JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לזיהוי רקומבינציה הומולוגית אירועים שהתרחשו במהלך בתאי גזע עובריים בעכבר באמצעות סופג בדרום ו/או ה-PCR. שיטה זו היא כשניסחתי את הדור של nonmuscle צולבות הקישור חוטים שרירן II גנטי החלפת העכבר מודלים בטכנולוגיה המסורתית עובריים מבוססי תאי גזע הומולוגי בתיווך רקומבינציה מיקוד.

Abstract

יחסית הנושאים של תופעות מחוץ-יעד, הקושי של הוספת קטע DNA ארוך היישום של nucleases מעצבים עבור גזע עובריים, עריכה הגנום (ES) מבוססת תא פילוח ג'ין אין חסרונות אלה וטכנולוגיה הוא נרחב משמש לשינוי הגנום חיה/עכבר ועד מחיקות גדולות/הוספות החלפות נוקלאוטיד יחיד. ראוי לציין, זיהוי אירועי רקומבינציה הומולוגית (HR) מעטים יחסית צורך להשיג הרצוי ES שיבוטים נמצא צעד מפתח, אשר דורש שיטות מדויקות ואמינות. סופג בדרום ו/או קונבנציונלי PCR מנוצלים לעיתים קרובות למטרה זו. כאן, אנו מתארים את תהליכי מפורט באמצעות אלה שתי שיטות לזיהוי HR אירועים שהתרחשו במהלך העכבר ES תאים שבהם הגן Myh9 אנדוגני נועד להיות משובשות והוחלף cDNAs קידוד אחרים nonmuscle צולבות הקישור חוטים שרירן שרשרת כבדה IIs (NMHC IIs). כל הליך סופג הדרומי כולל הקמת מיקוד vector(s), אלקטרופורציה, הבחירה בסמים, הרחבה, אחסון של ES תאים/שיבוטים, הכנה, עיכול, סופג של דנ א גנומי (gDNA), הכלאה של כביסה של probe(s), צעד סופי של autoradiography על הסרטים רנטגן. PCR יכול להתבצע ישירות עם gDNA מוכן, מדולל. כדי להשיג תוצאות אידיאלי, המחקרים וכל אנזים הגבלה (מחדש) חיתוך אתרים עבור סופג בדרום, את צבעי יסוד PCR צריך להיות תכננה בקפדנות. למרות ביצוע סופג הדרומי הוא מהגידולים ועתירת ויש PCR תוצאות חיוביות שגויות, הזיהוי הנכון על ידי סופג הדרומי ואת ההקרנה מהירה על ידי ה-PCR לאפשר היישום הבלעדית או בשילוב של שיטות אלה תיאר נייר זה להיות בשימוש נרחב ולא התייעץ על ידי רוב מעבדות הזיהוי של אחרים של תאים ES, גנטית שונה בבעלי חיים.

Introduction

הטכנולוגיה של ג'ין פילוח על-ידי HR מאתר ES תאים מספקת כלי רב עוצמה לנתח את ההשלכות הסלולר של מוטציות גנטיות מסוימות1,2. החשיבות והמשמעות של טכנולוגיה זו משתקפים ההכרה על ידי 2007 פרס נובל לפיזיולוגיה או לרפואה3,4; בינתיים, הוא מייצג את כניסתו של העידן המודרני של גנים הנדסה5. גן מיקוד דרך בית יכול להיות מנוצל כדי להנדס כמעט כל שינוי החל מוטציות נקודה גדולה rearrangements כרומוזומליות בגנום של העכבר ES תאים6,7. זה ידוע כי, לפני הופעתם של כלי עריכה הגנום כביכול, הדור של עכבר נוקאאוט גנטי נדרש היישום של טכנולוגיה פילוח ג'ין ES תאים8,9,10. במהלך שני העשורים האחרונים, יותר מ-5,000 גן במיקוד עכברים יוצרו על ידי גישה זו עבור מידול מחלות אנושיות או לומד ג'ין פונקציות11. מאמץ ההסתרה הגנום כולו הוקם להפצת וקטורים פילוח ג'ין, יישוב ES תא שיבוטים ועכברים בשידור חי הקהילה המדעית2,12,13,14 , 15. אין ספק, ES מבוססת תא בתיווך HR פילוח ג'ין הטכנולוגיה מאוד התקדמה הבנתנו הפונקציות של גנים שיחק בהקשר פיזיולוגיים או פתולוגי.

מאחר HR הינה אירוע יחסית נדירים מידע יונקים תאים16,17, הדבר החשוב, הצעד הבא בעקבות ג'ין פילוח מאתר ES התאים היא לנתח את מושבות רבות ES לזיהוי כמה שיבוטים עם מוטציות הנובעות HR עם הפגיעה המכוונת וקטור18. השיטות זהב לזיהוי אירועים ביממה כוללים סופג בדרום ו- PCR19,20. היתרונות של הגישות כוללות כי סופג הדרומי ניתן לזהות כראוי יישוב ES שיבוטים, מאפשר לחוקרים לנתח את המבנה של האירוע גן במיקוד, כגון אימות של החדרת עותק בודד הבונה, בזמן אסטרטגיה מבוסס ה-PCR מאפשרת הקרנה מהירה יותר של HR אירועים21,22. למרות ששיטות אלה יש חסרונות כגון כי הם זמן רב, תוכלו לעשות תוצאות חיוביות שגויות, השימוש קומבינטוריים אותם הוא נרחב התקבלה, שהוחלו על-ידי רוב מעבדות לזיהוי אירועים HR, ובמיוחד ב תאים ES, עבור יצירת גנטית שונה בעלי חיים.

