3D Microtissues для инъекций восстановительной терапии и высок объём наркотиков скрининг

Этот протокол описывает изготовления упругих 3D Макропористые microcryogels путем интеграции микротехнологий с технологией cryogelation. После загрузки с клетками, создаются 3D microtissues, который может быть легко вводится в естественных условиях для содействия регенеративной терапии или собраны в массивы в пробирке скрининга наркотиков высокой пропускной способности.

Чтобы обновить традиционные 2D клеточной культуры до 3D клеточной культуры, мы интегрировали микротехнологий с технологией cryogelation для производства Макропористые микромасштабной криогелей (microcryogels), который может быть загружен с различных типов клеток сформировать 3D microtissues. Здесь мы представляем протокол изготовить универсальный 3D microtissues и их применения в восстановительной терапии и наркотиков скрининг. Размер и форма управляемый microcryogels могут быть изготовлены на чипе массива, который может быть заготавливаемым от чип как отдельных клеток загруженных перевозчиков для инъекционного регенеративной терапии или далее собран на чип в 3D microtissue массивы для высокой пропускной способности скрининга наркотиков. Из-за высокой упругой характер этих микромасштабной криогелей 3D microtissues проявляют большой injectability для малоинвазивных клеточной терапии, защищая клетки от механической поперечной силы во время инъекции. Это гарантирует выживание расширенной клетки и терапевтический эффект в мышиной модели ишемии конечности. Тем временем Ассамблея 3D microtissue массивов в стандартном формате 384-multi ну облегчает использование общих лабораторных объектов и оборудования, позволяя высок объём наркотиков скрининг на этой платформе культуры универсальный 3D клеток.

Традиционные клеточной культуры на плоского двумерного (2D) поверхностей, таких как культуры блюдо или несколькими хорошо пластины, вряд ли может вызывать поведение клеток недалеко от их собственного государства. Точное повторение родной сотовой микросреды, которые состоят из различных типов клеток, внеклеточной матрицы и биологически растворимых факторов в трехмерной (3D) архитектуры^{1,2,3 ,4}, имеет важное значение для построения biomimicking тканей в пробирке для приложений в ткани инженерных, восстановительной медицины, биологии фундаментальных исследований и наркотиков обнаружения^{5,6,7 ,8,9}.

Вместо 2D клеточной культуры 3D клеточной культуры широко используется для продвижения biomimetic микро архитектуры и функциональные особенности клетки культивировали в пробирке. Популярные 3D клетки культуры метод заключается в совокупных клетки в сфероидов^7,8,9,10. Сотовый сфероидов может быть введен в поврежденных тканей с расширенной сотовой хранения и выживания, по сравнению с инъекции рассеянных клеток. Однако неоднородной сфероида размеров и неизбежных механических повреждений, введенной на клетки жидкости поперечной силы во время инъекции привести к плохой клеток терапевтические эффекты^11,12,13. Аналогичным образом присущие неравномерность в ходе агрегирования сфероидов сделало их перевод в 3D на основе ячеек высок объём наркотиков скрининг сложной¹⁰.

Другой метод для 3D клеточной культуры достигается с помощью биоматериалов, который обычно инкапсулирует клетки в водный гидрогели или пористых строительных лесов. Это позволяет для большей гибкости в построении 3D архитектуры. Для терапии клетки, инкапсулированные в сыпучих строительных лесов, обычно доставляются тела животного через хирургической имплантации, который инвазивных и травматические, тем самым ограничивая его широкий перевод к постели. С другой стороны водный гидрогели включить минимально инвазивная терапия, клетки, приостановлено в растворе прекурсоров гидрогеля в тел животных, позволяя в situ гелеобразования через термо-, химические или ферментативный сшивки¹¹. Однако как клетки доставляются хотя гидрогеля прекурсоров находятся все еще в состоянии водный, они также подвергаются механической сдвига во время инъекции. Не только так химических или ферментативный сшивки во время гелеобразования в situ гидрогеля также может наложить повреждения клеток внутри. Для скрининга наркотиков, при содействии биоматериала клеточных культур сталкиваются с проблемами с единообразия, управляемость и пропускную способность. С помощью гидрогели, клетки обычно участвуют во время гелеобразования, в которой процесс может повлиять на жизнеспособность клеток и функции. Гелеобразование во время заполнения ячейки также препятствует использование большинства высокопроизводительного оборудования, так как Гидрогель может потребоваться храниться на льду для предотвращения гелеобразования до заполнения ячейки, и гидрогеля возможно застревание дозирования советы, которые обычно очень тонкие, чтобы обеспечить точность для высокопроизводительного скрининга. Предварительно сформированных леса могут потенциально отдельных процедур изготовления биоматериала из клеточной культуры, однако большинство продуктов на основе эшафот доступны как сыпучих материалов с относительно низкой пропускной способности¹⁴.

Чтобы преодолеть некоторые из недостатков нынешних методов 3D культуры, мы разработали микротехнологий cryogelation интегрированные технологии для изготовления готовых и удобный microcryogel массив чип¹⁵. В этом протоколе желатин выбран иллюстрируют технология изготовления microcryogel как это биосовместимых, разложению, экономически эффективным, и никаких дальнейших изменений требуется для клеток вложения. Другие полимеры природные или синтетические источники также могут использоваться для изготовления, в зависимости от приложения. Через эту технологию мы можем изготовить миниатюрных и Высокоэластичный microcryogels с контролируемый размер, форму и структуру. При загрузке с различных типов клеток, 3D microtissues может быть сформирован для различных приложений. Эти уникальные особенности включить желаемый injectability, Защита ячеек и ориентированные на сайте удержания после инъекции в естественных условиях для расширения терапевтические эффекты. Это не только так microcryogels может быть дополнительно обработаны для формирования 3D microtissue массивов, которые совместимы с общей лабораторное оборудование и инструменты для реализации высокопроизводительных клеточной культуры для скрининга универсальный наркотиков и других клеточных анализов. Здесь мы будем подробно процесс изготовления microcryogels и ее после лечения как отдельные 3D microtissues или 3D microtissue массивы для двух важных приложений, клеточной терапии и наркотиков скрининг, соответственно^10,15 .

