптимальная температура и время инкубации должны быть определены отдельно перед использованием в ингибировании асссеев. Протокол реактивации ферментов выше оптимизирован для TmPPase и других mPPases, возможно, потребуется другой протокол реактивации. Например, DDM не следует добавлять для реактивации mPPase из Pyrobaculum аэрофилума, как это снизит его ферментативной активности¹⁷. Поскольку фермент станет менее активным, если его готовить заблаговременно, добавление реактивированного фермента следует добавить в реакционную смесь незадолго до начала проверки. После добавления раствора арсенита-цитрата реакционный продукт стабилен не менее 5 ч^14. Таким образом, следующая партия ассеа может быть выполнена немедленно, и измерение абсорбции может быть сделано позже для всех партий сразу.

Авторам нечего раскрывать.

Эта работа была поддержана грантами от Фонда Джейн и Аатоса Эркко и BBSRC (BB/M021610) Адриану Голдману, Финляндская академия (No 308105) Кени Видилазерису (No 310297) Анри Хаарду и (No 265481) Яри Или-Каухалуоме, а Исследовательский фонд Хельсинкского университета - Густаву Бойе аф Геннесу. Авторы благодарят Бернадетт Гель за техническую помощь во время проекта.