Triagem para inibidores da pirofosia ligada à membrana de maritoga

Aqui apresentamos um método de triagem para inibidores de pirofosfatase ligado à membrana (da Thermotoga maritima)com base na reação azul molibdênio em um formato de placa de 96 poços.

Pirofosfatases ligadas à membrana (mPPases) são enzimas diméricas que ocorrem em bactérias, arqueais, plantas e parasitas protistas. Estas proteínas acovardam o pirofosfato em duas moléculas de ortofosfato, que é acoplado com próton e / ou íon de sódio bombeamento através da membrana. Como não existem proteínas homólogas em animais e humanos, os mPPases são bons candidatos na concepção de potenciais alvos de drogas. Aqui apresentamos um protocolo detalhado para a tela para inibidores de mPase utilizando a reação azul molibdênio em um sistema de placa de 96 poços. Usamos mPase da bactéria termofílica Thermotoga maritima (TmPPase) como uma enzima modelo. Este protocolo é simples e barato, produzindo um resultado consistente e robusto. Leva apenas cerca de uma hora para concluir o protocolo de ensaio de atividade desde o início do ensaio até a medição de absorção. Uma vez que a cor azul produzida neste ensaio é estável por um longo período de tempo, ensaio (s) subseqüente pode ser realizado imediatamente após o lote anterior, e a absorção pode ser medida mais tarde para todos os lotes de uma só vez. A desvantagem deste protocolo é que ele é feito manualmente e, portanto, pode ser desgastante, bem como exigir boas habilidades de pipetting e tempo de manutenção. Além disso, a solução arsenite-citrate usada neste ensaio contém arsenita de sódio, que é tóxica e deve ser tratada com as precauções necessárias.

Aproximadamente 25% do total de proteínas celulares são proteínas da membrana e cerca de 60% delas são alvos de drogas^1,2. Um dos alvos potenciais da droga³, pirofosfofases ligados à membrana (mPPases), são enzimas diméricas que bombeiam próton e/ou íon de sódio através da membrana por hidróforadede de pirofosfato em dois ortopofosfatos⁴. mPPases podem ser encontrados em vários organismos^5, como bactérias, archaea, plantas e parasitas protistas, com exceção de seres humanos e animais⁴. Em parasitas protistas, por exemplo Plasmodium falciparum, Toxoplasma gondii e Trypanosoma brucei, mPPases são essenciais para a virulência parasita⁶ e nocaute desta expressão nos parasitas levam à incapacidade de manter pH intracelular após a exposição ao pH básico externo⁷. Devido à sua importância e falta de proteína homóloga presente nos vertebrados, os mPPases podem ser considerados como alvos potenciais de medicamentos para doenças protistais^3.

A triagem in vitro dos inibidores de mPase neste trabalho é baseada em um sistema modelo TmPPase. TmPPase é um bombeamento de íons de sódio e mPase dependente de íons de potássio de T. maritima e tem sua atividade ideal em 71 °C⁸. Os benefícios desta enzima são, por exemplo, a sua facilidade na produção e purificação, boa estabilidade térmica e alta atividade específica. TmPPase mostra alta semelhança, além da conservação completa da posição, bem como a identidade de todos os resíduos catalíticos para os mPPases protista^3,9 e para a estrutura resolvida de Vigna radiata¹⁰ mPPase. As estruturas disponíveis de TmPPase em diferentes conformações também são úteis para experimentos de design de drogas baseados em estrutura (como triagem virtual e design de novo).

Aqui relatamos um protocolo detalhado para triagem de inibidores de TmPPase em um formato de placa de 96 poços (Figura 1). O protocolo é baseado no método colorimétrico da reação azul molibdênio, que foi desenvolvida pela primeira vez por Fiske e Subbarow¹¹. Este método envolve a formação de ácido 12-fosphomolídico de ortopofosfato e molibdênio condições ácidas, que é então reduzida para dar a espécie de fosphomolybdenum de cor azul característica¹².

1. Preparação de proteínas

NOTA: A expressão e purificação de TmPPase foi descrita em outros lugares¹³.