эксперименты на животных следуют строгим протокол, утвержденных Комитетом по этике животное на центр биомедицинских анализ, Университет Цинхуа. Соответствии с одобрения Комитета по этике, жировых тканях человека была получена из Департамент пластической хирургии Peking союза больницы с информированного согласия от больных.

1. изготовление 3D Microcryogels

1. , проектирование и изготовление чипов массив microstencil
   1. Использование коммерческого программного обеспечения дизайн массивы конкретных геометрий, таких как круги, эллипсы, треугольники или Клевер ¹⁴, в зависимости от последующих приложений.
      Примечание: Обратитесь к разделу 2 протокола для регенеративной медицины и статья 3 протокола для скрининга наркотиков для детали дизайна.
   2. Импортировать дизайн лазерной гравировки программного обеспечения, сопровождающих лазерный гравер. С помощью параметров лазерной согласно рекомендациям завода для лазерный гравер, лазер выгравировать импортированные дизайн на Поли (methymethacrylate) (PMMA) листы.
   3. Мыть microstencil массив фишки с дейонизированной воды для очистки мусора из лазерной гравировки. Сухой microstencil массив фишки на 60 ° C. магазине в запечатанном мешке при комнатной температуре для месяцев.
2. Изготовление чипов массив microcryogel
   1. microstencil место 4 массива фишки на панели образцов и вставить в плазме чище. Закройте крышку пылесоса и включите вакуумный насос для 2 мин, затем повернуть на максимальной мощности (18 Вт) для лечения microstencil массив фишки в плазме пылесос за 3 мин при комнатной температуре для увеличения гидрофильность.
   2. Добавить 0,06 г желатина, 1 мл деионизированной воды до 6% (wt/vol) желатина прекурсоров раствор (достаточно, чтобы сделать 5 фишек). Тепло при 60 ° C на водяной бане, чтобы растворить адекватно. Инкубируйте на льду на 5 мин
   3. Добавить 3 мкл глютаральдегид в раствор желатина прекурсоров до конечной концентрации 0,3%. Тщательно перемешать.
   4. Пипетку 200 мкл прекурсоров раствор с глютаральдегид на верхней поверхности чипа массив microstencil.
      Примечание: 200 мкл достаточна для чипа 75 мм × 25 мм независимо от дизайна. Увеличить сумму пропорционально при увеличении площади поверхности чипа.
   5. Вручную решение равномерно распределить над обломоком соскабливания назад и вперед с жезлом гнутое стекло 2-3 раза.
      Примечание: Каждый микро Ну на чипе microstencil могут быть заполнены с прекурсорами решения из-за их гидрофильной природы после плазменной обработки.
   6. Сразу же место прекурсоров решение заполненный массив чип в морозильной камере-20 ° C для 16 h для cryogelation.
   7. Регулировка лиофилизатор до-40 ° C на 30 мин поместить фишки массива после cryogelation в лиофилизатор и lyophilize массива чипы для 2 h в вакууме.
      Примечание: Microcryogels желатин с взаимосвязанных macropores образуются потому что лед, образующийся в cryogelation sublimes в лиофилизатор.
   8. Перейти к разделу 2 для лечения ишемии нижних конечностей (CLI) и разделу 3 для наркотиков высокопроизводительного скрининга.

2. Заготовка отдельных Microcryogels инъекционные формы 3D Microtissues для лечения CLI

