Определение события гомологичная рекомбинация в мышиных эмбриональных стволовых клеток с использованием южный Blotting и цепной реакции полимеразы

Здесь мы представляем подробный протокол для выявления гомологичная рекомбинация события, которые произошли в мышиных эмбриональных стволовых клеток с использованием Южный blotting или ПЦР. Этот метод является примером поколения nonmuscle миозин II генетических замена мыши модели с использованием традиционных эмбриональных стволовых клеток-технологию на основе гомологичных рекомбинации опосредованной таргетинга.

Относительно вопросов пробить эффектов и сложности вставке длинный фрагмент ДНК в применение конструктора nucleases для редактирования, эмбриональных стволовых генома технологии гена таргетинг на основе клеток (ES) не имеют таких недостатков и широко используется для изменения генома животных/мыши от большого удаления/вставки до единичных нуклеотидных замен. Особенно выявления сравнительно мало гомологичная рекомбинация (HR) события, необходимые для получения желаемого ES клонов является ключевым шагом, который требует точных и надежных методов. Южный blotting или обычных PCR часто используются для этой цели. Здесь мы описываем подробные процедуры использования этих двух методов для идентификации HR события, которые произошли в мыши ES клеток, в которых эндогенного ген Myh9 предназначен для быть нарушена и заменены cDNAs кодирования другие nonmuscle тяжелой цепи миозина IIs (IIs НЦПЗ). Вся процедура Южный blotting включает строительство ориентации vector(s), электропорация, выбор наркотиков, расширения и хранения клеток ES/клоны, подготовка, пищеварение и промокательной геномной ДНК (геномная ДНК), гибридизации и Мойка кислородных и заключительный шаг авторадиографии на рентгеновских пленок. ПЦР могут быть выполнены непосредственно с подготовленной и разбавленных геномная ДНК. Для получения идеальных результатов, следует тщательно планировать зонды и энзима ограничения (пере) вырубки для Южный blotting и грунты для ПЦР. Хотя выполнение Южный blotting является длительным и трудоемким и ПЦР результаты ложных срабатываний, правильной идентификации, Южный blotting и быстрого скрининга методом ПЦР позволяют единственным или комбинированного применения этих методов, описанных в настоящем документе, широко используется и консультации, большинство лабораторий в идентификации генотипов ES клеток и генетически изменены животных.

Технология гена, ориентирование по HR в мышиных клетки ES обеспечивает мощный инструмент для рассечения сотовой последствия конкретных генетических мутаций^1,2. Важность и значение этой технологии отражаются в его признании 2007 Нобелевской премии по физиологии и медицине^3,4; Тем временем он представляет собой наступление современной эры гена инженерных⁵. Джин, ориентация через HR могут быть использованы для инженер практически любые изменения от точечные мутации до больших хромосомных перестроек в геноме мыши ES клеток^6,7. Хорошо известно, что, перед появлением так называемых генома инструменты редактирования, поколения мыши Нокаут гена требуется применение технологии гена ориентация в ES клеток^8,9,10. В течение последних двух десятилетий более чем 5000 целевых генов мышей были произведены этот подход для моделирования заболеваний человека или изучении генной функции¹¹. Геном общесистемной нокаут усилий была создана для распространения ген ориентации векторов, целенаправленных клоны клеток ES и живой мышей, чтобы научное сообщество^{2,12,13,14 , 15}. несомненно, ES клеток HR-опосредованной ген ориентация технологии значительно расширенный нашего понимания функций генов играл в физиологических и патологических контексте.

Потому что HR является сравнительно редким событием в млекопитающих клетки^16,17, является важным и следующий шаг после гена ориентации в мышиных ES клеток заключается в анализе многочисленных колоний ES для выявления несколько клонов с результатом мутации HR с ориентации вектора¹⁸. Золотые методы для выявления HR события включают Южный blotting и ПЦР^19,20. Преимущества подходов включают что Южный blotting может определить правильно целевых ES клоны и позволяет исследователям анализировать структуру гена целевой события, например проверку одной копии вставки конструкции, тогда как Стратегия на основе ПЦР позволяет более быстрого скрининга для HR события^21,22. Хотя эти методы имеют свои недостатки, такие как что они много времени и может иметь ложных срабатываний, комбинационный использование их является широко приняты и применяются организациями большинство лабораторий в определении события HR, особенно в ES клеток, для генерации генетически измененными животных.