שלושה איזופורמים של nonmuscle צולבות הקישור חוטים שרירן II (NM II) ביונקים, שכל אחד מהם מורכב של שני IIs NMHC זהים אשר מקודדים על ידי שלושה גנים שונים (בשם Myh9, Myh10 ו- Myh14), שני זוגות של שרשראות אור, מכונים NM II-A II-B, II-C23. מחקרים קודמים הראו כי לפחות איזופורמים של NM II-A ו- II-B חיוניים לפיתוח העכבר כי אין ויוו אבלציה של אלה איזופורמים התוצאות הקטלניות עובריים24,25,26. כדי לעקוף בעיה זו ולקבל הרומן תובנות פונקציות ספציפיות isoform של NM II-A ו- II-B בשלבים מאוחרים יותר של פיתוח העכבר, תחליף גנטי אסטרטגיה ES מבוססת תא בתיווך HR פילוח ג'ין בטכנולוגיית אומצה על ליצור סדרה של מודלים העכבר27. במהלך זיהוי שיבוטים ES הרצוי, סופג בדרום והן שיטות PCR נוצלו, אלה הוכח להיות יעיל ואמין27,28.

הנייר הזה מתכוון לספק תיאור מפורט של סופג דרום ו PCR, כולל העיצוב של מיקוד vector(s), probe(s), תחל ואת ביצוע ניסויים, כמו גם הניתוח של תוצאות כשניסחתי זיהוי האירוע HR התרחשות תאים ES ליצירת החלפת גנטי NM II העכבר נציג נתונים ומודלים. הפרוטוקולים של שתי השיטות המובאות כאן ניתן לאמץ גם לזיהוי של אחרים של תאים מהונדסים או בעלי חיים.

Protocol

1. עיצוב של מיקוד Construct(s), זונדי תספיג דנ א, צבעי יסוד PCR

  1. בחר הראשון קידוד אקסון (אקסון 2) של הגן Myh9 שיבוש או ההכנסה ביישום של נוק אאוט/דפיקה-אין דיווח כאן.
  2. אחזר 5-kb במעלה הזרם, 5-kb במורד הזרם רצפי דנ א המקיפים את אקסון Myh9 2 מהאתר genome.ucsc.edu .
  3. לנתח את דפוסי עיכול הגבלה של אנזימים (במיל ') עם 1-2 חתכים באזור זה 10-kb באמצעות תוכנת pDRAW לקביעת מתאימה RE(s) לעכל את ה-DNA גנומי עבור סופג הדרומי.
    הערה: Dra אני עונה על דרישה זו, נבחרה עבור המטרה.
  4. בחר קטע 4 kb הקרובה הזרם של אקסון Myh9 2 כזרוע הומולוגיה השמאלי (להא) ו- 1.7 kb פרגמנט מיידית במורד הזרם רצף כזרוע הומולוגיה נכון (RHA); בחרו קטע 1 kb מטר במעלה הזרם של להא כמו החללית השמאלי (LP) סופג הדרומי, קטע 1.2 kb 3' במורד הזרם של RHA כמו החללית נכון (RP), מבוסס על ניתוח לעיל.
  5. השתמש בתוכנית primer3 כדי לעצב את תחל ואחורה עבור הגברה אלה שברי DNA ארבעה על ידי ה-PCR. עיצוב זוג תחל עם פריימר לפנים את התגורר סמוך לטרמינל 3' של גנים עמידות (P1) neomyocin סמן הבחירה, ומהצמיגים הפוכה הממוקם ממש מחוץ RHA (P2).
    הערה: הזוג פריימר הזה ישמש לזיהוי שיבוטים ES ממוקד על ידי ה-PCR29.
  6. למצוא כפיל BAC 129Sv כיסוי העכבר Myh9 ג'ין לוקוס על-ידי ביקור באתר האינטרנט bacpac.chori.org (הערה: isogenic DNA היא עדיפה). לבודד דנ א BAC באמצעות ערכת מתאים לטיהור חתיכות גדולות של DNA ההוראות שסופקו על-ידי היצרן.
    הערה: DNA BAC מטוהרים ישמש כתבנית עבור הגברה PCR.
  7. צייר ייצוג סכמטי של מיקוד בונה, רגשים, תחל כדי לסכם את המידע הזה.

2. דור של מיקוד Construct(s), זונדי תספיג דנ א. הכנת תחל עבור ה-PCR

  1. להזמין את תחל PCR שתוארו לעיל, לפזר אותם לתוך ריכוז של 20 מיקרומטר.
  2. להגביר את הזרועות הומולוגיה וזונדים מאת PCR בפתרון התגובה כולל תחל הפוך קדמי ו- 1 µL µL 1 µL 1 של ה-DNA BAC (50 ng) כמו התבנית, 5 µL של המאגר עבור Pfu ו- µL 1 של אולטרה Pfu כמו ה-DNA פולימראז , H2O עד µL 50. לבצע את ה-PCR במכונת ה-PCR בתנאים הבאים: 95 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות; 95 ° C ל 30 s; 60 ° C ל 30 s; 72 ° C ו 1 kb/דקה; מחזורים; לבסוף, 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  3. לטהר PCR מוצרים באמצעות ערכת ניקוי PCR לפי הפרוטוקול המסופקים על ידי היצרן, elute שברי DNA עם 40 µL של H2O. לעכל את המוצרים PCR מטוהרים עם REs מוגדרות מראש בפתרון התגובה המכילה 5 µL מאגר x 10 מיל , 2.5 µL של RE1 ו- 2.5 µL RE2, ה-DNA eluted, ב- C ° 37 ח' 2 להפעיל את ה-DNA 1% ג'ל להיפרד יעד ה-DNA להקות, לסלק את ג'ל המכיל את המטרה DNA תחת אור UV, לטהר את שברי DNA היעד הג'ל באמצעות של ה-DNA ג'ל החילוץ ערכת לפי בפרוטוקול המסופקים על ידי היצרן ולאחר elute שברי DNA עם 40 µL של H2O.
  4. שיבוט החלפת הביטוי cassette(s) והידיים הומולוגיה לתוך וקטור mpNTKV-LoxP לפי סדר מוגבר וטיהר RHA להא, החלפת הביטוי cassette(s) שוחררו וקטורים אחרים כדי להשיג את המיקוד הסופי construct(s). לשכפל DNA שברי הגששים מוגבר וטיהר לתוך הווקטור T-קל.
  5. לאשר את רצפי כל שברי DNA משובטים על ידי רצף27,28.