1. заготовка отдельных microcryogels
   1. Дизайн массивов (75 мм × 25 мм) 600 кружков, каждый диаметром 400 мкм, в коммерческое программное обеспечение для строительства инъекционные 3D microtissue. Используйте ПММА толщиной 300 мкм для изготовления чипа microstencil массив как подробно говорится в разделе 1.1.
   2. Изготовить microcryogel массив фишки как раздел 1.2.
   3. Изготовить PDMS эжектор штырьковых выводов с тот же дизайн как и шаг 2.1.1 стандартной мягкой литографии ^{16 , 17}.
   4. Наложения microcryogel массив чип на вершине PDMS эжектор-штырьковых, совместив каждый microcryogel с эжектором ПИН в массиве. Нажмите microcryogel массив чип к эжектор штырьковых нажать microcryogels из microwells с выступающими контактами на штырьковых PDMS эжектор для сбора индивидуальных microcryogels.
   5. Урожай microcryogel в воду и собирать их с помощью ячейки сита. Использовать один фильтр для сбора microcryogels от одного чипа (т.е., 600 microcryogels).
   6. Microcryogels мыть с 0,1 М NaBH ₄ на льду для 20 минут утолить остатков uncross-связанных альдегид. Используйте 5 мл 0,1 М NaBH ₄ на чип. Отменить NaBH ₄ и мыть с 5 мл деионизированной воды 15 минут 3-5 раз, каждый раз,.
   7. Слейте воду из клеток ситечко и собирать microcryogels в один кластер в ячейке сетчатый фильтр и место одного кластера в одном 35-мм Петри с помощью Изогнутый пинцет. Добавьте 50-70 мкл деионизированной воды для каждого кластера и покрывают крышкой Петри. Аккуратно нажмите Петри блюдо на столе до уровня, все microcryogels, так что не microcryogels лежат поверх другой microcryogel сформировать монослоя microcryogels на поверхности Петри.
   8. Заморозить собранного microcryogels при-20 ° C для 4-16 h до лиофилизации их для 2 h (см. шаг 1.2.7). Магазин microcryogels в вакууме при комнатной температуре до дальнейшего использования.
2. Характеристика microcryogels
   1. оценить поры microcryogels путем сканирования изображений электронная микроскопия (SEM).
      1. Обездвиживания собранного и лиофилизированные microcryogels на держатель образца двухсторонний скотч и пальто с золотом с распыления нанесения покрытий для 90 s, прежде чем изображений SEM ¹¹. Оценивать и анализировать распределение диаметров пор в microcryogel от семи различных SEM изображений с помощью программного обеспечения для анализа изображений.
   2. Весят один кластер 600 лиофилизированные microcryogels в 35-мм Петри для веса сухих желатиновых microcryogels (GMs). Добавьте 60 мкл деионизированная вода кластер лиофилизированные microcryogels и ждать 30 s для microcryogels полностью поглощать воду и набухают. Весят опухшие microcryogels.
      1. Определить равновесие отек соотношение и пористость microcryogels, как отношение веса опухшие microcryogels сухих желатиновых microcryogels и соотношение веса провел воды в microcryogels что гидратированных microcryogels, соответственно ¹³.
   3. Меры injectability microcryogels с использованием программируемых шприцевый насос интегрирован с цифровой силой колеи ¹⁴.
      1. Пятно 600 штук microcryogels, Трипановый синий и приостановить в 600 мкл 15% раствор желатина для достижения однородной распределения. Загрузить microcryogel 1 мл суспензии в шприц 1 мл. Инъекционные смеси через 27-иглы прилагается к 1 мл шприц, с помощью программируемых шприц насоса при скорости потока 1 мл/мин
      2. Монитор реального времени впрыска силы цифровой силой калибровочных испытаний и участок кривой силы время. После инъекции, соблюдать целостность microcryogels под микроскопом.
         Примечание: GMs, приостановлено в 15% (wt/vol) раствор желатина можно плавно вводят и остались нетронутыми после инъекции.
   4. Характеризуют разлагаемость microcryogels.
      1. Во-первых, измерить вес одного кластера 600 лиофилизированные microcryogels в 35-мм Петри как сухого веса. Затем погрузите 600 лиофилизированные microcryogels в 2 мл 0,025% (vol/vol) трипсина/ЭДТА.
      2. Сбор microcryogels от решения с помощью стрейнер клеток в разных временных точках (т.е., 10, 20, 30, 40, 50, 60 и 70 мин.). Фитиль от избыточного решения с ткани. Измерить вес microcryogels в разное время точках и рассчитать степень деградации, как отношение веса microcryogel в определенный момент времени, microcryogel в момент нулевой.
3. Автоматическая загрузка клеток в microcryogels форме 3D microtissues
   1. простерилизовать microcryogels с шагом 2.1.8 системой стерилизации оксида этилена с 12 h газа экспозиции следуют 12 h дегазации в переменного токаUUM.
   2. Выбрать жировой производный Мезенхимальные стромальные клетки человека (использования) для лечения ишемического мыши задних конечностей. Изоляция клетки, следуя инструкциям как сообщалось ранее ¹⁸.
   3. Культура использования в росте носитель, содержащий 2% плода бычьим сывороточным (ФБС), 10 нг/мл эпидермального фактора роста (EGF), 10 нг/мл тромбоцитарный фактор роста bb (PDGF-bb), 1 X инсулина трансферрина селен (СТС), 10 ^-8 M дексаметазон, 10 ^-4 М аскорбиновая кислота 2-фосфат, пенициллин 100 ед/мл и 100 мкг/мл стрептомицина в среде DMEM/F12. Проход клетки в соотношении 1:3 когда вырожденная. Используйте клетки прохода от 3 до 5 в следующих экспериментов.
   4. Урожай использования с трипсина и количественной оценки количества клеток с помощью Fuchs-Розенталь Счетной палаты и Ресуспензируйте к плотности 8 х 10 ⁶ клеток/мл в среде рост использования.
   5. Пипетку 60 мкл использования подвеска на монослое 600 microcryogels с диаметром 400 мкм в 35-мм блюдо из раздела 2.1. Клетки автоматически поглощаются в пористых микро структуры microcryogels.
   6. Поддержания в камере увлажненные и инкубировать при 37 ° C 2 h разрешить клетки для присоединения. После 2 ч инкубации добавьте 2 мл питательной среды. Измените носитель каждые 2 дня. Культура использования загруженных microcryogels для 2 дней сформировать 3D microtissues.
   7. После 2 дней культивирования, Пипетка 100 загружен использования microcryogels в колодец на плиту 96-луночных, 120 мкл рабочего раствора резазурина, подготовленный согласно данным производителя ' s инструкция в каждой скважине. Проинкубируйте втечение 2 ч при 37 ° C.
      1. Обнаружить флуоресценции резазурина метаболизируется путем жизнеспособных клеток в Считыватель микропланшетов с легкие волны возбуждения 560 Нм и выбросов легкие волны 590 нм. Создание стандартной кривой количества клеток против флуоресценции, с помощью использования интерполировать номер клетки от интенсивности флуоресценции для будущего эксперимента согласно комплект протокола ¹³.
   8. Оценить количество использования в microcryogels от дня 0 день 4 с помощью резазурина, как описано в разделе Шаг 2.3.7 от дня 0 день 4.
   9. Пятно клетки в microcryogels с Флуорексон утра разбавления 1: 500 и 1: 250 разрежения пропидий йодидом (известный как жить/мертвые окрашивание) в-фосфатный буфер (PBS) и наблюдать под флуоресцентным микроскопом или конфокальный флуоресцентным микроскопом.
4. Для инъекций 3D microtissues в естественных условиях для лечения CLI в мышиной модели
   1. создать задних конечностей критической ишемии женского ню мышей BALB/c как сообщил ^{11 , 19} для определения терапевтический эффект 3D терапии на основе microtissue.
   2. Передачи microtissues из шага 2.3.6 с помощью пипетки 5-мл в ячейки сита и фильтр от культуры среднего.
   3. Ресуспензируйте загружен использования 3D microtissues в 15% раствор желатина, на плотности 100 microcryogels за 100 мкл раствора.
   4. До операции, стерилизовать хирургические инструменты в автоклаве и выполнять операции в операционной комнате животных в животных центр.
   5. Поместите курсор мыши в камеру индукции анестезии, содержащие 1-3% изофлюрановая в 100% кислорода со скоростью потока 1 Л/мин эритромицин применить на глазах мыши для предотвращения высыхания. Через разрез кожи длиной 1 см, перевязать бедренной артерии и ее ветвей с шелковыми швами 5-10 и акцизных ¹⁹.
   6. Придать indocyanine зеленый (ГСИ) (0,1 мл по 100 мкг/мл), через хвост вен инъекции, чтобы контролировать поток крови. Выполнять ГСИ флуоресценции изображений с помощью флуоресценции изображений системы (здесь, домашние системы) в отражательной геометрии ¹¹.
   7. Внутримышечно ввести microtissues в три сайты gracilis мышцы вокруг разрез артерии, используя шприц 1 мл с иглой 23-калибруйте.
   8. После операции, согреться мыши с подогревом площадку в клетке восстановления. Вводить подкожно Мелоксикам, чтобы облегчить боль и мониторинга непрерывно, пока спит.
   9. После 28 дней, контролировать Терапевтическая эффективность 3D microtissue лечить конечности флуоресценции изображений ¹¹.
      Примечание: Вводить подкожно Мелоксикам, чтобы облегчить боль, когда мышь показал ампутация конечностей спонтанно.
   10. Euthanize мышей с двуокиси углерода после завершения экспериментов.
       Примечание: Здесь, эвтаназия диоксидом углерода была выполнена согласно строгим протокол, утвержденных Комитетом по этике животное на центр биомедицинских анализ, Университет Цинхуа.