Три изоформ nonmuscle миозин II (Нм II) млекопитающих, каждая из которых состоит из двух идентичных NMHC IIs, которые кодируются с трех различных генов (именованные Myh9, Myh10 и Myh14) и две пары легких цепей, называются Нм II-A, II-B и II-C²³. Предыдущие исследования показали, что по крайней мере изоформ Нм II-A и II-B важны для развития мыши, потому что в vivo абляции этих изоформ приводит к эмбриональной летальность^24,25,26. Чтобы обойти эту проблему и получить новые идеи в изоформы специфичные функции Нм II-A и II-B на более поздних этапах развития мыши, генетических замена была принята стратегия, с использованием ES клеток HR-опосредованной ген ориентация технологии для генерировать серию мыши модели²⁷. В ходе определения желаемого ES клоны, Южный blotting и ПЦР методы были использованы, и они оказались эффективной и надежной в^27,28.

Этот документ намеревается представить подробное описание Южный blotting и ПЦР, включая разработку ориентированных на vector(s), кислородных и грунтовки и выполнения экспериментов, а также анализ полученных результатов свидетельствует выявление событий HR вхождение в клетки ES для создания генетических замена Нм II мыши модели и репрезентативных данных. Протоколы этих двух методов, представленные здесь также могут быть приняты для идентификации генотипов генетически модифицированные клетки или животных.

1. дизайн ориентации на Construct(s), зонды для Южная помарка и грунты для ПЦР

1. Выберите первый кодирования экзона (экзона 2) Myh9 гена для нарушения или вставки в применении нокаут/запрессовка сообщили здесь.
2. Получить 5-КБ вверх и 5-КБ течению последовательностей ДНК окружающих Myh9 экзона 2 на веб-сайте genome.ucsc.edu .
3. Анализ моделей пищеварение ограничения ферментов (REs) с 1 – 2 сокращений в этом регионе 10-КБ с использованием программного обеспечения pDRAW для определения подходящего RE(s) переваривать геномной ДНК для Южный blotting.
   Примечание: Dra я встречает это требование и выбран для этой цели.
4. Выберите фрагмент 4 КБ немедленно вверх по течению от Myh9 экзона 2 как рукой левой гомологии (LHA) и 1.7 kb немедленного вниз по течению последовательность фрагмент как руку правой гомологии (АРЗ); Выберите фрагмент 1 КБ 5' вверх по течению по LHA как левой зонд (LP) для Южный blotting и фрагмент 1.2 kb 3' вниз по течению от RHA как правый зонд (RP), на основе приведенного выше анализа.
5. Используйте программу primer3 для разработки прямого и обратного Праймеры для усиления этих четырех фрагментов ДНК методом ПЦР. Дизайн пары праймеров с вперед грунт, проживали вблизи терминала 3' Выбор маркера neomyocin сопротивления гена (P1) и обратный грунт недалеко RHA (P2).
   Примечание: Эта пара грунтовка будет использоваться для выявления целевых ES клоны ПЦР²⁹.
6. Найти клонов BAC 129Sv, покрытие мыши Myh9 Локус гена, посетив веб-сайт bacpac.chori.org (Примечание: isogenic ДНК является предпочтительным). Изолируйте дна BAC, используя комплект для очистки больших кусков ДНК, следуя инструкциям производителя.
   Примечание: Очищенная ДНК BAC будет использоваться в качестве шаблона для амплификации PCR.
7. Нарисуйте схематическое представление таргетинга конструкций, зонды и грунты для обобщения этой информации.

2. поколение ориентации на Construct(s) и Щупы для Южная помарка и подготовка праймеры PCR