3. הכנת מיקוד Construct(s) את אלקטרופורציה של תאים ES, ההגברה של שיבוטים ES

  1. להכין את כל המבנה מיקוד בעזרת ערכת maxiprep פלסמיד לפי הפרוטוקול המסופקים על ידי היצרן. Linearize כל פלסמיד לבנות על ידי לעכל את זה עם לא אני בתגובה 400 µL כולל µL 40 10 x המאגר לא אני, 10 µL של אני לא, 100 µg של ה-DNA, ו- H2O עד µL 400, ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  2. לטהר את construct(s) מיקוד ליניארית.
    1. לחלץ את הפתרון התגובה מתעכל 1 x עם אמצעי אחסון שווה של אלכוהול פנול: כלורופורם: Isoamyl (25:24:1), צנטריפוגה-כוח 2,000 x g למשך 10 דקות.
    2. להעביר את תגובת שיקוע צינור 1.5-mL לזרז את הדנ א באמצעות 2.5 x אתנול וביו -0.1 x 3 מ' סודיום אצטט (pH 5.2) (יחס נפח), צנטריפוגה-כוח 2,000 x g עבור 10 דקות.
    3. הסר לשטוף supernatant, את ה-DNA גלולה 1 x 1 מ של 75% אתנול, צנטריפוגה-כוח x 2,000 g עבור 5 דקות.
    4. הסר את תגובת שיקוע, מילה נהדרת בגדר דנ א במשך 5 דקות.
    5. להמיס בגדר DNA ליניארית במאגר טריס-EDTA (TE) סטרילי-ריכוז הסופי של µg 1/µL.
  3. מערבבים 50 µg של כל המבנה מיקוד ליניארית עם 0.5 x 107 ES תאים. לבצע את אלקטרופורציה-320 V, 250 µF. צלחת את התאים electroporated ES על מנות עם נימים MEF הניאו חסיני.
  4. לאחר 24 שעות, לעבור ES תא בינוני עם µg/mL G418 400 ל 200 מיקרומטר ganciclovir ולהמשיך תרבות 4 – 5 ימים עם שינוי בינונית מדי יום. לאסוף עמידים לתרופות שיבוטים ES. ובכן 48 לוחות.
    הערה: בדרך כלל, ארבעה לוחות 48-ובכן משמשים לכל מבנה.
  5. לשכפל את הצלחות 48-. טוב.
    הערה: סט אחד של הלוחות הוא cryopreserved, הסט השני משמש להכנת הדנ א הגנומי.

4. הכנת DNAs גנומית, העיכול עם Restriction Enzyme(s)

  1. להכין gDNAs ES התאים באמצעות ערכת מסחרי (ערכת טיהור DNA גנומי) עם שינויים מזעריים.
    1. להסיר מדיה של התרבות תאים ES ולהוסיף 500 µL של פתרון פירוק גרעין האטום, כולל RNaseA, ישירות אל הבארות כדי lyse התאים.
      הערה: תא lysate יכול להיות מאוחסן ב-80 מעלות צלזיוס או טיפל באופן מיידי.
    2. Pipet לאורך מספר פעמים lyse התאים לגמרי ולהעביר אותם ל צינור נקי 1.5-mL.
    3. להוסיף שליש אחד של אמצעי האחסון של חלבון משקעים לפתרון הצינורית 1.5 mL, מערבולת נמרצות עבור 20 s, להרגיע את הדוגמאות על קרח למשך 5 דקות ולאחר מכן, צנטריפוגה-כוח x 2,000 g עבור 5 דק העברת תגובת שיקוע אחר נקי mL 1.5 צינור מכיל את ביקום כוח נינג אמצעי שווה של אלכוהול איזופרופיל; מערבבים בעדינות את הפתרון. (שים לב כי ניתן לראות גדילי חוט כמו לבן ברגע זה). צנטריפוגה-כוח x 2,000 g עבור 1 דקות; לאחר מכן, למחוק את תגובת שיקוע.
    4. לשטוף בגדר gDNA עם 1 מ"ל אתנול 70% בטמפרטורת החדר, צנטריפוגה-כוח 2,000 x g עבור 1 דקות, וארוקן את תגובת שיקוע בקפידה, לאחר מכן, מילה נהדרת בגדר gDNA למשך 3 דקות.
    5. להמיס את gDNAs עם µL 100 של ה-DNA התייבשות פתרון ו, אז, דגירה על 65 ° C עבור 1 h או 4 ° C בלילה.
    6. החנות gDNAs-2-8 ° C.
  2. תקציר gDNAs עם מעוצבות מראש RE Dra אני להגדיר את תגובת עיכול 30-µL על ידי ערבוב 3 µL של 10 x מאגר עבור Dra אני, µL 3 של Dra שאני, 10 µg של gDNAs/המדגם, ו- H2O עד 30 µL, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  3. בדוק את שלמות התרגום של העיכול על ידי ג'ל דנ א, ניתוח µL 5 התגובה מעוכל, ולאחר מכן, להוסיף את µL 3 של 10 x מאגר DNA-טעינה עבור השלב שלאחר מכן.