1. Prepare 10 mL da solução tampão de reativação contendo 20 mM 2-(N-morpholino) ácido ethanesulfonic (MES) pH 6.5, 3.5% (v/v) glycerol, 2 mM dithiothreitol (DTT), e 0.05% dodecyl maltoside (DDM).
2. Prepare 10 mL da mistura de reação contendo 200 mM Tris-Cl pH 8.0, 8.0 mM MgCl_2,333 mM KCl, e 67 mM NaCl.
   NOTA: Mg²⁺ é necessário para chelate o pirofosfato como o substrato de mPase, K⁺ é necessário para aumentar a atividade enzimática como TmPPase é um mPase dependente de potássio, e Na⁺ é necessário para a atividade enzimática durante a translocação de íons de sódio por TmPPase.
3. Prepare 30 mg/mL lipossomos para reativação enzimática.
   1. Adicione 10 mL de 20 mM Tris-HCl pH 8.0 com 1 mM DTT a 0.3 g de L-α-phosphatidylcholine de soja para 10 mL de 20 mM Tris-HCl pH 8.0 com 1 mM DTT.
   2. Coloque o lipossoma no gelo, e sonicate com intervalo de pulso de 1 segundo por 1 minuto, faça uma pausa por 1 minuto, e repita até que a solução se torne amarelo transparente.
   3. Aliquot os lipossomos, congelar em nitrogênio líquido e armazenar a -80 °C até usado.
4. Reativar a enzima.
   1. Misture 40 μL da solução de lipossomos com 22,5 μL de 20% DDM.
   2. Aqueça a mistura em 55 °C por 15 min e deixe esfriar a temperatura ambiente.
   3. Adicione 36,5 μL da solução tampão de reativação, misture e adicione 1 μL de proteína concentrada (13 mg/mL) para fazer uma concentração total de 0,13 mg/mL.
      NOTA: A proteína é geralmente congelada em alíquotas de 10 μL após a purificação e descongelada no gelo antes do uso.
5. Tome 20 μL da enzima reativada e adicione a 1.480 μL da mistura de reação, em seguida, misture suavemente.
   NOTA: A adição da enzima reativada à mistura de reação deve ser realizada pouco antes de ser usada.

2. Preparação composta

1. Dissolva os compostos em dimetil sulfoxida (DMSO) para fazer soluções de estoque de 25 a 100 mM em 50-200 μL, com base na disponibilidade dos compostos.
   NOTA: Todos os compostos usados aqui(Figura 2A)foram publicados anteriormente⁹. Se a solubilidade composta for baixa, a concentração de estoque pode ser ajustada em conformidade.
2. Prepare três concentrações diferentes de cada composto na água.
   NOTA: As concentrações finais na mistura de reação serão 1, 5 e 50 micromolar ou 1, 5 e 20 micromolar para compostos solúveis e com moderação solúveis, respectivamente.
   1. Diluir a solução de estoque com água para 1 mL em microtubos para dar 2 μM, 10 μM e 100 μM para compostos solúveis, ou alternativamente 2 μM, 10 μM e 40 μM para compostos parparingly solúveis.
   2. Vortex a solução composta instantaneamente após a diluição da solução de estoque para a mistura adequada.
3. Verifique se há agregação composta usando um nefrômetro.
   NOTA: Este foi estudado como triplicados em três concentrações (1 μM, 5 μM e 20 μM) e normalizado ao espaço em branco em uma placa de 96 poços.
   1. Dispense 75 μL da mistura da reação em cada poço usando uma pipeta multichannel.
   2. Adicione 75 μL de cada composto (para o espaço em branco, use 75 μL de água em vez disso) e misture por pipetting cima e para baixo 5 ×.
   3. Medir cada poço em 300 V usando um nephelometer microplate.