1. Заказать праймеры PCR, описанных выше и распустить их в концентрации 20 мкм.
2. Усилить гомологии оружия и зонды методом ПЦР в реакции решения, в том числе 1 мкл вперед и 1 мкл обратный грунтовки, 1 мкл BAC ДНК (50 нг) как шаблон, 5 мкл буфера для ОРП и 1 мкл ультра Pfu ДНК полимеразы как , и H₂O до 50 мкл. выполнять ПЦР в машину ПЦР при следующих условиях: 95 ° C 3 мин; 95 ° C за 30 сек; 60 ° C за 30 сек; 72 ° C и 1 КБ/мин; 30 циклов; Наконец 72 ° C для 10 мин.
3. Очищают с помощью ПЦР комплект очистки согласно протоколу, предоставляемых производителем продуктов ПЦР и элюировать ДНК фрагментов с 40 мкл H₂O. дайджест очищенных продуктов ПЦР с готовых ВИЭ в реакции раствор, содержащий 5 мкл 10 x буфер для REs , 2,5 мкл RE1 и 2,5 мкл RE2, и eluted ДНК, при 37 ° C на 2 ч запустить ДНК гель 1% для отдельных целевых групп ДНК, акцизный гель, содержащий целевую ДНК под УФ светом, очищают целевых фрагментов ДНК от геля с помощью ДНК гель добыча комплект согласно к протоколу, предоставляемых производителем, а элюировать ДНК фрагментов с 40 мкл H₂O.
4. Клонировать гомологии оружия и замены выражения cassette(s) в mpNTKV-LoxP вектор согласно приказу усиливается и очищенный АРЗ, LHA и замена выражение cassette(s) освобожден от других векторов для получения окончательного ориентации Construct(s). Клонировать фрагментов ДНК усиливается и очищенный зондов в T-легко вектор.
5. Подтвердите нуклеотидные последовательности всех клонированных фрагментов ДНК последовательности^27,28.

3. подготовка ориентированных на Construct(s), Electroporation клетки ES и усиления ES клонов

1. Подготовка каждого таргетинга конструкцию с использованием плазмида maxiprep комплекта согласно протоколу, предоставляемых производителем. Линеаризации каждой конструкции плазмида, переваривание с не я в 400 мкл реакции, включая 40 мкл 10 x буфер не я, не я 10 мкл, 100 мкг ДНК и H₂O до 400 мкл, при 37 ° C ночь.
2. Очищайте линеаризованного ориентации construct(s).
   1. Экстракт переваривается реакция решение 1 x с равным объемом фенола: хлороформ: изоамиловый спирт (25:24:1) и центрифуги в силу 2000 x g за 10 мин.
   2. Супернатант передать новый 1,5 мл, осадок ДНК, используя 2.5 x этанола и 0,1 x 3M ацетат натрия (рН 5.2) (объемная доля) и центрифуги на силы g 2000 x 10 мин.
   3. Удалите супернатант, мыть ДНК гранул 1 x 1 мл 75% этанола и центрифуги в силу 2000 x g за 5 мин.
   4. Удалить супернатант и просушите ДНК Пелле за 5 мин.
   5. Растворите линеаризованного Пелле ДНК в стерильных буфера Tris-ЭДТА (TE) в конечной концентрации 1 мкг/мкл.
3. Смешайте 50 мкг каждой линеаризованного таргетинга конструкции с 0,5 x 10⁷ ES клеток. Выполните электропорации в 320 V и 250 МКФ. тарелка electroporated ES клеток на блюда с нео устойчивостью MEF кормушки.
4. После 24 часов переключитесь на средний клеток ES с 400 мкг/мл G418 и 200 мкм ганцикловир и продолжать культуры для 4-5 дней с ежедневной среднего изменения. Подберите лекарственно-ES клоны в 48-ну пластины.
   Примечание: Как правило, четыре 48-ну плиты используются в конструкции.
5. Дублировать 48-ну пластины.
   Примечание: Один набор пластин замораживают, и другой набор используется для приготовления геномной ДНК.

4. Подготовка геномной ДНК и пищеварение с Restriction Enzyme(s)