5. הדרומי סופג וזיהוי PCR

  1. ההקרנה סופג בדרום
    1. הפרד את gDNAs מתעכל על ידי אלקטרופורזה העברה אל קרום.
      1. הכנת ג'ל אלקטרופורזה 1% agarose עם אתידיום ברומיד (EB), לטעון את הדגימות מ שלב 4.3 ועל סולם 1 kb, ולהפעיל את הג'ל עם מתח נמוך (30-40 V) בן לילה.
      2. להוציא את הג'ל, להצטלם עם מערכת הדמיה ג'ל דנ א לאחר אלקטרופורזה. בדוק אם gDNAs מעוכל, מופרדים מציג תמונת כמו השמצות.
      3. להשרות את הג'ל מגש עם פתרון N HCl 0.2 ולנער אותו בעדינות במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
      4. להעביר את הג'ל DNA-denaturing פתרון ולנער אותו בעדינות במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
      5. להחליף את הג'ל בתוך תמיסת DNA-נטרול ולנער אותו בעדינות במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
        הערה: הג'ל הוא נוטה שבירה לאחר שלב זה, אז זה חייב להיות מטופלים היטב.
      6. השתמש מערכת העברה מהירה כלפי מטה כדי להעביר DNAs את הג'ל הקרום. להרכיב את TurboBlotter ואת סופג מחסנית בהתאם להוראות היצרן.
        הערה: 10 x או 20 x תמיסת מלח-נתרן ציטראט (האס) פתרון משמש מאגר העברה. באופן כללי, 3 שעות של העברת הוא מספיק כדי להעביר 95% gDNAs ג'ל ממברנה; עם זאת, זמן ארוך יותר של העברת הוא לא מזיק.
      7. להוציא את הקרום, לשטוף אותה עם 2 x SSC עבור 1 דקות, לספוג את הנוזל עם רקמות ולאחר מכן קשר צולב את ה-DNA עם קרום באמצעות crosslinker UV.
        הערה: הקרום ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך שבוע.
    2. תווית שה-DNA רגשים עם רדיואקטיביות.
      1. לטהר את פלסמידים בדיקה באמצעות ערכת miniprep לפי הפרוטוקול המסופקים על ידי היצרן.
      2. שחרור ה-DNA קטעים של הגששים מן הווקטור פלסמיד מאת EcoR אני עיכול בפתרון התגובה כולל 5 µL מאגר EcoR אני, µL 2 של EcoR אני אנזים µg 20 של פלסמיד ה-DNA, H2O עד 50 µL , כבר שעתיים.
      3. בניהול של % 1 DNA ג'ל כדי להפריד בין שברי DNA בדיקה של וקטור, לטהר את שברי DNA הגששים עם ערכת חילוץ ג'ל דנ א לפי הפרוטוקול המסופקים על ידי היצרן.
      4. שימוש µL 1 של פתרון ה-DNA, מודדים את ריכוז הדנ א שברי DNA בדיקה עם ספקטרופוטומטרים באורך-גל של 260/280 ננומטר.
      5. להכין 40-ng של בדיקה DNAs צינור 1.5 מ עם µL 45 TE המאגר, מרתיחים 3 דקות, ספין בקצרה, ולאחר מכן, מקם את צינור על קרח למשך 2 דקות.
      6. להוסיף את DNAs בדיקה שפגע בסימני חום הצינור המכיל מוכן ללכת תיוג-DNA חרוזים (-dCTP), pipet למעלה ולמטה כדי לערבב, להוסיף 5 µL של dCTP [α32P], ואז, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
      7. לטהר את הגששים שכותרתו באמצעות G-50 microcolumns על פי ההוראות שסופקו על-ידי היצרן, ואז למדוד הרדיואקטיביות על ידי מונה נצנוץ (אופציונלי).
    3. Hybridize את membrane(s) עם הגששים שכותרתו.
      1. Prehybridize את הקרום.
        1. Prewarm הפתרון הכלאה ב 42 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות לערבב 20 מ של הכלאה prewarmed פתרון עם 200 µg של זרע סלמון מבושל DNA בשפופרת 50-mL.
        2. מקם את הקרום לתוך הצינור הכלאה. הוסף את הפתרון prehybridization מעורב הצינור הכלאה. למקם אותו לתוך התנור הכלאה (הסט מתגלגל, הטמפרטורה ב 42 ° C) ולתת את prehybridization להמשיך למשך 30 דקות.
      2. Hybridize את הקרום עם probe(s) עם תוויות.
        1. תוציאי את הצינור הכלאה ויוצקים את הפתרון prehybridization לתוך צינור 50 מ; להוסיף את המכשיר denatured (מחוממת ב 100 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות) מהשלב 5.1.2.7 הזה שפופרת, לערבב בעדינות.
          הערה: להפחית את בועות inducing.
        2. הפתרון מעורב לחזור ברכבת התחתית הכלאה ולבצע הכלאה ב 42 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
    4. לשטוף את membrane(s) להסיר את הגששים nonhybridized.
      1. למקם את membrane(s) לתוך מגש עם 1 x האס + 0.1% מרחביות ומנערים בעדינות-55 – 60 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
      2. להעביר את membrane(s) מגש עם 0.5 x האס + 0.1% מרחביות ומנערים בעדינות-55 – 60 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
      3. לבדוק הרדיואקטיביות-membrane(s) באמצעות מונה גייגר נייד כדי להחליט כביסה השלישי יש צורך.
    5. לחשוף את רדיואקטיבית על הקרום לסרטי רנטגן.
      1. הסר את הנוזל membrane(s) שטף.
      2. לעטוף את membrane(s) עם ניילון נצמד, לתקן אותם בקלטת חשיפה.
      3. לחשוף את הממברנה כדי שתי יריעות לסרטי רנטגן בחדר חשוך.
      4. מקם את הקלטת חשיפה ב-80 מעלות צלזיוס לילה או יותר.
    6. לפתח את הסרטים לדמיין את התוצאות. להעריך אם שיבוט ES המתאים הוא האחד הרצוי של רקומבינציה יישוב או לא, לפי הגודל של הלהקות DNA שזיהה את הגששים.
    7. Rehybridize קרום זהה על ידי גשושית נוספת לאחר הלונגי המכשיר בשימוש על פי הנוהל הבא: להוציא את הקרום בשימוש, לשטוף אותו x 1 עם H2O, והן לאחר מכן, דגירה זה בפתרון striping (55% formamide, 2% הצהבת, 1% מרחביות, H 2 O) ב 65 ° C עם טלטול עדין עבור h 1 – 2.
  2. זיהוי ה-PCR
    1. לבצע זיהוי ה-PCR של שיבוטים ES הרצוי ב- 50-µL התגובה פתרון כולל 5 µL של 10 מאגר x PCR, 2 µL של 50 מ מ MgSO4, 1 µL של 10 מ מ dNTP, µL 1 של פריימר לפנים 20 מיקרומטר, 1 µL של 20 מיקרומטר פריימר הפוכה , µL 1 של אמינות גבוהה Taq פלטינה, gDNAs (~ 100 ng), ו- H2O עד 50 µL.
    2. השתמש התנאים הבאים של תגובת ה-PCR: דנטורציה הראשונית ב 94 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות, 30 מחזורי דנטורציה ב 94° C ל 30 s, חישול ב 60 מעלות צלזיוס במשך 30 s וסיומת ב 68 מעלות צלזיוס במשך 132 s, וצעד הסופי של 68 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    3. לנתח את המוצרים PCR על ידי אלקטרופורזה ב- 1.0% agarose.
    4. לשכפל השברים PCR עם הגודל הצפוי שלהם לתוך וקטור T-קל ואת רצף לאשר הנוכחות של רצף חלקית של הווקטור היעד.