3. Reagentes para a preparação do ensaio

1. Prepare a solução arsenite-citrate.
   1. Pese 5 g de arsenita de sódio e 5 g de dihydrate de citrato trissódico.
      CUIDADO: O arsenite do sódio é tóxico, assim use o equipamento protetor apropriado e segure com cuidado especial. Como precaução, não segure antes que todas as precauções de segurança necessárias tenham sido lidas e compreendidas. Segure apenas em um capô de fumaça, a fim de não inalar poeira / vapores do composto ou sua solução (s). Se inalado, mova-se para o ar fresco e obtenha atendimento médico. Use óculos de segurança químicos adequados, luvas de proteção e roupas para evitar a ingestão e contato olho/pele. Se engolido, ligue imediatamente para um centro de intoxicação ou médico/médico. Se ele fica na pele ou no olho (s), lave com muita água e obter atenção médica.
   2. Dissolva-se em 100 mL de água.
   3. Adicione 5 mL de ácido acético glacial, misture e adicione água a 250 mL.
   4. Armazenar à temperatura ambiente protegido da luz.
      NOTA: A solução é estável por mais de um ano.
2. Prepare a solução A e a solução B.
   1. Para solução A, adicione 10 mL de gelo frio 0,5 M HCl para 0,3 g de ácido ascórbico. Dissolva o ácido ascórbico por vórtice.
   2. Para solução B, adicione 1 mL de água gelada a 70 mg de tetrahidrato e vórtice de amônio heptamolybdate para dissolver.
      NOTA: Armazenar ambas as soluções no gelo até o uso. Para a consistência do resultado do ensaio, ambas as soluções podem ser armazenadas no gelo por um máximo de uma semana.
3. Prepare o padrão de fosfato (P_i)com a concentração de 0 μM, 62,5 μM, 250 μM e 500 μM para calibração.
   1. Adicione 0 μL, 25 μL, 50 μL e 100 μL de 5 mM Na₂HPO₄ desidratar a quatro microtubos contendo 370 μL da mistura de reação.
   2. Cubra até 1 mL com água.

4. Ensaio de atividade para uma placa de 96 poços

NOTA: Veja a Figura 1 para o fluxo de trabalho esquemático do ensaio.

1. Adicione 1 mL de solução B a 10 mL de solução A, misture vórtice e guarde a solução no gelo.
   NOTA: Esta solução deve ser transparente e amarela. Mantenha a solução A + B no gelo por pelo menos 30 minutos antes do uso. No entanto, use a solução dentro de 3 h, pois vai mal depois de armazenamento a longo prazo.
2. Adicione 40 μL de 0 μM, 62,5 μM, 250 μM e 500 μM P_i padrão para as tiras de tubo em triplicado usando uma pipeta multicanal.
   NOTA: A mistura de reação sem P_i adicionado será usado como um espaço em branco.
3. Adicione 25 μL de solução composta para as tiras de tubo usando uma pipeta multicanal.
   NOTA: Cada composto tem três concentrações diferentes em triplicado, o que é suficiente para a estimativa inicial da concentração inibil máxima (IC_50). Para uma determinação ic₅₀ mais precisa, oito concentrações compostas diferentes podem ser usadas. Para a enzima desinibida, a solução composta é substituída por quantidade igual de água. Como controles positivos foram utilizados 2,5 μM, 25 μM e 250 μM de imidodifosfato (IDP).
4. Adicione 15 μL de mistura de solução mPPase para as tiras de tubo (exceto para os tubos contendo P_i padrão) usando uma pipeta multicanal.
5. Selar as tiras do tubo com uma folha de vedação adesiva. Corte a folha de vedação para separar cada tira de tubo.
6. Pré-incubar as amostras para 5 min a 71 °C. Coloque as amostras no bloco de aquecimento com intervalo de 20 s entre cada tira, a fim de minimizar o consumo de tempo durante as etapas subsequentes.
7. Para cada tira, abra a vedação adesiva. Adicione 10 μL de 2 mM pirofosfato de sódio dibasic usando uma pipeta multicanal e misture por pipetting cima e para baixo para 5 ×. Selar a tira de tubo novamente usando a mesma vedação.
   NOTA: Esta etapa pode inicialmente ser difícil de realizar em 20 s; no entanto, ele vai se tornar mais fácil depois de alguns ensaios.
8. Incubar a 71 °C por 5 min.
9. Coloque as amostras no aparelho de resfriamento com intervalo de 20 s entre cada tira. Deixe esfriar por 10 min, mas centrífuga cada tira brevemente após 5 min de resfriamento, para decantar gotas de água a folha de vedação, em seguida, colocá-lo de volta para o aparelho de resfriamento e remover o vedação.
   NOTA: O aparelho de refrigeração pode simplesmente ser feito colocando uma placa PCR de 96 poços em uma placa de Petri de poliestireno (tamanho 150 mm × 15 mm) cheia de água e congelada por pelo menos 1 h. O aparelho deve ser retirado do congelador cerca de 5 minutos antes do início do ensaio. Não tire o aparelho de resfriamento logo antes do resfriamento da amostra, pois congelará a mistura de reação e dificultará o desenvolvimento da cor.
10. Após 10 min de resfriamento, adicione 60 μL de solução A + B, misture por pipetting para cima e para baixo para 5 × e manter as tiras de tubo no aparelho de refrigeração por 10 min.
11. Adicione 90 μL da solução arsenite-citrato e mantenha em temperatura ambiente por pelo menos 30 min para produzir uma cor azul estável.
    CUIDADO: Devido à sua toxicidade todas as soluções que contenham arsenita de sódio devem ser tratadas com cuidado extra em todos os tempos. Assim, a adição de solução arsenite-citrato deve ser feita em um capô de fumaça.
12. Dispense 180 μL de cada mistura de reação em uma clara microplaca de poliestireno de 96 poços.
13. Medir a absorção de cada poço em 860 nm usando um espectrômetro microplaca.