1. Подготовка gDNAs от ES клеток с использованием коммерческих комплект (геномной ДНК очистки) с незначительными изменениями.
   1. Извлеките из культуры клеток ES и 500 мкл раствора лизис ядер, включая RNaseA, непосредственно к скважинам для Лизируйте клетки.
      Примечание: Lysate клетки могут храниться при температуре-80 ° C или лечить немедленно.
   2. Накапайте вверх и вниз несколько раз, чтобы лизировать клетки полностью и передавать их на чистой 1,5 мл.
   3. Добавить одну треть объема решение осадков белок 1,5 мл, вихревой энергично для 20 s, chill образцы на льду на 5 минут и затем, центрифуги в силу 2000 x g 5 мин супернатант передать другой чистый 1,5 мл трубки Контаи Нин равным объемом изопропиловый спирт; Аккуратно перемешайте раствор. (Обратите внимание, что в этот момент можно увидеть белые пряди нитевидные.) Центрифуга в силу 2000 x g 1 мин; затем удалить супернатант.
   4. Помыть лепешка геномная ДНК с 1 мл 70% этанола при комнатной температуре, центрифуги в силу 2000 x g за 1 мин, тщательно удалить супернатант, а затем просушите геномная ДНК Пелле за 3 мин.
   5. Распустить gDNAs с 100 мкл раствора регидратации ДНК и, затем, инкубировать на 65 ° C за 1 ч или 4 ° C на ночь.
   6. Магазин gDNAs в 2-8 ° C.
2. Дайджест gDNAs с подготовлены RE Dra I. Установите вверх 30-мкл пищеварение реакции, смешивая 3 мкл 10 x буфер для Dra I, 3 мкл Dra я, 10 мкг gDNAs/образца, и H₂O до 30 мкл и инкубировать при 37 ° C на ночь.
3. Проверьте полноту пищеварение ДНК гель, анализируя 5 мкл переваривается реакции и затем добавьте 3 мкл 10 x буфер ДНК загрузки для последующего шага.

5. южный Blotting и ПЦР идентификации

1. Южный blotting скрининг
   1. Отдельные усваивается gDNAs электрофореза и передачи мембраны.
      1. Подготовить электрофореза геля агарозы 1% бромидом ethidium (EB), загрузить образцы из шаг 4.3 и лестница 1 КБ и Побегите гель с низким напряжением (30-40 V) на ночь.
      2. Взять из геля и сфотографироваться на память с системой гель изображения ДНК после электрофореза. Проверьте ли перевариваются и раздельный gDNAs мазка как изображение.
      3. Замочите геля в поднос с 0,2 N HCl решение и встряхните его мягко в течение 20 минут при комнатной температуре.
      4. Передача гель для ДНК денатурации раствора и встряхните его мягко в течение 20 минут при комнатной температуре.
      5. Переключить гель в ДНК нейтрализации раствора и встряхните его мягко в течение 20 минут при комнатной температуре.
         Примечание: Гель подвержены поломки после этого шага, поэтому она должна обрабатываться тщательно.
      6. Используйте систему быстрой нисходящей передачи передать мембраны DNAs от геля. Соберите TurboBlotter и blotting стека в соответствии с инструкциями производителя.
         Примечание: 10 x или 20 x раствор солевой раствор натрия цитрата (SSC) используется в качестве буфера передачи. В общем 3 h передачи является достаточно передать 95% gDNAs от геля мембраны; Однако больше времени передачи безобидным.
      7. Вынуть мембраны и мыть его с 2 x SSC за 1 мин, впитывают жидкость с тканей и затем перекрестные ссылки ДНК с мембраной с помощью УФ сшивателя.
         Примечание: Мембрана может храниться при температуре 4 ° C на одну неделю.
   2. Ярлык ДНК-зондов с радиоактивностью.
      1. Очищения плазмиды зонд, с помощью комплекта алкалический согласно протоколу, предоставляемых производителем.
      2. Релиз ДНК фрагментов зондов от вектор плазмиды путем EcoR пищеварение в растворе реакции, включая 5 мкл буфера для EcoR I, 2 мкл EcoR я фермента, 20 мкг плазмидной ДНК и H₂O до 50 мкл , 2 ч.
      3. Запустить % 1, ДНК гель для разделения фрагментов ДНК зонд из вектора и очистить фрагментов ДНК зондов с комплектом экстракции ДНК гель согласно протоколу, предоставляемых производителем.
      4. С помощью 1 мкл раствора ДНК, измерения концентрации ДНК фрагментов ДНК зонд с спектрофотометре при длине волны 260/280 Нм.
      5. Подготовить 40-нг зонд ННО в 1,5 мл трубку с 45 мкл буфера TE, кипятить 3 мин, спина кратко и затем поместите трубки на льду на 2 мин.
      6. Добавить тепла денатурированный зонд ННО в пробирку, содержащую ДНК маркировки бисер готов к идти (-дЦТФ), накапайте вверх и вниз для микширования, 5 мкл дЦТФ [α³²P] и затем Инкубируйте на 37 ° C в течение 15 мин.
      7. Очистить помеченные зонды с помощью G-50 microcolumns соответствии с инструкциями, предоставленными производителем и, затем, измерения радиоактивности, сцинтилляционный счетчик (необязательно).
   3. Гибридизируйте membrane(s) с метками зондами.
      1. Prehybridize мембраны.
         1. Prewarm гибридизации решение при 42 ° C за 30 мин микс 20 мл раствора подогретую гибридизации с 200 мкг кипяченой лосось спермы ДНК в 50-мл.
         2. Место мембраны в гибридизации трубку. Добавьте смешанные prehybridization решение в гибридизации трубки. Поместите его в печь гибридизации (набор прокатки и температуры при 42 ° C) и пусть prehybridization перейти на 30 мин.
      2. С меткой кислородных гибридизируйте мембраны.
         1. Вынуть трубку гибридизации и залейте раствор prehybridization в 50 мл трубки; Добавьте денатурированного зонд (нагревают при 100 ° C в течение 3 мин) с шагом 5.1.2.7 этой трубки и перемешать осторожно.
            Примечание: Уменьшите любые заставить пузыри.
         2. Вернуться гибридизации трубки смешанного решения и выполнять гибридизации при 42 ° C на ночь.
   4. Мыть membrane(s) для удаления nonhybridized зонды.
      1. Поместите membrane(s) в лоток с 1 x SSC + 0.1% SDS и поколебать мягко на 55-60 ° С за 10 мин.
      2. Передача membrane(s) к лотку с 0.5 x SSC + 0.1% SDS и нежно погрозит 55 – 60 ° С за 10 мин.
      3. Проверьте радиоактивности на membrane(s) с помощью портативный Счетчик Geiger решить, требуется ли третьей стирки.
   5. Разоблачить радиоактивности на мембраны для рентгеновских пленок.
      1. Удалите жидкость из промытого membrane(s).
      2. Обнять membrane(s) с полиэтиленовой пленкой и исправить его в экспозиции кассету.
      3. Разоблачить мембраны для двух листов рентгеновской пленки в темной комнате.
      4. Место кассеты воздействия при температуре-80 ° C на ночь или дольше.
   6. Разрабатывают фильмах для визуализации результатов. Оцените, может ли соответствующий клон ES нужную с рекомбинацией целевых или нет, в соответствии с размерами полос ДНК, обнаруженная зондов.
   7. Rehybridize же мембрана другой зонд после зачистки от используемого ПЭП согласно следующей процедуре: вывезти используется мембрана, мыть 1 x с чистой H₂O, а затем, инкубировать в растворе чередование (55% формамида, 2% ГНПП, 1% SDS, H ₂ O) при 65 ° C с нежным встряхивания в течение 1 – 2 ч.
2. Идентификация PCR
   1. Выполнять ПЦР идентификации нужного ES клонов в 50 мкл реакции решения, в том числе 5 мкл 10 x PCR буфера, 2 мкл 50 мм MgSO₄, 1 мкл dNTP 10 мм, 1 мкл вперед грунтовка 20 мкм, 1 мкл 20 мкм обратный грунтовка , 1 мкл высокой верности Платиновый Taq, gDNAs (~ 100 нг) и H₂O до 50 мкл.
   2. Используйте следующие условия реакции PCR: первоначальный денатурации на 94° C на 3 мин, 30 циклов денатурации на 94° C за 30 сек, отжиг при 60° C за 30 s и расширение на 68° C для 132 s и последний шаг 68° C в течение 10 мин.
   3. Анализ продуктов ПЦР электрофорезом в 1,0% агарозы.
   4. Клонировать ПЦР фрагментов с их ожидаемого размера в T-легко вектор и последовательности, чтобы подтвердить наличие частичной последовательности целевого объекта vector.