תוצאות

בנייר זה, פרוטוקול מפורט של סופג הדרומי, PCR מתואר, אשר הוא מנוצל כדי לזהות בית האירועים שקרו העכבר ES תאים עבור הדור השני NM גנטי החלפת העכבר דגמים, באמצעות ES תאים בתיווך HR מיקוד טכנולוגיה מבוססת. למרות סופג הדרומי, PCR, כמו גם טכנולוגיה פילוח ג'ין מסורתי, היה בשימוש נרחב במשך כמה עשורים, יישום מוצלח של אותם צריך להיות מתוכנן בקפידה. ההיבטים לפחות אלה נדרשים כדי להיחשב: אורך הזרועות קצרים וארוכים, עמדות, משך הגששים, מהשמורה מתאימים עבור גזירה את DNAs גנומית, תחל של PCR, כפי שסוכם איור 1, אשר הוא מועיל עבור לאחר מכן ניתוח. בתור צעד חשוב של סופג בדרום, DNAs גנומית מוכן, מתעכל נדרשים יופרדו על ג'ל דנ א לאיתור על ידי המכשיר. כי DNAs גנומית הם חתכו לתוך הרבה קטעים באורכים שונים, הם להציג מצב השמצות דמוי הג'ל דנ א, רומז על עיכול להשלים DNAs גנומית, כמצוין באיור2. כשלב הסופי של סופג בדרום, האותות של בדיקה התווית על-ידי רדיואקטיביות hybridizing עם קטע DNA היעד מוצגים בסרט, אשר משקפים את התרחשות האירועים HR שיבוטים ES, ובכך המציין אם שיבוט ES הוא האחד הרצוי. על פי predesign במחקר זה, ES שיבוטים עם מוטציה אלל יש שתי להקות גודל ברורים, בעוד פראי-סוג ES שיבוטים יש רק אחד הלהקה, רומז שיבוטים ES הרצויים נמצאים משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים (איור 3). באופן יחסי ההליך ואת התוצאות של סופג בדרום, הפעולה של ה-PCR והתוצאות פשוט וישיר. בעקבות התגובה PCR, ניתן לנתח את המוצרים PCR על הג'ל הדנ א. אם הלהקות PCR הספציפיים, קביעת רצף המוצרים PCR משובטים מאשרת את הנוכחות של רצף חלקית של היעד וקטור כגון גן ניאו-התנגדות, כמו גם באזורים גנומית מחוץ הזרוע הומולוגיה ההתרחשות של אירועים בית יכול להיות צפוי ולאמת (איור 4).