3. Собрание Microtissue массив чип для высокопроизводительного скрининга наркотиков

1. Ассамблеи microcryogel массива для на чипе клеточной культуры
   1. изменить дизайн в разделе 1.1 согласно измерениям обычными мульти хорошо пластины, то есть, для формата 384-multi Ну, Дизайн массив 16 × 24 скважин (строки по столбцу), каждый 2 мм диаметром и 4,5 мм-центр интервал.
   2. Лазерной гравировки на 500 мкм толстый лист PMMA, как описано в разделе 1.1.
   3. Fabricate microcryogels, как описано в разделе 1.2 используя полученную 384-multi ну массив чип от шаг 3.1.2. Этот массив microcryogel содержащих обозначается как чип массив microcryogel.
   4. Мыть чип массива microcryogel с 50 мл 0,1 М NaBH ₄ утолить любой остаточный альдегид uncross-связаны, затем неоднократно промойте с 50 мл деионизированной воды 2 h 3 раза, каждый раз.
   5. Слейте воду, заморозить чип массив microcryogel при-20 ° C для 4-16 h до лиофилизации согласно шагу 1.2.7.
   6. Изменить 384-multi ну массив дизайн в действии 3.1.1 содержит 16 × 24 скважин, каждый из 3 мм диаметром и 4,5 мм-центр интервалов.
   7. Удалить одну сторону минусовки из листа ультра-тонкий (10 мкм) биосовместимых двухсторонний скотч и вставьте его в одну сторону кусок лист PMMA толщиной 3 мм. Лазерной гравировки дизайн от шага 3.1.4 на этот лист PMMA толщиной 3 мм в соответствии со статьей 1.1. Этот массив обозначается как массив водохранилище.
   8. Выравнивание массива microcryogel чип с чипом массив водохранилища и следовать вместе плотно, чтобы собрать 3D microcryogel массив чип для на чипе клеточной культуры. Стерилизовать ультрафиолетового излучения на 1 ч.
   9. 3D microcryogel массив хранения щепы в вакууме при комнатной температуре для дальнейших экспериментов.
2. Наркотиков скрининг на 3D microtissue массивы
   1. заполнить вверх мокрой коробку с 25 мл стерильного деионизированной водой в качестве камеры влажности для клеточной культуры. Подогрейте в увлажненные 5% CO ₂ инкубатора 37 ° C.
   2. Урожай не небольшие клеток легких клетки рака (NCI-H460) и гепатоцеллюлярной карциномы клетки (HepG2) от культуры ткани пластины согласно стандартный протокол и вновь приостановить в культуре средств массовой информации к окончательной плотности 1,0 x 10 ⁶ клеток/мл. Тщательно перемешать.
      Примечание: RPM1640 с 10% FBS, 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина 100 мкг/мл используется для NCI-H460. Используйте DMEM с 10% FBS, 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина 100 мкг/мл для HepG2.
   3. Удаление влажности камеры из инкубатора. Используйте пинцет тщательно место собраны 3D microcryogel массив чип из шага 3.1.9 в зале влажности. Соблюдайте осторожность, чтобы вода не попала в microcryogels с водой в камере.
   4. Перемешать суспензию клеток тщательно, затем аликвота 3 мкл суспензии клеток прямо на microcryogel в каждой скважине.
      Примечание: Наконечник пипетки следует слегка коснитесь поверхности microcryogel до высылки суспензию клеток. Клетки, автоматически загружаются в microcryogel путем поглощения. Не семян клеток в периферической Уэллс.
   5. Добавить 10 мкл средств массовой информации для каждой скважины после того, как клетки будут посеяны в microcryogel с помощью многоканальных пипетку, например жидких обработчик 96-канал. Средний также добавляется в периферийных скважин.
      Примечание: Использование RPM1640 СМИ с 10% FBS, пенициллин 100 ед/мл и 100 мкг/мл streptomycin для H460 клеток. Используйте DMEM СМИ с 10% FBS, 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина 100 мкг/мл для клеток HepaG2.
   6. Культура клеток загруженных microcryogel массив чип в камере 24 h в увлажненные 5% влажности CO ₂ инкубатора при 37 ° C массив 3D microtissue.
   7. Растворяют доксорубицин и IMMLG-8439 ⁹ в диметилсульфоксида (ДМСО) сформировать Стоковый раствор 10 мм. Разбавляют препараты с питательной среды для формирования градиента концентрации десятикратного разрежения от 2 Нм до 200 мкм.
   8. Добавить 10 мкл препарата решений в каждой скважины. Используйте 0,1% ДМСО (разбавленный в среде) в качестве элемента управления. Инкубировать массив загруженных 3D microtissue наркотиков в увлажненные 5% CO ₂ инкубатора при 37 ° C за 24 ч.
   9. Добавить 4 мкл раствора резазурина запасов для каждой скважины. Инкубировать при 37 ° C 2 h. место 3D microtissue массива в Считыватель микропланшетов и обнаруживать флуоресценции резазурина метаболизируется путем жизнеспособных клеток в легкие волны возбуждения 560 Нм и выбросов легкие волны 590 нм.
   10. Вычесть резазурина базовый сигнал от всех скважин перед дальнейшей обработки данных. Рассчитать долю жизнеспособность клеток каждой скважины, разделив его флуоресценции сигнала средняя флуоресценции сигнал управления скважин.
   11. Участок кривой доза ответ в построения программного обеспечения с долей жизнеспособность клеток как десятичный логарифм концентрации наркотиков как по оси x и оси y. Интерполировать 50% инибиторной концентрации (IC50) на долю жизнеспособность клеток 0,5.

Изготовление и характеристика microcryogels для формирования 3D microtissue.

Согласно протоколу microcryogels были изготовлены формы 3D microtissues и отдельных microcryogels или microcryogel массивы и были применены к восстановительной терапии и наркотиков скрининг, соответственно (рис. 1). Microstencil массив фишки изготовлены из PMMA применялись как micromolds для microcryogel массив чипов. Переменной геометрические конструкции может быть подготовлен для чипа массива microstencil. Мы выбрали представитель 45 х 14 мм microstencil массив чип в качестве примера, который содержит различные формы (т.е., круг, эллипс, треугольник и клевер) и чип массив кольцеобразной формы microstencil с разных размеров (диаметром = 100, 200, 400 и 800 мкг m). для повышения видимости micromolds на чипах массива, легкие epi освещение изображения были замечены (Рисунок 2а, Б). Microcryogels, добываемых из массива фишки выставлены желаемой формы и размеров (рис. 2 c, D). Такие microcryogels с желаемой геометрических особенностей возможно может быть применен как шаблоны для формирования различных клеточных единиц, которые имитируют некоторые архитектуры родного тканей. Собранный GMs (желатина microcryogels) был предварительно определенных форм и размеров (рис. 3A). SEM наблюдения показали, что microcryogels содержит взаимосвязанных Макропористые структур с порами размером в диапазоне от 30-80 мкм (рисунок 3B).

Расширение injectability загружен использования microtissues для улучшения ишемии конечности бабло

Использование программируемых шприцевый насос интегрирован с цифровой датчик¹⁴, injectability GMs была количественно оценена. В 1 мл/мин скорость потока GMs с плотностью 1000 microcryogels мл вводили младше 6 N, который был ниже, чем клинически приемлемым сила 10 N²⁰ (Рисунок 3F). Основываясь на защите клеток, активизируемые GMs, использования в GMs имел высокую жизнеспособность и поддерживается большой пролиферативный потенциал после инъекции в течение 5 дней культуры (рис. 3 H).

Модель ишемии конечности мыши был выбран для оценки терапевтической эффективности инъекционные МСК загружен microtissues. Физиологическое состояние ишемии конечностей было рассмотрено 28 дней после операции (рис. 4A). Не спасти конечности наблюдалась в Шам или GMs управления группы. В группе 10 лечения Свободная ячейка⁵ ампутации ног всего 50%, 25% частичное мыс ампутации и 25% частичное конечности ампутации наблюдались в течение 7 дней, что приводит к потере конечности 80% и 20% всего мыс ампутация после 28 дней. В противоположность этому, microtissues лечения с 10⁵ использования достигнуто улучшение конечностей бабло (75%) с только 25% мышей показало спонтанное мыс ампутации после 28 дней., 10⁶ использования минимального эффективного мобильный номер, используемый в большинстве предыдущих исследований, был выбран в качестве позитивного управления²¹. Только 2 из 4 мышей показало конечности бабло, но все были незначительные некроза.

Перфузии крови контролируется и оценены в помощи indocyanine зеленый (ГСИ), FDA утвержденных агента ангиографическое контраст. Результат показал, что флуоресценции сигналы появились в microtissue лечение мышей и 10⁶ свободного использования обработанных мышей. Нет сигнала очевидным флуоресценции в ишемическом гомотерия в Шам или группа ГМ до дня 28 (Рисунок 4B).

Эти результаты далее подтвердил, что 3D при содействии microtissue использования терапии достигнуты улучшенные терапевтические эффекты для лечения CLI, который представляет собой минимальные эффективной дозы для терапии на основе ячеек в модели мыши пока.

Высок объём наркотиков скрининг цитотоксичность на чипе массив 3D microtissue

Готовые к использованию 3D microcryogel массива для на чипе клеточной культуры могут легко сфабрикованы сохраняя microcryogels ПММА чипе после лиофилизации и объединения с соответствующей хорошо массив чип с биосовместимыми клейкие ленты (рис. 1 и Рисунок 5A). В этом массиве культуры двух частей клетки Топ чип хорошо массив служил резервуары для питательной среды, решения наркотиков и пробирного реагентов, в то время как клетки были культивировали в 3D microcryogel, иммобилизованных на нижней массив чип. Клейкие ленты между верхней и нижней массив чипа позволило поколения 384 отдельных скважин для высокой пропускной способности 3D клеточной культуры (Рисунок 5B), таким образом обеспечивая практическим инструментом для обнаружения наркотиков.

Как описано в протоколе, 3D microtissue массив был сформирован непосредственно заполнение клеток в microcryogels перед добавлением среднего к водоемам. С помощью ППП меченых низ 3T3 клеток, мы показали, что клетки были равномерно распределены с несколькими слоями в 3D архитектура microcryogels (рис. 5 c, D). SEM изображения показали, что клетки твердо придерживаться стен поры и даже выставлены расширенный filopodia вдоль или поперек смежных стен macropores в microcryogels (Рисунок 5E).

Затем мы показали целесообразность применения этой 3D microtissue массива для высокой пропускной способности наркотиков испытания с использованием двух линий клетки рака и два соединения. Гепатоцеллюлярной карциномы клетки (HepG2) относились с доксорубицином, в то время как не небольшие клеток легких клетки рака (NCI-H460) лечили IMMLG-8439, ингибитор новая опухоль. Пяти до девяти дискретных концентрации каждого препарата осуществляется в шести соседних скважин как репликация, с 0.1% ДМСО в среде культуры как отрицательный контроль. Цитотоксичность пробирного аналогичным образом была исполнена для клетки культивировали в традиционных 2D несколькими хорошо пластины. После 24 ч инкубации assay жизнеспособности клетки была использована для оценки реакции наркотиков клеток в 2D и 3D. Кривые ответ наркотиков были построены с использованием ставок жизнеспособности нормализованных клеток в различных концентрациях, и IC50 затем интерполированный из этих кривых. Более высокие значения IC50 будет означать, что клетки более лекарственной устойчивостью. Рисунок 5F и 5Iмы наблюдали значительное увеличение в лекарственной устойчивости, когда клетки были культивированный на 3D microtissue массив, чем в 2D. IC50 доксорубицин против HepG2 клетки достигли 165.959 мкм, по отношению к 18.239 Нм на 2D; Аналогичным образом IC50 IMMLG-8439 на клетки NCI-H460 возведен в 331.894 Нм в 3D, требуя только 1,294 Нм на 2D. Такие наблюдения был в соответствии с докладами более лекарственной устойчивости в 3D культуры над 2D культуры других исследователей^22,23.

Мы объяснить такие увеличения лекарственной устойчивости к сложности 3D микроокружения, по сравнению сплоская конфигурация 2D культуры. SEM изображения показали, что клетки HepG2 собрались как сфероидов декорирования поверхностей macropores в microcryogel. Эти клетки плотно сосредоточены и такое взаимодействие более ячеек может быть источником лекарственной устойчивости в HepG2²². Было также интересно отметить, что эти кластеры клеток не были свободно приостановлено сфероидов, как они по-прежнему поддерживали некоторые адгезии к матрице (рис. 5 g, H). И наоборот эпителия мезенхимы переход (EMT) был предположил место, когда раковые клетки легких-маленький, NCI-H460, были культивированный на 3D microcryogels. NCJ-H460 клетки распространяются как фибробластов (Рисунок 5J, K) вместо кластеризации как HepG2. Следовательно мы предположили, что увеличение лекарственной устойчивости может быть результатом переход клеток эпителия NCI-H460 для более злокачественной государства^{18,19,20,21,22 ,23}.

Рисунок 1 : Схема 3D Microtissue изготовление и применение регенеративной терапии и наркотиков скрининг. Вкратце размер и форма управляемый microcryogel чип производилась на чипе ПММА массив cryogelation желатина. Microcryogel чипы могут быть заготавливаемым от чип в качестве отдельных microcryogels и далее, индивидуальный microcryogels может быть автоматически загружается с клетками и культивировали сформировать 3D microtissues для инъекций восстановительной терапии. Еще одно применение microcryogel чипов является собрать с чипом массив водохранилище и затем Далее, загрузить клетки и культуры в 3D microtissue массивы для наркотиков высокопроизводительного скрининга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2:Microstencil массив чипов. (A, B) Фотографии двух чипов microstencil ПММА содержащие выстроил microwells с различной формы (т.е., круг, эллипс, треугольник и клевер) и круглой формы с различными размерами (диаметр: 100, 200, 400 и 800 мкм), соответственно (A), и две соответствующие чипы массив microcryogel (B). (C, D) Микроскопических изображений отдельных microcryogels, собирают из двух microcryogels массив фишек. Шкалы бар = 500 мкм. Эта цифра была изменена с разрешения ссылка¹⁴. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 3 : Характеристика 3D инъекционный Microtissues. (A) фотографии собранного microcryogels. (B) сканирование изображений электронная микрофотография (SEM) microcryogels, показаны в взаимосвязанные и Макропористые структур. (C, D) Флуоресценции микроскопические и 3D реконструирована конфокального изображения загружены использования microtissues запятнана жить/мертвые и родамин Фаллоидин. (E) количественная оценка использования самозарядные и распространения в ОУП с начальной загрузки различных плотностей. (F) в реальном времени впрыска силы измерения кривых для тройной инъекции 1000 GMs в 1 мл раствора желатина 15% (wt/vol) скоростью инъекции 1 мл/мин (1000-1-15%). (G) Live/мертвые клетки жизнеспособности пробирного использования загруженных microtissues Предварительный впрыск и впрыск. (H) распространение использования загруженных в GMs дополнительный впрыск 1, 3 и 5 дней культуры (n = 3). * p < 0,05, односторонний дисперсионный анализ, по сравнению с 1 день. Данные представлены как означает ± SEM. Эта цифра была изменена с разрешения ссылки¹¹. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4:бабло улучшил и увеличил ангиогенеза в ишемическом гомотерия, относились с 3D инъекционный Microtissues. (A) представитель фотографии Шам (n = 4), бланк microcryogels (n = 4), свободного использования (10⁵) (n = 8), использования (10⁵)-загружается microtissues (n = 8) и свободного использования (10⁶) (n = 4) на 0, 3, 7 и 28 дней после лечения. (B) флуоресценции фото полученные 100 s после инъекции мкг в день 28. Эта цифра была изменена с разрешения ссылки¹¹. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 5 : 3D Microtissue массива для наркотиков высокопроизводительного скрининга. (A) фотография 3D microtissue массива в формате 384-multi Ну после сборки и (B) резазурина assay жизнеспособности клетки выполнена в массиве. (C) ЗП 3T3 клеток в microcryogel после посева (шкалы бар = 200 мкм). (D) 3D реконструкция ядер, окрашивание, изображающие однородное распределение ячеек в нескольких слоях в microcryogel. (E) сканирование изображения электронная микрофотография ЗП 3T3 клеток, широко распространяется на Макропористые стены в microcryogels (шкала бар = 20 мкм). Цитотоксичность испытаний доксорубицина (F) на HepG2 клетки и клетки (я) IMMLG-8439 на NCI-H460 в 3D microtissue массив показаны увеличилась IC50 по сравнению с их коллегами-2D. Данные отображаются как средний ± SD. (G) маленький сфероидов HepG2 клеток в microcryogel (шкалы бар = 100 мкм), с (звездочками в H) частичное соблюдение на microcryogel стену (шкалы бар = 20 мкм). (J) NCI-H460 клеток придерживался и распространяются в рамках microcryogel (шкала бар = 100 мкм). (K) NCI-H460 клеток выставке композиционныеoblastic морфологии (шкала бар = 20 мкм). Эта цифра была изменена с разрешения ссылка⁹. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Регенеративной медицины и в пробирке модели для скрининга наркотиков являются два важных приложений для ткани инженерных^5,6,,78,9. Хотя эти два приложения имеют весьма различные потребности, точки соприкосновения между ними заключается в необходимости для более biomimetic культивирования условие для расширения функций клеток¹⁹. Только с функциями Улучшенная ячейка в исследованиях мы можно лечить болезни, более^20,21, и если культивируемых клеток более точно отражать ответы на наркотиков мы могут ускорить наркотиков открытие^6,7. Выживание клетки после приживления в естественных условиях является важным требованием для регенеративной медицины, в то время как пропускная способность имеет важное значение для скрининга наркотиков для обработки тысяч соединений в одно время. Эти два требования для их соответствующих приложений, и редко одна технология может соответствовать требованиям. Таким образом мы однозначно включили микротехнологий технологии с cryogel подготовкой для производства Макропористые microcryogels, который может быть заготавливаемым от чип как отдельные клетки загружен перевозчиков для восстановительной терапии, или сохранено на чип для дальнейшего Ассамблея в массив для наркотиков высокопроизводительного скрининга. Микромасштабной и macroporosity этих Роман microcryogels позволяют автоматическое и однородной загрузки клеток путем простой поглощения. С помощью Роман microstencil изготовление чипов microcryogel массив, сотни и тысячи микромасштабной криогелей с единообразной и воспроизводимые геометрических особенностей могут быть легко и эффективно получены. Microcryogels могут быть подготовлены и хранятся в вакуумной упаковки как готовых, готовый к использованию продукт для облегчения подготовки 3D microtissues в общем лаборатории для последующего применения. Используя эту технику изготовления, мы смогли встретиться как общность (3D культуры условие для лучшего biomimicry), так и конкретные требования для двух различных приложений (эластичность для защиты клеток во время инъекции для регенеративной медицины и высок объём в формате массива, который для скрининга наркотиков).

На основе клеток терапия имеет большие перспективы для ремонта различных поврежденных тканей или органов²⁴. Однако сохранение клеток, выживание клетки и воспроизводимости результатов лечения по-прежнему плохо из-за механического повреждения во время инъекции, высокая утечки окружающих тканей и ишемии и воспаления в в естественных условиях окружающей среды в пределах поражения ²⁵тканей. Некоторые исследователи использовали преформированных клеточных агрегатов для улучшения свободную ячейку инъекций. Однако это требует большое количество клеток для агрегатов формы клеток, что приводит к высокой стоимости, размера неоднородной и неконтролируемой совокупного числа²⁶. Кроме того механических повреждений и гибели клеток еще неизбежны во время инъекции. Кроме того был разработан при содействии биоматериала клеточной терапии, в котором реагировать биоматериалов (например, тепловой или рН чувствительных Гидрогель) могут быть смешаны с клетки и гелеобразования в situ реализовать ячейки хранения²⁷. Однако на месте сетчатого биоматериалов не позволяют грунтование ячейках в витро и результат в немедленное воздействие на ишемический и воспалительных микроокружения на месте поражения клеток. Необходимо срочно решить эти проблемы, чтобы повысить терапевтическую эффективность. Основным преимуществом microcryogels, изготовленный с использованием этого протокола является их желаемого injectability вследствие их миниатюрный размер и исключительных эластичность, содействие их применение в ячейке доставки. Injectability microcryogels обеспечивает защиту клеток во время доставки клеток, поэтому они могут создаваться в 3D инъекционный microtissues после грунтования в пробирке клеток в microcryogel для повышения обоих белков внеклеточного матрикса (ECM) осаждения, а также взаимодействия ячеек. 3D инъекционный microtissues привести к микромасштабной ансамбли ткани как представляющие стратегии оптимального доставки для облегчения защиты клеток, приживления, выживание и таким образом улучшить конечной терапевтический эффект на месте поражения.

Помимо расширения терапевтические эффекты для клеточной терапии наши результаты были также свидетельствует о сложных последствий 3D микроокружения на реакции клеточного препарата. Используя biomimicking культуры условий, можно было бы добиться в vitro реакций клеточного препарата более представительным в vivo ответов, поэтому ускорение наркотиков открытие^{6,7, 28}. Сфероидов являются популярным выбором конфигурации 3D клетки культуры и многие методы были разработаны для оказания помощи исследователям генерировать сфероидов. Культура ткани низкая клей пластины²⁹ или пластины поверхностей, которые изменяются с нано отпечатки⁸ использовались также для принуждения клетки в совокупности путем предотвращения прилипания клетки матрицы. Хотя эти методы относительно просты в использовании, такие проблемы, как потеря сфероидов во время среднего обмена и других операций, а также размер изменчивость сфероидов являются проблемы, препятствующие широкомасштабной принятие такой технологии⁶. Более однородной сфероидов может быть сформирован с использованием висит падение^30,,3132,33, однако это трудоемкий, если не с помощью специализированных пластины. С помощью специализированных несколькими хорошо висит падение пластины и интеграции с автоматизированной обработки систем^6,31жидкости, высокопроизводительного скрининга может быть реализована. Крупнейшим недостатком сфероида культуры является отсутствие ECM, которая была определена играть жизненно важную роль во всех физиологических и патологических тканей события³⁴. Мозг модель исследование показало, что сфероидов культивированный внутри ECM леску, по сравнению с чисто сфероидов, увеличили лекарственной устойчивости, расширение ацидоза из-за увеличения производства молочной кислоты и улучшена ангиогенеза с увеличением выражение связанных факторы³⁴. Другие исследования также показали, что присутствие матрицы может обеспечить необходимые механо сигнализации для содействия EMT и поддерживает резюме особенностей опухоли как вторжение и метастазированием^{3,,3536 , 37}.

С ростом понимания важности ECM в патологии развития, существует никаких сомнений в том, что включение ECM в 3D культура методы могут помочь имитировать в естественных условиях ситуаций лучше⁶. Гидрогели природных или синтетических материалов были применены для создания нескольких в vitro 3D опухоли модели для оценки химиотерапевтические из-за их гибкость и управляемость биофизические свойства (например, жесткость)^{38 , 39 , 40 , 41 , 42}. Хотя гидрогели с перестраиваемой биофизических свойств действительно смоделированы важные биологические особенности опухолевых клеток для облегчения более точные наркотиков скрининг, некоторые недостатки этого метода препятствовали его широкое использование в наркотиков скрининг. Сшивки полимеров в присутствии клетки нужно инкапсулировать клетки в пределах гидрогеля матрица, которая потенциально может повредить клетки. Не только так гидрогели различных биофизических свойств представляют различные проблемы инкапсулирован в клетки. В мягкой гидрогели высокое содержание воды может поддержать рост клеток, но такие гидрогели ухудшить быстро, давая краткосрочной поддержки для 3D клеточной культуры. С другой стороны жестче гидрогели с высоким cross-linking может замедлить процесс деградации, но низким содержанием воды не может поддержать рост клеток и высокой сшивателя концентрации обычно вызывает высокая cytotoxicit^43,y⁴⁴. Не только так, подготовка 3D клеточной культуры с гидрогели трудоемким и не совместим с наиболее высок объём жидкости системы обработки, как контроль температуры раствора гидрогеля прекурсоров имеет важное значение и заклинивание тонкого дозирования советов может привести от гелеобразования Гидрогель в советы. Таким образом, эти недостатки побудили поиск альтернативных суррогаты ECM, т.е., основанные на эшафот ECM³⁴.

С помощью заранее сформированных подмостей, клетки могут быть освобождены от процесса изготовления биоматериала и таким образом обеспечить возможность для большего контроля над эшафот изготовление как более суровые условия могут быть использованы без страха повреждения клеток. Несколько исследований показали, что опухолевые клетки культивировали в 3D подмостей отображения выше лекарственной устойчивости, по сравнению с клетки культивировали в 2D благодаря увеличению злокачественности и расширенной клеток ECM взаимодействия^{45,46, 47}. такие наблюдения согласуются с нашими результаты, представленные здесь. В наших работах мы далее продемонстрировали универсальность в 3D microtissue массив и его преимущества перед другими методами, упомянутых выше. В недавней работе, мы смогли укрепить функции печени путем поощрения эпителиальных фенотипа HepaRG клеток путем культивирования на 3D microtissue массив и такой массив был применен к наркотиков гепатотоксичности оценки⁴⁷. Благодаря однородности размеров пор в 3D Макропористые подмости мы смогли контролировать размер клеток печени сфероидов падать в пределах 50-80 мкм, независимо от первоначального заполнения ячейки плотность. Это обеспечивает значительное преимущество над-формирование сфероидов с неоднородной размеров. Не только сделать сфероидов растут равномерно внутри каждого леса, клетки между скважинами также равномерно семенами, давая коэффициент от вариации (CV) сопоставимы с клетками, посева в 2D (т.е., CV = 0,09 в 3D microtissue массив и CV = 0,05 в 2D коммерческой плита ; данные не показаны). В другой работе мы продемонстрировали, что мы были в состоянии сформировать печени microtumor 3D microtissue массива для пилки стромальные опухоли взаимодействий для скрининга перепрограммировать стромы комбинаторной терапии⁴⁸. Печени microtumors были получены путем долгосрочной (5 дней) совместно культуры фибробластов с опухолевых клеток при высокой плотности. Мы наблюдали барьеров на пути распространения наркотиков благодаря компактной клеток и ECM структура, образованная в печени microtumor, который также отмечался в vivo³². С помощью меченных Люцифераза раковые клетки и механически загрунтовать стромальные клетки, как конкретные считывания для раковых клеток, в сочетании с люминесценции люциферин высокопроизводительного скрининга новых терапевтических агентов или комбинации против стромальные опухоли взаимодействие стало возможным.

Несмотря на многие уникальные преимущества нашей техники недостаток текущей microcryogels непрозрачности, препятствуя подробные оптического наблюдения клеток в microcryogels. Дальнейшие улучшения для этих microcryogels будет включать совершенствование их оптические свойства для повышения изображений клеток в microcryogels для наблюдения. Кроме того важные биофизических свойств, таких как жесткость не были изучены в наш метод, который необходимо будет решить, если мы хотим лучше имитировать физиологических и патологических тканей различных биофизических свойств.

Хотя наша техника позволяет простой поколения 3D microtissues, некоторые меры предосторожности должны быть приняты для успешных экспериментов. При изготовлении 3D microcryogels на чипе microstencil массив, важно обеспечить что microcryogels остаются замороженными при оказанное лиофилизатор. Поэтому важно для предварительного охлаждения лиофилизатор и быстро передать лиофилизатор microcryogels от-20 ° C морозильник. Плавления microcryogels до лиофилизации или во время лиофилизации вызовет поры свернуть и поэтому влияют на пористость microcryogels сфабрикованы. При культивировании 3D microtissues в формате массива, внимания требуется для обеспечения адгезии между двух массивов является достаточным для предотвращения перекрестного загрязнения между скважинами. Кроме того в то время как miniaturizing культуры клеток имеет свои преимущества в повышении пропускной способности и сокращения потребления химреагентов, его недостатком является то, что объем низкая культура не может поддержать долгосрочный клеточной культуры не частой СМИ пополнения. Не только так, очень важно для поддержания влажности окружающей среды культуры, чтобы предотвратить влияние на жизнеспособность клеток за счет испарения СМИ, поскольку лишь несколько микролитров суспензию клеток или добавлены средства массовой информации. Испарения также будет влиять на жизнеспособность клеток в периферической скважин, поэтому жизненно важно, чтобы избежать культивирования клеток в этих скважинах.

Тем не менее наша надежная техника обеспечивает возможность создавать 3D microtissues образом easy-to-use, который потенциально может сделать 3D культуры общий метод манипуляции ячейки для большинства лабораторий, ускорить как основные, так и поступательного науки достижений.

Авторы не имеют ничего сообщать.

Эта работа была финансово поддержана Национальный фонд естественных наук Китая (грантов: 81522022, 51461165302). Авторы хотели бы признать все члены лаборатории Du для помощи общего назначения.