В этом документе описан подробный протокол Южный blotting и ПЦР, которая используется для идентификации HR события, которые произошли в ES клеток мыши для поколения Нм II генетических замена мыши модели, используя ES клеток-технологии на основе HR-опосредованной таргетинга. Хотя Южный blotting и ПЦР, а также традиционной ориентации гена технологии, широко использовались на протяжении нескольких десятилетий, успешное применение их необходимо тщательно планировать. По крайней мере эти аспекты должны быть рассмотрены: длина оружия длинные и короткие, позиции и длины зондов, REs подходит для резки геномной ДНК и праймеры для ПЦР, приводится на рисунке 1, который является полезным для последующий анализ. Как важный шаг, Южный blotting, подготовленные и переваривается геномной ДНК должны быть разделены на ДНК гель для обнаружения зондом. Потому что геномной ДНК вырезаются в много фрагментов с разной длины, они отображают статус мазок как на ДНК гель, предлагая полный пищеварение геномной ДНК, как указано на рисунке 2. В качестве последнего шага в Южный blotting сигналы радиоактивности меченых зонд гибридизировать с целевой фрагмент ДНК показаны на фильм, которые отражают события HR в ES клоны, тем самым, указывающее, является ли клон ES нужную. Согласно эскизный проект в этом исследовании ES клоны с мутировал аллеля имеют два различных размер полосы, в то время как одичал типа ES клонов есть только одна группа, предлагая желаемого ES клоны являются гетерозиготной (рис. 3). Относительно процедуры и результатов Южный blotting, операции и результаты ПЦР простой и прямой. После реакции PCR, продукты PCR может быть проанализирован на геле ДНК. Если диапазоны PCR являются конкретными и секвенирования клонированные продукты PCR подтверждает наличие частичной последовательности целевых вектора как нео сопротивление ген, а также геномной регионы, которые являются просто вне гомологии руку, может быть возникновение события HR ожидается и проверки (рис. 4).

Рисунок 1 : Ориентация конструкций. Это схема, демонстрируя поколения нескольких таргетинга конструкций. Аллель гена Myh9 (WT) одичал тип, ген ориентация вектора, замена экзогенных выражение cassette(s) и результирующая мутировавших allele(s), а также датчики (LP, RP) для Южная помарка и грунтовки (P1, P2) для ПЦР, показано и описано ранее ²⁷. стрелка на экзона 2 указывает сайт трансляционная посвящения. После успешного наступления HR, кассета выражение замены и сопротивления гена неомицина (Neo^r) вставляются только 5' о вызывающей кодон ГПТ. Таким образом нарушается эндогенного аллеля Myh9 и постучал в gene(s) является/выражаются в мутантные клетки и мышей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2 : Переваривается геномной ДНК с Dra I. Геномная ДНК от ES клоны с конструкцией, заменив NMHC II-A II-B, переваривается с Dra я и, затем, разделенных электрофорез на геле агарозы. Мазок как усваивается геномная ДНК наблюдается. C1 - C8 изображают индивидуальных клонов ES. Полное усвоение геномная ДНК производит много фрагментов ДНК с разной длины, тем самым показ мазок как изображения. Этот результат отражает хорошее качество подготовленных gDNAs и полноты пищеварение. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3 : Представитель результаты Южный blotting. Эти панели показывают Южный blotting показ геномной ДНК от ES клоны ориентированы с помощью конструкции замены NMHC II-A II-AB, с помощью левой и правой зондов. Мутировавших аллеля показывает группу 12.1 или 6 КБ используется зонд левой или правой зонд, соответственно, в то время как WT показывает полосу 9.7 КБ. M: маркер; PC1-PC5: позитивные клоны; NC: отрицательные клон. Также указаны размеры Южный blotting полос. Строго выполняются все процедуры Южный blotting и специфика зонды вполне достаточно; Там должно быть без неспецифические предпологаете полос для ожидаемого полос. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4 : Представитель результаты ПЦР. Эта панель показывает ПЦР выявления геномной ДНК от ES клоны ориентированы с помощью конструкции замены NMHC II-A II-BA с помощью пары праймера P1 + P2. Мутировавших аллеля дает группе 2.1 КБ, в то время как аллель WT дает не группы. M: маркер; PC1-PC3: позитивные клоны; NC: отрицательные клон. Также указывается размер группы ПЦР. Так как праймеры предназначены только обнаружить мутировавших аллеля, внешний вид одного и ожидаемые группы отражает специфику праймеры и высокое качество подготовленных gDNAs. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

В настоящее время дизайнер nucleases для изменения генома до сих пор не может заменить ES клеток ген ориентация технологии из-за своих проблем-целевого воздействия, и трудности в вставке длинный ДНК фрагмента^30,31. Как Золотой методы для выявления HR события, которые произошли в клетки мыши ES этот доклад содержит подробный протокол Южный blotting и ПЦР для поля. Мы проверить надежность этих методов путем анализа индивидуальных клонов из клеток ES мыши с ряда конструкций. Желаемого ES клоны, выявленных этими методами успешно использовался для создания соответствующего мыши модели²⁷.

Хотя другие методы для отбора целевых ES клонов были описаны^19,32, Южный blotting методы и ПЦР нельзя полностью заменить те впоследствии установлены³², потому что эти первоначальные методы имеют более прикладной историю и широко признается и подтверждается научного общества, осуществляется большинство биологических лабораторий и происхождения других технологий. Важно отметить, что хорошую производительность Южный blotting и ПЦР в определении событий HR хорошо проявляется в предыдущей работе²⁹. Результаты от Южный blotting показывают несколько уникальных особенностей: среди случайно отобранных ES клонов, свыше 90% из них являются нужные, обнаруживаются не неспецифических полос и HR произошло преимущественно на один аллель гена Myh9. Тем временем данные PCR, вместе с последовательности, подтверждают, что возникновение событий HR участкам и матч хорошо с теми, от Южный blotting.

Согласно нашей практике следует учитывать несколько факторов при Южный blotting и ПЦР-анализа используются для идентификации события HR в ES клеток, тем самым получать хорошие и ожидаемые результаты. Первый из них — длина гомологии оружия; в целом увеличение длины рукоятки гомологии позволит повысить эффективность HR³³. Однако это не всегда так. С одной стороны больше оружия увеличить сложность манипуляции; с другой стороны длина оружия гомологии (4 КБ для левой руки и 1.7 kb для правую руку) сообщили здесь привело к высокой частотой HR, полученные до настоящего времени среди подобных экспериментов. Кроме того разумной продолжительности гомологии оружия содействует выявлению методом ПЦР. Вторым является использование isogenic ДНК для подготовки гомологии оружия и Южный blotting зонды³⁴. Это могут быть удовлетворены, заказав клонов BAC, содержащий области гена интереса или с использованием геномной ДНК из клеток, намеревался быть ориентированы. В-третьих, выбор подходящего REs для переваривания геномной ДНК. В общем один RE или комбинация двух REs, которые сократить одичал тип или Мутантный аллель только один или два раза вокруг ориентации региона являются предпочтительными; Кроме того результирующий фрагмент ДНК больше не должен превышать 15 КБ и размер отдельных фрагментов ДНК отличается от более чем 2 КБ. Эти требования могут облегчить разделения и идентификации ожидаемых полос, Южный blotting. Четвертый — длина зондов и наименее сходство с другими последовательностями в геноме. Как правило длина зондов составляет 500 – 1000 bp. Сходство с другими последовательностями в геноме могут быть проанализированы с программой NCBI взрыва. Кроме того программное обеспечение для проектирования, зонды для Южный blotting был описан³⁵. Пятый фактор, чтобы рассмотреть является использовать обычные методы для подготовки геномной ДНК для повышения урожайности. Геномной ДНК, приготовленных из вырожденная хорошо 48-ну пластины, как правило, достаточно, по крайней мере двух раундов Южный blotting анализов. А проектирование праймеры PCR, лучшая стратегия заключается в использовании одного праймера настоящего на маркер выделения в сочетании с грунтом вне нацеленности оружия. Кроме того последовательность продуктов PCR имеет важное значение для доказательства HR события^20,36. Примечательно на основе ПЦР скрининг не может полностью заменить информацию, полученную через Южный blotting, хотя она может эффективно уменьшить количество клонов оцениваться.

В заключение Южный blotting и ПЦР являются четко продемонстрировали методы для отбора клонов ES для выявления HR-опосредованной ген таргетинг события в ES клеток. Хотя подробный протокол, описанные здесь главным образом сосредоточены на скрининг желаемого Нм II генетических замена ES клонов, он может использоваться для генотипирования мышей, которые впоследствии создаются с использованием позитивного клонов ES. Она может быть легко адаптирована к идентификации события HR в других типах клеток, таких как клетки iPS или соматические клетки.

Авторы не имеют ничего сообщать.

Эта работа получила поддержку Генеральной программы национального фонда естественных наук Китая (гранты № 31571432), человека провинциальных фонд Китая по естественным наукам (Грант № 2015JC3097) и исследовательский фонд образования бюро Хунань Провинция, Китай (Грант № 15 K 054).