figure-results-1759
איור 1 : פילוח בונה. זהו שרטוט הממחיש את הדור של בונה מיקוד מרובים. אלל ג'ין (WT) Myh9 פראי-סוג, פילוח ג'ין וקטור, החלפת ביטוי אקסוגני cassette(s), את allele(s) מוטציה תוצאות, וכן את הגששים (LP, RP) תספיג דנ א, את צבעי יסוד (P1, P2) PCR, יוצגו ואילו שתוארה קודם לכן 27. חץ על אקסון 2 מציין האתר translational חניכה. בעקבות המופע המוצלח של HR, מוספים את הקלטת ביטוי החלפת ואת הגן ההתנגדות neomycin (ניאוr) רק 5' של codon ATG ייזום. לכן, אלל Myh9 אנדוגני מופרת, הפיל ב- gene (s) הוא/באים לידי ביטוי התאים מוטציה ועכברים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-2652
איור 2 : מתעכל גנומית DNAs עם Dra ט DNAs גנומית של שיבוטים ES ממוקד עם הבונה החלפת NMHC II-A II-B הם עם Dra אני מתעכל, ואז, כשהם מופרדים על ג'ל agarose באמצעות אלקטרופורזה. GDNA מעוכל השמצות דמוי הוא ציין. C1 - C8 מתארים שיבוטים ES בודדים. העיכול מלאה של gDNA מייצר המון שברי DNA באורך שונה, ובכך הצגת תמונה כמו השמצות. תוצאה זו משקפת גם באיכות טובה של gDNAs מוכן ושלמות של העיכול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-3373
איור 3 : תוצאות נציג סופג הדרומי. לוחות אלה מראים הקרנת blotting הדרומי DNAs גנומית מן שיבוטים ES ממוקד עם הבונה של החלפת NMHC II-A II-AB, באמצעות את הגששים ימינה ושמאלה. אלל מוטציה מראה להקה 12.1 kb או 6 קילו כאשר החללית השמאלי או בדיקה נכון, בהתאמה, בזמן WT מראה להקה 9.7 kb. M: סמן; PC1-PC5: שיבוטים חיובי; NC: שיבוט שלילי. הגדלים של הלהקות blotting הדרומי גם מצוינים. כל הפרוצדורות של סופג הדרומי בתכלית האיסור מתבצעות, יחודיות של הגששים טובה מספיק; צריך להיות ספציפי אין להקות מצפה עבור להקות הצפוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-4217
איור 4 : התוצאות נציג של PCR. לוח זה מציג זיהוי PCR DNAs גנומית שיבוטים ES ממוקד עם הבונה של החלפת NMHC II-A II-BA באמצעות צמד פריימר P1 + P2. אלל מוטציה התשואות להקה 2.1 kb, בעוד אלל WT מניבה שום להקה. M: סמן; PC1-PC3: שיבוטים חיובי; NC: שיבוט שלילי. הגודל של הלהקה PCR גם מצוינת. מאז תחל נועדו לזהות רק אלל מוטציה, המראה של להקה אחת והצפויים משקף ייחודה של תחל את ואיכות גבוהה gDNAs מוכן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

כיום, nucleases מעצבים לעריכה הגנום עדיין לא ניתן להחליף ES תא פילוח ג'ין טכנולוגיה מבוססת עקב בעיות שלה של אפקטים את המטרה, קושי הוספה של זמן DNA פרגמנט30,31. כמו השיטות הזהב לזיהוי HR האירועים שקרו העכבר ES תאים, דוח זה מספק פרוטוקול מפורט של סופג הדרומי, PCR עבור השדה. נוכל לאמת את המהימנות של שיטות אלה על ידי ניתוח שיבוטים בודדים של העכבר ES תאים ממוקדות עם סדרה של מבנים. שיבוטים ES הרצויים שזוהו על ידי שיטות אלה היה בשימוש בהצלחה כדי ליצור מודלים המתאימים העכבר27.

למרות טכניקות אחרות להקרנה של שיבוטים ES יישוב כבר מתואר19,32, שיטות סופג הדרומי PCR לא יכול להיות מוחלף לחלוטין על-ידי אלה שהוקמו לאחר מכן32, כי אלה בראשי תיבות טכניקות יש היסטוריה יישומית עוד מקובל, שאושר על-ידי החברה המדעית, המבוצעת על ידי רוב מעבדות ביולוגיות, ו הם מקור טכנולוגיות אחרות. חשוב, ביצועים טובים של סופג בדרום ו- PCR הזיהוי של בית אירועים הוא דוגמה טוב העבודה הקודם29. התוצאות של סופג הדרומי מצביעות על מספר מאפיינים ייחודיים: בין שיבוטים ES ממוסך באופן אקראי, מעל 90% מהם הם אלה הרצוי, להקות לא ספציפית לא מזוהים, בית מעדיפים אירע אלל אחד של הגן Myh9. בינתיים, הנתונים מכל PCR, יחד עם רצף, לאשר כי ההתרחשות של אירועים HR בייעודי לאתר, תואם היטב עם אלה של סופג הדרומי.