5. Análise de resultados

1. Média dos triplicados de cada amostra e dos_{pp P i.} Em seguida, subtraia com o espaço em branco para eliminar o sinal de fundo.
2. Faça uma curva de calibração traçando a absorção (A₈₆₀₎valores contra a quantidade de P_i padrão (nmol) e realizar uma regressão linear para obter a função de linha de tendência usando a seguinte fórmula:
   
3. Calcule a quantidade de fosfato (nmol) liberada da reação enzimática com base na fórmula de regressão linear acima.
4. Calcule a atividade específica usando a seguinte fórmula:
   
   onde nP_i é a quantidade de fosfato liberado da reação (nmol), t é o tempo de reação (min), e m_TmPPase é a quantidade do TmPPase puro usado no ensaio (mg).
5. Calcule a atividade percentual para cada concentração inibidora usando a seguinte fórmula:
   
   onde SA_iisa atividade específica de uma amostra com inibidor e SA_un é a atividade específica da amostra desinibida.
6. Calcule o logIC₅₀ (estimativa) e IC₅₀ (estimativa) com um ajuste de regressão não linear da curva de dose-resposta de quatro parâmetros usando a seguinte fórmula:
   
   onde X é registro de concentração (μM), Y é atividade (%), Top e Bottom são planaltos na mesma unidade que Y (100% e 0%, respectivamente), logIC₅₀ tem as mesmas unidades de registro como X, e HillSlope = fator de inclinação ou encosta, que é unitless.
   NOTA: Software(Tabela de Materiais)é usado para a montagem. Use a concentração de 0,01 μM (em vez de 0,00 μM) para a amostra sem inibidor, pois o logarithm de zero não é definido.

Neste protocolo, oito compostos (1-8) foram testados(Figura 2A)juntamente com o BID, inibidor comum de pirofosfatases, como controle positivo. Cada composto foi testado em três concentrações diferentes (1 μM, 5 μM e 20 μM) em triplicado. O fluxo de trabalho da triagem é representado na Figura 1,a partir da amostra e preparação do reagente até a medida de absorção em 860 nm.