על פי האימון שלנו, מספר גורמים להתייחס כאשר סופג בדרום ו- PCR משמשים לזיהוי אירועים HR תאים ES, וכך להשיג תוצאות טובות הצפוי. הראשון הוא האורך של הזרועות הומולוגיה; באופן כללי, הגדלת אורך הזרוע הומולוגיה יהיה לשפר את היעילות של HR33. עם זאת, זה לא תמיד המקרה. מצד אחד, זרועה יותר ארוכה להגביר את הקושי של מניפולציה; מצד שני, אורך הזרועות הומולוגיה (4 kb עבור הזרוע השמאלית, 1.7 kb עבור היד הימנית) דיווחו כאן הביא תדירות בית הגבוה ביותר שהושג עד כה בין ניסויים דומים. בנוסף, באורך סביר של הזרועות הומולוגיה מקל על הזיהוי על-ידי ה-PCR. השני הוא הניצול של isogenic DNA להכנת הדרומי סופג הגששים34והידיים הומולוגיה. זו יכולה להיות מסופקת על ידי הזמנת שיבוט BAC המכיל את האזור של ג'ין-של-הריבית או באמצעות DNA גנומי מתאי נועדה להיות ממוקד. השלישי הוא הבחירה של REs מתאימים עבור עיכול DNAs גנומית. באופן כללי, RE אחד או השילוב של שני REs לחתוך את אלל פראי-סוג או מוטציה רק פעם או פעמיים סביב אזור מיקוד הם העדיפו; יתר על כן, המקטע דנ א גדולים יותר וכתוצאה מכך לא יעלה על 15 kb, ההבדל בגודל בין שברי DNA ייחודי מעל 2 ק. דרישות אלה יכולים להקל על הפרדה וזיהוי של להקות הצפוי על ידי סופג הדרומי. הרביעי הוא האורך של הגששים, הדמיון לפחות עם אחרים רצפי הגנום. באופן כללי, משך הגששים הוא 500-1000 bp. ניתן לנתח את הדמיון עם אחרים רצפי הגנום עם התוכנית NCBI הפיצוץ. יתר על כן, תוכנה המשמש לעצב הגששים עבור סופג הדרומי כבר תיאר35. הגורם החמישי כדי להיחשב היא להשתמש בשיטות קונבנציונליות כדי להתכונן דנ א גנומי התשואה עבור שיפור. DNAs גנומית שהוכנו טוב confluent של צלחת 48. ובכן הם בדרך כלל מספיק לפחות שני סיבובים של ניתוחים סופג הדרומי. לגבי עיצוב תחל עבור ה-PCR, האסטרטגיה הטובה ביותר היא להשתמש נוכח אחד פריימר על סמן הבחירה בשיתוף עם פריימר מחוץ הזרועות מיקוד. בנוסף, קביעת רצף המוצרים PCR חשובה להוכחת HR-אירועים-20,-36. ראוי לציין, הקרנה מבוססי ה-PCR לחלוטין אינו יכול להחליף את המידע שהושג דרך סופג הדרומי, בעוד זה יכול להפחית ביעילות את המספרים של כפילים כדי להעריך.

לסיכום, סופג בדרום ו- PCR הן שיטות היטב והפגינו לסינון ES שיבוטים כדי לזהות בתיווך HR פילוח גן אירועים תאים ES. על פי פרוטוקול מפורט המתוארים כאן בעיקר התמקדו הקרנת הסרט הרצוי שיבוטים גנטיים החלפת ES NM II, זה יכול לשמש עבור עכברים genotyping שנוצרו לאחר מכן באמצעות שיבוטים ES חיובי. זה ניתן להתאים בקלות לזיהוי של HR םיעוריא סוגי תאים אחרים, כגון תאי iPS או תאים סומטיים.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו קיבלה תמיכה מהתוכנית הכללית של הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (מענקים מס 31571432), את האנושי מחוזי מדעי הטבע קרן של סין (מענק מס 2015JC3097), את המחקר קרן של החינוך הלשכה של הונאן פרובינציה, סין (מענק מס 15 K 054).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
BAC CLONEBACPAC Resources Center (BPRC)bMQ-330E21
QIAGEN Large-Construct KitQIAGEN12462
QIAquick Gel Extraction KitQIAGEN28704
QIAquick PCR Purification KitQIAGEN28104
QIAprep Spin Miniprep KitQIAGEN27104
QIAGEN Plasmid Plus Maxi KitQIAGEN12963
PfuUltra High-Fidelity DNA PolymeraseAgilent600382
T-easy vectorPromegaA1360
Nuclei Lysis SolutionPromegaA7941
Protein Precipitation SolutionPromegaA7951
DNA Denaturing SolutionVWR351-013-131
DNA Neutralizing SolutionVWR351-014-131
Ready-To-Go DNA Labeling Beads (-dCTP)VWR27-9240-01
UltraPure SSC, 20xThermo Fisher15557036
UltraPur Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol (25:24:1, v/v)Thermo Fisher15593031
G418Thermo Fisher10131035
Salmon Sperm DNA SolutionThermo Fisher15632011
Platinu Taq DNA Polymerase High FidelityThermo Fisher11304029
Not IThermo ScientificER0592
Dra IThermo ScientificER0221
EcoR IThermo ScientificER0271
GanciclovirSigmaG2536
Whatman TurboBlotter Transfer System, Large KitsFisher Scientific09-301-188
[α32P]dCTPPerkinElmerNEG013H100UC
ProbeQuan G-50 Micro ColumnsGE Healthcare28-9034-08
Hybrisol I Hybridization SolutionMilliporeS4040
Kodak X-Ray FilmZ&Z Medical844 5702