Ao final deste protocolo, após a adição da solução A + B e arsenite-citrate, as soluções desenvolvem uma cor azul estável com a absorção máxima em 709 nm e 860 nm¹⁴ devido à complexa formação de íons de fosfato com molítoque que pode ser observado e mostra a ocorrência da reação enzimática. Para este experimento, usamos a absorção em 860 nm para a medição da quantidade P_i liberada, pois tem melhor limite de detecção e sensibilidade em comparação com a absorção em 709 nm¹⁵. A cor azul é totalmente desenvolvida em 30 min de incubação à temperatura ambiente e estável por pelo menos 5 h^14. O ensaio tem a sensibilidade até p_i concentração de 10 μM e a absorção é linear sobre uma faixa de concentração de 10-800 μM¹⁴. No resultado representativo aqui, os poços E1-E3(Figura 2C)contêm a mistura de reação sem inibidor e a solução azul pode ser observada no final do ensaio. Isso também pode ser observado em baixas concentrações compostas onde a inibição completa não foi alcançada, como nos poços F1-F3 para IDP e poços A4-A6 para composto 1 (ATC, um inibidor não competitivo recentemente conhecido de TmPPase⁹) na concentração de 2,5 μM e 1 μM, respectivamente. A maior concentração de DESLOCADO Ida e composto 1, menos a nenhuma cor azul pode ser observada (G1-G3 e H1-H3 para IDP e B4−B6 e C4−C6 para composto 1)indicando inibição da atividade enzimática. Todas as três concentrações de compostos não inibidores (2, 3e 8)apresentaram a mesma intensidade de cor azul, bem como E1-E3 sem qualquer inibidor (Figura 2C).

Após a medição de absorção em 860 nm, os dados podem ser processados e analisados (ver seção de protocolo 5). Figura 2D mostra o gráfico de calibração do padrão P_i com sua montagem linear (y = 0,0576x + 0,0019; r² = 0,999). Figura 3 mostra o enredo da atividade enzimática (%) contra a concentração de cada composto testado. Para compostos com atividade de inibição, uma curva não linear também é mostrada. O IDP, usado como um controle positivo, mostra claramente uma diminuição na atividade em uma concentração mais elevada. O IC₅₀ (estimativa) calculado com base em três concentrações diferentes é de 88,2 μM (Tabela 1),que é semelhante à medida anterior (80,0 μM) com oito pontos de concentração^14. Os compostos 1, 4, 5, 6e 7 apresentaram tendência semelhante à do IDP, uma vez que a concentração aumentou com o IC₅₀ (estimativa) de aproximadamente 1,3 μM, 7,4 μM, 19,0 μM, 37,4 μM e 156,1 μM, respectivamente (Tabela 1). Para compostos 2, 3,e 8 nenhuma redução na atividade ou inibição podem ser observadas nas concentrações do ensaio. Um ensaio adicional com oito pontos de concentração pode ser feito para gerar IC preciso₅₀. A Figura 4 mostra a curva de inibição para compostos 1, 5, 6, 7 e 8 com IC₅₀ de 1,7 μM, 21,4 μM, 58,8 μM, 239,0 μM e >500 μM, respectivamente^9.

Figura 1: Um fluxo de trabalho esquemático do ensaio de inibição de TmPPase em um formato de placa de 96 poços. A numeração vermelha mostra os passos do ensaio de acordo com o protocolo e as setas azuis mostram a ordem de intervalo. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 2: Amostras, seu arranjo e desenvolvimento de cores em uma placa de 96 poços. (A)As estruturas dos compostos 1-8 usado para o ensaio. A atividade de inibição destes compostos tem sido relatada em Vidilaseris et al.⁹. (B)Arranjo da amostra. (C)Desenvolvimento de cores, 30 min após a adição da solução arsenite-citrato. As concentrações de inibidor de controle (IDP) e amostras utilizadas, dispostas de cima para baixo, são de 2,5 μM, 25 μM e concentração de 250 μM e 1 μM, 5 μM e concentração de 20 μM, respectivamente. A intensidade da cor azul corresponde à quantidade de P_i lançado devido à reação enzimática e a falta de cor corresponde a nenhuma reação enzimática. (D)Curva de calibração para P_i padrão (nmol) contra A₈₆₀ com montagem linear (y = 0,0576x + 0,0019; r² = 0,999). Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 3: Curva da atividade percentual de TmPPase para três concentrações inibidoras diferentes. As curvas de regressão não lineares para calcular o IC₅₀ (estimativa) são mostradas para o IDP, bem como para os compostos 1, 4, 5, 6 e 7, mas não para compostos 2, 3,e 8, pois não estavam inibindo a atividade de TmPPase nas concentrações de ensaio. O logIC₅₀ e IC₅₀ (estimativa) de cada composto é mostrado na Tabela 1. Todos os dados são mostrados como média ± SD com três replicações. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Figura 4: Curva de inibição de oito pontos de concentração dos compostos 1, 5, 6, 7 e 8. Esta figura é tomada de Vidilaseris et al.⁹ com ligeira modificação. Todos os dados são mostrados como média ± SD com três replicações. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.

Tabela 1: LogIC₅₀ e IC₅₀ (estimativa) do IDP e compostos 1-8 com base nos dados da Figura 3.

Aqui relatamos um protocolo detalhado para triagem simples de inibidores para pirofosfatase ligada à membrana de T. maritima em um formato de placa de 96 poços baseado em Vidilaseris et al.¹⁴. Este protocolo é barato e baseado em ácido 12-fosphomolybdic, que é formado a partir de ortopofosfato e molibdênio em condições ácidas e reduzido a espécies de fosphomolybdenum com uma cor azul distinta¹². Este método é preferido em relação a outros protocolos, como o ensaio verde malaquita mais sensível^16,pois este método não mostra interferência na presença de alta concentração de fosfolípido que é necessária para a reativação tmppase¹⁴.

O fluxo de trabalho do protocolo de triagem é retratado na Figura 1 e esse processo pode ser totalmente realizado em 1h. Este protocolo é otimizado para TmPPase com a temperatura de trabalho ideal em 71 °C e um tempo de reação de 5 min. Como a água evaporará a essa temperatura a partir da mistura de reação, uma folha de vedação adesiva (cortada para caber e cobrir as tiras) é aplicada para evitar a evaporação¹⁴ e a água evaporada é simplesmente coletada com centrífuga. O tempo de incubação de 5 min é escolhido, pois ainda está na faixa linear do fosfato enzimaticamente liberado e suficiente para triagem confiável¹⁴. Neste protocolo, o tempo e as habilidades de pipetting são fatores importantes para obter um resultado bom e confiável. A adição de reagentes durante o ensaio com intervalo de 20 s entre tiras é uma opção de tempo otimizada para facilitar a realização das etapas subsequentes.

Para diferentes mPPases, a temperatura ideal e o tempo de incubação devem ser determinados separadamente antes do uso no ensaio inibitório. O protocolo de reativação de enzimas acima é otimizado para TmPPase e outros mPPases podem precisar de um protocolo de reativação diferente. Por exemplo, ddm não deve ser adicionado para reativação de mPase de pyrobaculum aerophilum como ele vai diminuir a sua atividade enzimática¹⁷. Como a enzima se tornará menos ativa se for preparada com bastante antecedência, a adição de enzima reativada deve ser adicionada à mistura de reação pouco antes do ensaio ser iniciado. Após a adição da solução arsenite-citrato o produto de reação é estável por pelo menos 5 h¹⁴. Portanto, o próximo lote do ensaio pode ser realizado imediatamente, e a medição de absorção pode ser feita mais tarde para todos os lotes de uma só vez.

Os autores não têm nada a divulgar.

Este trabalho contou com o apoio das subvenções da Fundação Jane e Aatos Erkko e do BBSRC (BB/M021610) a Adrian Goldman, a Academia da Finlândia (nº 308105) para Keni Vidilaseris (nº 310297) a Henri Xhaard, e (nº 265481) a Jari Yli-Kauhaluoma, e os Fundos de Helsínquia da Universidade de Pesquisa a Gustav Boije af Gennäs. Os autores agradecem a Bernadette Gehl por sua ajuda técnica durante o projeto.