References

  1. Gao, G., McMahon, C., Chen, J., Rong, Y. A powerful method combining homologous recombination and site-specific recombination for targeted mutagenesis in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (37), 13999-14004 (2008).
  2. Skarnes, W., et al. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474 (7351), 337-342 (2011).
  3. Vogel, G. Nobel Prizes. A knockout award in medicine. Science. 318 (5848), 178-179 (2007).
  4. Salsman, J., Dellaire, G. Precision genome editing in the CRISPR era. Biochemistry. Cell Biology. 95 (2), 187-201 (2017).
  5. Capecchi, M. Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century. Nature Reviews Genetics. 6 (6), 507-512 (2005).
  6. Van, d. W. L., Adams, D. J., Bradley, A. Tools for targeted manipulation of the mouse genome. Physiological Genomics. 11 (3), 133-164 (2002).
  7. Glaser, S., Anastassiadis, K., Stewart, A. F. Current issues in mouse genome engineering. Nature Genetics. 37 (11), 1187 (2005).
  8. Bradley, A., Evans, M., Kaufman, M. H., Robertson, E. Formation of germ-line chimaeras from embryo-derived teratocarcinoma cell lines. Nature. 309 (5965), 255-256 (1984).
  9. Robertson, E., Bradley, A., Kuehn, M., Evans, M. Germ-line transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector. Nature. 323 (6087), 445-448 (1986).
  10. Thomas, K. R., Capecchi, M. R. Site-directed mutagenesis by gene targeting in mouse embryo-derived stem cells. Cell. 51 (3), 503-512 (1987).
  11. Skarnes, W. C., et al. A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function. Nature. 474 (7351), 337 (2011).
  12. Collins, F. S., Rossant, J., Wurst, W. A mouse for all reasons. Cell. 128 (1), 9-13 (2007).
  13. Poueymirou, W. T., et al. F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses. Nature Biotechnology. 25 (1), 91-99 (2007).
  14. Pettitt, S. J., et al. Agouti C57BL/6N embryonic stem cells for mouse genetic resources. Nature Methods. 6 (7), 493-495 (2009).
  15. Gertsenstein, M., et al. Efficient Generation of Germ Line Transmitting Chimeras from C57BL/6N ES Cells by Aggregation with Outbred Host Embryos. PLoS One. 5 (6), 11260 (2012).
  16. Smithies, O., Gregg, R. G., Boggs, S. S., Koralewski, M. A., Kucherlapati, R. S. Insertion of DNA sequences into the human chromosomal |[beta]|-globin locus by homologous recombination. Nature. 317 (6034), 230-234 (1985).
  17. Deng, C., Capecchi, M. R. Reexamination of gene targeting frequency as a function of the extent of homology between the targeting vector and the target locus. Molecular & Cellular Biology. 12 (8), 3365 (1992).
  18. Lay, J. M., Friishansen, L., Gillespie, P. J., Samuelson, L. C. Rapid confirmation of gene targeting in embryonic stem cells using two long-range PCR techniques. Transgenic Research. 7 (2), 135-140 (1998).
  19. Langerak, P., Nygren, A. O. H., Schouten, J. P., Jacobs, H. Rapid and quantitative detection of homologous and non-homologous recombination events using three oligonucleotide MLPA. Nucleic Acids Research. 33 (22), 188 (2005).
  20. Gómezrodríguez, J., et al. Advantages of q-PCR as a method of screening for gene targeting in mammalian cells using conventional and whole BAC-based constructs. Nucleic Acids Research. 36 (18), 117 (2008).
  21. Kim, H. S., Smithies, O. Recombinant fragment assay for gene targeting based on the polymerase chain reaction. Nucleic Acids Research. 16 (18), 8887-8903 (1988).
  22. Joyner, A. L., Skarnes, W. C., Rossant, J. Production of a mutation in mouse En-2 gene by homologous recombination in embryonic stem cells. Nature. 338 (6211), 153-156 (1989).
  23. Ma, X., Adelstein, R. S. The role of vertebrate nonmuscle Myosin II in development and human disease. Bioarchitecture. 4 (3), 88-102 (2014).
  24. Malonek, D. Relationships between the dynamics of cortical blood flow, oxygenation, and volume changes following sensory stimulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, (1997).
  25. Takeda, K., Kishi, H., Ma, X., Yu, Z. X., Adelstein, R. S. Ablation and mutation of nonmuscle myosin heavy chain II-B results in a defect in cardiac myocyte cytokinesis. Circulation Research. 93 (4), 330-337 (2003).
  26. Conti, M. A., Evenram, S., Liu, C., Yamada, K. M., Adelstein, R. S. Defects in cell adhesion and the visceral endoderm following ablation of nonmuscle myosin heavy chain II-A in mice. Journal of Biological Chemistry. 279 (40), 41263-41266 (2004).
  27. Wang, A., et al. Nonmuscle myosin II isoform and domain specificity during early mouse development. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (33), 14645-14650 (2010).
  28. Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease: mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119 (1), 238 (2012).
  29. Liu, T., et al. Identification and characterization of MYH9 locus for high efficient gene knock-in and stable expression in mouse embryonic stem cells. PLoS One. 13 (2), 0192641 (2018).
  30. Saito, S., Adachi, N. Advances in the Development of Gene-Targeting Vectors to Increase the Efficiency of Genetic Modification. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 39 (1), 25-32 (2016).
  31. Langerak, P., Nygren, A., Schouten, J., Jacobs, H. Rapid and quantitative detection of homologous and non-homologous recombination events using three oligonucleotide MLPA. Nucleic Acids Research. 33 (22), 188 (2005).
  32. Martin, S. L., et al. A single amino acid substitution in ORF1 dramatically decreases L1 retrotransposition and provides insight into nucleic acid chaperone activity. Nucleic Acids Research. 36 (18), 5845-5854 (2008).
  33. Kamisugi, Y., Cuming, A. C., Cove, D. J. Parameters determining the efficiency of gene targeting in the moss Physcomitrella patens. Nucleic Acids Research. 33 (19), 173 (2005).
  34. Luo, Y., Bolund, L., Sørensen, C. B. Pig gene knockout by rAAV-mediated homologous recombination: comparison of BRCA1 gene knockout efficiency in Yucatan and Göttingen fibroblasts with slightly different target sequences. Transgenic Research. 21 (3), 671-676 (2012).
  35. Croning, M. D., Fricker, D. G., Komiyama, N. H., Grant, S. G. Automated design of genomic Southern blot probes. BMC Genomics. 11 (1), 74 (2010).
  36. Zimmer, A., Gruss, P. Production of chimaeric mice containing embryonic stem (ES) cells carrying a homoeobox Hox 1.1 allele mutated by homologous recombination. Nature. 338 (6211), 150-153 (1989).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

141PCRMyh9

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved