Перенос способности формирования молочной железы между базальными эпителиальными клетками молочной железы и люминальными клетками молочной железы через внеклеточные везикулы / экзосомы

В этом протоколе описаны способы очистки, количественного определения и характеризации внеклеточных везикул (EV) / экзосомы из неадгезивных / мезенхимальных эпителиальных клеток молочной железы и для их использования для передачи способности формирования молочной железы к эпителиальным клеткам просвета молочной железы. EVs / экзосомы, полученные из стволовых эпителиальных клеток молочной железы, могут передавать это свойство клеток клеткам, которые поглощают EV / экзосомы.

Клетки могут взаимодействовать через экзосомы, внеклеточные везикулы (ЭП) ~ 100 нм, содержащие белки, липиды и нуклеиновые кислоты. Внеклеточные везикулы из неадгезивных / мезенхимальных эпителиальных клеток молочной железы (NAMEC) могут быть выделены из среды NAMEC с помощью дифференциального ультрацентрифугирования. Основываясь на их плотности, EVs можно очистить ультрацентрифугированием при 110 000 x g. Препарат EV из ультрацентрифугирования может быть дополнительно отделен с использованием непрерывного градиента плотности для предотвращения загрязнения растворимыми белками. Затем очищенные EV могут быть дополнительно оценены с использованием анализа отслеживания наночастиц, который измеряет размер и количество везикул в препарате. Внеклеточные везикулы размером от 50 до 150 нм являются экзосомами. Выведенные NAMEC EVs / экзосомы могут проникать в эпителиальные клетки молочной железы, которые могут быть измерены с помощью проточной цитометрии и конфокальной микроскопии. Некоторые свойства стволовых клеток молочной железы ( например, способность к образованию молочной железы) могутПереносится из стеблеподобных NAMEC в клетки эпителия молочной железы через EVs / экзосомы, полученные из NAMEC. Отдельные первичные эпикатеральные эпителиальные клетки эритроцитарного эпителия EpCAM ^hi / CD49f не могут образовывать молочные железы после трансплантации в жировые подушки мыши, тогда как EpcAM ^lo / CD49f ^hi базальные эпителиальные клетки молочной железы образуют молочные железы после трансплантации. Приобретение EVM / экзосомы, полученных из NAMEC, EpcAM ^hi / CD49f ^lo, эпителиальные клетки просвета молочной железы позволяют им генерировать молочные железы после трансплантации в жировые подушки. EVs / экзосомы, полученные из стволовых эпителиальных клеток молочной железы, переносят способность образования молочной железы к EpCAM ^hi / CD49f ломовым эпителиальным клеткам молочной железы.

Экзосомы могут опосредовать клеточную связь путем переноса мембранных и цитозольных белков, липидов и РНК между клетками ¹ . Было показано, что опосредованная экзосомами связь связана со многими физиологическими и патологическими процессами ( т. Е. С представлением антигена, развитием толерантности ² и прогрессированием опухоли ³ ). Экзосомы часто имеют содержание, сходное с содержимым исходных клеток, высвобождающих их. Таким образом, экзосомы могут переносить определенные клеточные свойства из исходных клеток и переносить эти свойства на клетки, поглощающие их ⁴ .

Экзосомы представляют собой двухслойные мембранные везикулы от 50 до 150 нм и представляют собой специфические маркеры ( например, CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix и TSG101). Таким образом, экзосомы должны характеризоваться различными методами для разных аспектов. Прозрачная электронная микроскопия может быть использована для визуализации мембранных везикулТаких как экзосомы ^{4 , 5} . Анализ Nanoparticle tracking (NTA) и динамический анализ рассеяния света (DLS) используются для измерения размера и количества очищенных экзосом ⁴ . Содержание липидной мембраны в экзосомах может быть проверено градиентом плотности. Экзосомальные маркеры, такие как CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix и TSG101 ^{6 , 7} , могут быть измерены с помощью Вестерн-блоттинга.

Базальные клетки молочной железы обладают способностью генерировать молочные железы при имплантации в жировые подушечки, тогда как просветные клетки не могут ^{8 , 9 , 10} . Таким образом, базальные клетки молочной железы также упоминаются как единицы репопуляции молочной железы. Используя модель базальных и просветных клеток молочной железы, можно исследовать способность EVs / экзосомы передавать характеристики клеток между различными популяциями клеток. Эта работаДемонстрирует способ передачи железистообразующей способности из базальных эпителиальных клеток молочной железы в просветные эпителиальные клетки молочной железы с использованием EVs / экзосом, полученных из базальных эпителиальных клеток молочной железы. Лицевые эпителиальные клетки молочной железы приобретали свойства базальных клеток после приема ЭВ / экзосомы, секретируемых из базальных клеток, и затем могут образовывать молочные железы ⁴ .

Все исследования, связанные с животными, соответствовали протоколам, утвержденным Институциональным комитетом по уходу за животными.

1. Внеклеточное везикул / экзосомальная изоляция и валидация

1. Культуральные эпителиальные базальные клетки молочной железы, NAMECs ⁴ , со свежей, бессывороточной средой, состоящей из 500 мл MCDB 170, pH 7,4 + 500 мл DMEM / F12 с бикарбонатом натрия (0,2438%); EGF (5 нг / мл); Гидрокортизон (0,5 мкг / мл); Инсулин (5 мкг / мл); Экстракт крупного рогатого скота (BPE, 35 мкг / мл); И GW627368X (1 мкг / мл) в чашках по 15 см.
2. После подсчета клеток с гемоцитометром высевают 1,2 × 10 ⁶ клеток в 12 мл среды на 15-сантиметровую чашку в день 0 в течение 4 дней ⁴ .
3. Через 4 дня в культуре центрифугируют культуральную среду при 300 × g в течение 5 мин, используя настольную центрифугу. Перенесите супернатант в коническую трубку ( рис. 1 ).
4. Центрифугируют супернатантПри 2000 мкг в течение 20 мин в настольной центрифуге. Перенесите супернатант в ультрацентрифужную пробирку и оставите мертвые клетки и клеточный мусор ( рис. 1 ).
5. Центрифугируют супернатант при 10000 мкг в течение 30 мин при 4 ° С. Перенесите супернатант в новую ультрацентрифужную пробирку ( рис. 1 ).
6. Центрифугируют супернатант при 110 000 мкг в течение 60 мин при 4 ° С. Удалите супернатант и повторно суспендируйте гранулу EV / экзосомы в PBS ( рисунок 1 ).
7. Центрифугируют супернатант при 110 000 мкг в течение 60 мин при 4 ° С. Удалите супернатант. Ресуспендируют гранулу EV / экзосомы в PBS ( рисунок 1 ). Ресуспендируют гранулу, выделенную из 240-480 мл среды, кондиционированной NAMEC, в 100 мкл.
8. Измерьте концентрацию белка в суспензии EV с помощью анализа белка BCA. Убедитесь, что концентрация составляет около 20-40 мкг / 100 мкл. Хранить при -20 ° C длядальнейший анализ.
9. Измерьте концентрацию и размер EVs / экзосомы с помощью анализа отслеживания наночастиц (NTA), как описано ранее Gardiner et al. ¹¹ . Разбавьте EVs / экзосомы (20 мкг / 100 мкл) с PBS до 10000 раз для анализа NTA.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Результат анализа NTA отражает количество и размер анализируемых везикул.
10. Изобразите EVs / экзосомы с помощью электронной микроскопии (TEM), как описано ранее Lin et al . ⁴ .

2. Очистка экзосомы с использованием градиента плотности

1. Ресуспендируют таблетку 110 000 г с этапа 1,7 в 40% (мас. / Об.) Йодиксаноле в PBS (2 мл). Оверлейьте смесь последовательно аликвотами 30%, 20%, 10% и 5% (мас. / Об.) Йодиксанола в PBS (по 2 мл каждый) с образованием градиента плотности в ультрацентрифужной пробирке.
2. Центрифугируют смесь при 200000 × g в течение 8 ч при 4 ° С.
3. Соберите каждую градиентную фракцию (10 фракцийдополнения; 1 мл / фракция) пипеткой с верхней части трубки.
4. Проанализируйте присутствие маркеров экзосомы ( например, CD81, CD9, CD63 и Tsg101) в каждой фракции с помощью SDS-PAGE ¹² и Вестерн-блоттинга. Загрузите 50 мкл суспензий каждой фракции на 10% гель, содержащий 0,1% (мас. / Об.) SDS, и выделите белки в фракциях с помощью гель-электрофореза.
5. Перенесите белки из геля в PVDF-мембрану и инкубируйте мембрану с антителами против маркеров экзосомы ( например, CD81, CD9, CD63 и Tsg101) и белком GAPDH для домашнего хозяйства в течение ночи ( таблица материалов ) при 4 ° C.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Результат идентифицирует фракцию, содержащую экзосомы.

3. Внеклеточное везикул / маркировка экзосомы

1. Приостанавливают EV / экзосомы, полученные на стадии 1.7, в 10 мкМ карбоксифлуоресцеинового сукцинимидилдиацетатного эфира (CFSE) при 20 мкг экзосомального белка / 100 мкл. Подготовьте параллельный образец coПоддерживая только CFSE и PBS, обрабатываемые таким же образом, как отрицательный контроль для последующих анализов поглощения EV / экзосом. Оставьте смеси при 37 ° C в течение 30 минут.
2. Приостановить EVs / экзосомы в 50x объемах PBS и центрифугировать суспензию при 110 000 xg в течение 60 минут при 4 ° C. Удалите супернатант и повторно суспендируйте гранулу EV / экзосомы в PBS. Повторите шаг 3.2 один раз.
3. Приостановить EVs / экзосомы в PBS в концентрации 20 мкг экзосомального белка / 100 мкл, а затем фильтровать EVs / экзосомы через мембраны 0,22 мкм, прежде чем добавлять EVs / экзосомы в клетки.

4. Анализ внеклеточного пузырька / экзосом.

1. Для приготовления культуральной среды смешать 500 мл MCDB 170, pH 7,4 + 500 мл DMEM / F12 с бикарбонатом натрия (0,2438%); EGF (5 нг / мл); Гидрокортизон (0,5 мкг / мл); Инсулин (5 мкг / мл); И BPE (35 мкг / мл) ⁴ . Пластируйте эпителиальные клетки HMLE молочной железы человека в 6-луночных чашках (1 x 10 ^{6 <}/ Sup> cell / well) за один день до лечения EV / exosome. Добавить 2 мкг / мл CFSE флуоресценции меченых EVs / экзосом, полученных на стадии 3.3, в культуральную среду клеток HMLE в течение 2-6 часов. Обработать клетки HMLE отрицательной контрольной группы с помощью параллельного препарата, описанного на этапе 3.1.
2. После инкубации от 2 до 6 часов промывайте клетки дважды 4 мл PBS при комнатной температуре.
3. Отсоедините клетки с 0,25% трипсином в течение 10 мин и повторно суспендируйте клетки в PBS, содержащие 0,2% FBS. Измерьте поглощение EV / exosome от интенсивности флуоресценции в клетках с помощью анализатора флуоресцентных клеток ⁴ . Изобразите клетки, обработанные EVs / экзосомами, или отрицательный контроль, используя конфокальную микроскопию.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Зеленая флуоресценция в клетках вызвана поглощением EV / exosome. См. Легенду на рисунке 6 для настроек микроскопа.

5. Выделение первичных мышечных эпителиальных клеток молочной железы

1. Приготовьте таблетки, покрытые желатином, добавив 12 мл 0,1% раствора желатина в 10 см. Поместите пластины в инкубатор с температурой 37 ° C в течение 30 мин. Удалите раствор желатина и оставьте крышки с посуды в ламинарном вытяжном шкафу в течение 4 часов, пока не высохнет желатиновая оболочка.
2. Вырезать 2, 3, 4 и 5 молочных желез ( рис. 2 ) из 12-недельных девственных самцов C57BL / 6 с использованием ножниц и разрезать железы на мелкие кусочки (2 мм ² ) с помощью бритвы.
3. Далее диссоциация суспензии молочных желез (от 10 мышей) в течение 60 мин при 37 ° С, перемешивание 120 об / мин с 50 мл DMEM / F12, содержащего 0,2% коллагеназы типа IV, 0,2% трипсина, 5% FBS, 5 мкг / мл гентамицина , И 1x pen-strep.
4. Гранулируйте эпителиальные органоиды из смеси центрифугированием при 350 × g в течение 10 мин.
5. Приостановить эпителиальные органоиды в 4 мл DMEM / F12 0,1 мг / мл ДНКазы I в течение 5 мин при комнатной температуре. Добавить 6 мл DMEM / F12 в конечныйОбъем 10 мл.
6. Центрифугируют суспензию при 400 мкг в течение 10 мин при комнатной температуре и отбрасывают супернатант.
7. Ресуспендируют таблетку в 10 мл DMEM / F12. Центрифугируйте подвеску, но нажмите на тормоз, когда скорость достигает 400 x g. Отбросьте супернатант.
   ПРИМЕЧАНИЕ. При попадании на тормоз эпителиальные органоиды быстро оседают, а фибробласты, как отдельные клетки, все еще остаются в супернатанте.
8. Повторите шаг 5.6 и 5.7 5-7 раз. Добавьте каплю суспензии в гемоцитометр, а затем проверьте зазор фибробластов из органоидной смеси под микроскопом после каждого раунда центрифугирования ( рисунок 3 ).
9. Пластину органоидов в покрытой желатином чашке, полученной на этапе 5.1, в течение 48 часов с DMEM / F12, содержащей 1x ITS, 5% FBS, 50 мкг / мл гентамицина, 10 нг / мл EGF и 1x перо-стрептококка.
10. Через 48 часов удалите плавающие клетки в культуре, заменив среду свежей культуральной средой без FBS (DMEM / F12, содержащий 1x ITS, 50 мкг / мл гентамицина, 10 нг / мл EGF и 1x pen-strep).
11. Убедитесь, что монослой клеток эпителия молочной железы мигрирует и вырастает из прикрепленных эпителиальных органоидов через 3 дня.

6. Отделение первичных мышей базальных / люминальных эпителиальных клеток молочной железы

1. После 3-дневной культуры отделяйте первичные клетки молочной железы мыши с природной ферментной смесью с протеолитической и коллагенолитической ферментативной активностью в течение 20 мин. Нейтрализуйте активность фермента с 5% FBS в PBS.
2. Центрифугируют суспензию при 450 × g в течение 10 мин при комнатной температуре и отбрасывают супернатант. Ресуспендируют осадок клеток в дозе 5 мг / мл в течение 20 мин. Нейтрализуйте активность фермента с 5% FBS в PBS.
3. Центрифугируют суспензию при 450 × g в течение 10 мин при комнатной температуре и отбрасывают супернатант.
4. Повторно суспендировали клетки в 100 мкл PBS с 0,2% FBS в концентрации 10 ⁷ клеток / мл с разбавленнымАнти-CD49f и анти-EpCAM антитела на льду в течение 1 часа в темноте.
5. Промывают клетки с PBS и затем инкубируют клетки с конъюгированным с флуорофором вторичным антителом на льду в течение 30 мин в темноте.
6. Мойте и повторно суспендируйте клетки в PBS с 0,2% FBS.
7. Сортируйте эпителиальные клетки млекопитающих EpCAM ^hi / CD49f ^{lo на} сортировщике клеток ⁴ .

7. Внеклеточное везикул / экзосомальное лечение

1. Выселили отсортированные эпителиальные клетки эпикальтера эпителия EpCAM ^hi / CD49f ^lo на стадии 6,7 на 6-луночных планшетах с желатиновым покрытием (2 × 10 ⁵ клеток / лунку), а затем обработали их PBS или 2 мкг / мл NAMEC-полученных EVs / экзосомами Полученного на этапе 1.7.
2. Чтобы обеспечить биологическую эффективность EVs / экзосом в долгосрочной культуральной обработке, замените среду для культивирования клеток свежей средой, содержащей PBS или 2 мкг / мл EVM / экзосомы, полученные NAMEC каждые два дня. Не разделяйте мышь primaВо время 10-дневного лечения.

8. Инъекция жировых клеток в эпителиальных клетках молочной железы

1. Анестезируйте 3-недельную самку C57BL / 6 мышей с изофлуораном, 2-3% -ным ингалятором.
2. Поместите анестезированную мышь на спину. Удалите мех на середине живота с помощью бритвы / крема для волос и очистите участок операции тремя чередующимися циклами 70% спирта и повидон-йода.
3. Сделайте вертикальный разрез 1,5 см через кожу вдоль брюшной грудно-паховой области с помощью ножниц, а затем поочередно выставляйте правые и левые 4 ^-я молочные жировые подушки.
4. Очистите каждую жировую прокладку, удалив паренхиму железы с помощью ножниц. Найдите лимфатический узел в жировой подушечке, а затем удалите паренхиму всей железы ниже лимфатического узла.
   ПРИМЕЧАНИЕ. Две трети жировой прокладки должны оставаться на месте.
5. Отсоедините клетки, полученные на стадии 7.2, с помощью природной смеси ферментов (см. Таблицу материалов ) с протеолитическим аЙ активности коллагенолитического фермента в течение 10 мин. Нейтрализуйте активность фермента с 5% FBS в PBS.
6. Центрифугируют суспензию при 450 × g в течение 10 мин при комнатной температуре и отбрасывают супернатант. Подсчитайте клетки гемоцитометром и суспендируйте клетки в PBS с такой концентрацией, чтобы 15 мкл содержал желаемую дозу клетки (10 ⁴ -10 ² клетки / пэд).
7. Вложить 15 мкл суспензии клеток эпителия молочной железы в жировую подушку, используя 100 мкл стеклянного шприца, прикрепленного к иглам 27G.
8. Повторите шаги 8.4-8.7 для жировой прокладки с другой стороны.
9. Закройте кожу раневыми зажимами.

9. Целая гора молочной железы

1. Эвтаназия мыши с СО ₂ плюс дислокация шейки матки через 8 недель после инъекции клеток (этап 8.7).
2. Сделайте вертикальный разрез через слой кожи от грудной области до паховой области с помощью ножниц, а затем выведите как правый, так и левый 4 ^-й мАммиачные жировые подушки. Удалите 4 грудные железы ( рис. 2 ).
3. Распределите жировые подушечки на стеклянных подлокотках микроскопа и закрепите жировые накладки фиксатором Kahle (4% формальдегида, 30% EtOH и 2% ледяной уксусной кислоты) при комнатной температуре в течение ночи.
   Осторожно: фиксатор Kahle является раздражителем. Выполните этот шаг в химическом колпаке.
4. Промыть жировые прокладки в 250 мл 70% EtOH в течение 15 мин, а затем в 250 мл dH ₂ O в течение 5 мин. Вытрите жирные прокладки из карминового квасца (1 г кармина и 2,5 г сульфата алюминия в 500 мл dH ₂ O) при комнатной температуре в течение ночи.
5. Промойте жировые прокладки 250 мл 70% EtOH в течение 15 мин, 250 мл 95% EtOH в течение 15 мин и 250 мл 100% EtOH в течение 15 мин.
6. Очищайте жировые прокладки в ксилоле в течение нескольких дней и прекратите инкубацию ксилола, когда жировые прокладки станут прозрачными.
   Осторожно: Ксилол является раздражающим. Выполните этот шаг в химическом колпаке.
7. Смонтируйте слайды wiГо монтажа и снимать изображения (2,400 dpi) жировых прокладок с помощью цифрового слайдового сканера.

Поскольку было показано, что блокирование передачи сигналов PGE ₂ / EP ₄ инициирует высвобождение EV / экзосомы из базальноподобных стволовых клеток ⁴ молочной железы, эта работа представляет собой метод выделения индуцированных EVs / экзосом из культуры базальных клеток (NAMEC) молочной эпителии. Поскольку NAMEC культивируют в бессывороточной среде, ранее не существовало EVs / экзосомы, полученных из сыворотки ¹³ . Для клеток, культивируемых в среде, содержащей сыворотку, ранее существовавшие экзосомы в среде должны быть предварительно очищены ультрацентрифугированием при 110 000 мкг до того, как среда будет использована для культивирования исходных клеток для сбора EV / экзосом ⁵ . EVs / экзосомы из 4-дневной индуцированной NAMEC среды могут быть выделены из осадка 110 000 xg дифференциальным ультрацентрифугированием, как показано на рисунке 1 . Число и размер изолированных везикул в 110 000 xg pellEt может быть измерена с помощью анализа отслеживания наночастиц (NTA). Фракция осадка 110 000 г, выделенная дифференциальным ультрацентрифугированием, в основном содержит ~ 100 нм везикулы ( фиг. 4А ); Это соответствует размеру экзосом (50-150 нм), о котором сообщается в литературе. Кроме того, анализ ТЕА показал, что 110 000 г фракций среды, кондиционированной NAMEC, содержат обильные мембранные везикулы ( рисунок 4B ). Хотя дифференциальное ультрацентрифугирование может генерировать достаточно чистые экзосомы, следующая стадия очистки с использованием градиента плотности дополнительно устраняет загрязняющие вещества ( например, белковые агрегаты) ⁵ . В градиенте плотности экзосомы плавают в градиенте из-за содержания липидов в везикуле, в то время как белковые агрегаты, если они есть, остаются в нижней части градиента. Каждая фракция градиента собирается для обнаружения производителей экзосомы ( например, CD81, CD63, CD9 и TSG101 ^{6 , 7 ) путем вестерн-блоттинга. Маркеры экзосомы могут быть обнаружены во фракции с ~ 20% иодиксанола ( рис. 5 ). Фракцию, содержащую экзосомы, можно разбавить PBS и подвергнуть ультрацентрифугированию 200 000 × g для выделения экзосом. Выделенный осадок экзосомы промывают один раз в PBS и затем повторно суспендируют в PBS и хранят при -20 ° C для дальнейшего анализа.}

Перед измерением поглощения EVs / экзосом, полученных NAMEC, с помощью нестебельного аналога клеток эпителия молочной железы - клеток HMLE - EVs / экзосомы должны быть помечены флуоресцентным красителем ( например, карбоксифлуоресцеинсукцинимидиловый эфир (CFSE)). Параллельный образец, содержащий только CFSE, но не EV / exosome, обрабатывается в той же процедуре маркировки. Этот образец является отрицательным контролем, используемым в следующем анализе поглощения EV / экзосомы, чтобы отразить эффект следового количества остаточного свободного CFSE краситель. Клетки HMLE культивируют с CFSE-мечеными, полученными из NAMEC EVs / экзосомами или отрицательным контролем в течение 2-6 ч и затем подвергают проточной цитометрии. По сравнению с необработанными клетками HMLE клетки HMLE, культивируемые с отрицательным контролем, выражают несколько более высокий уровень сигнала CFSE ( рисунок 6A , красная линия по сравнению с оранжевой линией), что отражает фоновый уровень сигнализации CFSE, вызванный остаточным свободным CFSE, оставленным от EV / экзосомы. Кроме того, по сравнению с клетками HMLE, обработанными отрицательным контролем, клетки HMLE, культивированные мечеными CFSE, экзосомами, полученными из NAMEC, экспрессируют 10-кратный более высокий сигнал CFSE ( фиг. 6A , синяя линия по сравнению с красной линией), что является следствием специфического поглощения CFSE-меченых EVs / экзосомы. Поглощение CFSE-меченых, полученных NAMEC EVs / экзосомами клетками HMLE также можно наблюдать с помощью конфокальной микроскопии. В то время как отрицательные контрольные клетки HMLE не имеют CFSE-сигнала, поглощение NAПолученные из MEC EVs / экзосомы клетками HMLE можно наблюдать с помощью CFSE-сигнала под конфокальным микроскопом в клетках, обработанных CFSE-меченными клетками EV / exosome ( рисунок 6B ).

Для оценки того, могут ли полученные EVE / экзосомы, полученные из NAMEC, переносить способность к образованию молочной железы из стволовых клеток базальных клеток молочной железы в просветные клетки молочной железы, мышиные мышиные просветные клетки сначала выделяют, чтобы можно было провести анализ образования молочной железы у мышей. Эпителиальные клетки мышей молочной железы изолированы от 12-недельных мышей. Молочные железы разрезают на мелкие кусочки и далее диссоциируют с коллагеназой и трипсином. Диссоциированные эпителиальные органоиды и фибробласты могут быть разделены дифференциальным центрифугированием, как описано в шагах 5.7 и 5.8. В каждом раунде центрифугирования осадок на дне пробирки должен содержать главным образом эпителиальные органоиды, а фибробласты и отдельные клетки должны плавать в супернатантет. По сравнению с смесью, содержащей как эпителиальные органоиды, так и фибробласты перед дифференциальным центрифугированием ( рис. 3 , верхние панели), шесть раундов центрифугирования очищают большинство фибробластов и отдельных клеток в смеси ( рис. 3 , нижняя панель).

Эпителиальные клетки молочной железы ( фиг. 7 ) эпителиальных органоидов далее диссоциируют с использованием природной ферментной смеси с протеолитической и коллагенолитической ферментативной активностью и осуществляют выделение отдельных клеток в суспензии. Сортировка одноклеточной суспензии с помощью экспрессии клеточной поверхности CD49f и EpCAM может разделять люминальные клетки молочной железы (EpCAM ^hi / CD49f ^lo ), базальные клетки молочной железы (EpCAM ^lo / CD49f ^hi ) и неэпителиальные клетки (EpCAM ^- ) ( рисунок 8 ).

Выделенные эпителиальные клетки эритроцитарной эпикардии EpCAM ^hi / CD49f ^lo культивируют с помощью EV / exosomes, полученных из NAMEC, в течение 10 дней, а свежие EV / экзосомы и среду заменяются каждые два дня. После обработки EV / exosome, просвечивающие клетки молочной железы имплантируют в 4 ^-й слой молочных жиров ( рис. 2 ) мышей. Через 8 недель жировые подушки выделяют и окрашивают для анализа образования молочной железы ( рис. 9 ). Обработка индуцированными NAMEC-полученными EVs / экзосомами позволяет люминесцентным клеткам приобретать способность к образованию молочной железы ⁴ . Обработанные NAMEC, обработанные EV / exosome клетки молочной железы молочной железы образуют молочные железы в жировых подушечках мыши ( рис. 9 ).

Рисунок 1: Иллюстрация экстрацеллюлыR Везикул / экзосомальный метод пуритизации из среды клеточной культуры путем дифференциального ультрацентрифугирования. Указаны скорость и длина каждого центрифугирования. После каждого из первых трех центрифугирования супернатант выдерживают для следующей стадии. После центрифугирования 110 000 × g гранулы сохраняют и супернатанты отбрасывают. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Анатомия мышей молочной железы. У мышей есть пять пар молочных желез, обозначенные цифрами 1-5, расположенные в жировых подушечках (красных) непосредственно под кожей. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версиюЭто цифра.

Рисунок 3: Изображения смеси эпителиальных органоидов и клеток жировых подушек до и после дифференциального центрифугирования. Яркие снимки изолированных жировых смесей клеток до и после дифференциального центрифугирования, взятые из гемоцитометра. Arrowhead: эпителиальные органоиды. Стрелка: фибробласты и отдельные клетки. Шкала шкалы = 0,5 мм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Величина размера и концентрационный анализ NAMEC110,000 xg Доля гранул. Доля осадка 110 000 г среды NAMEC составляет (N) и ( B ) трансмиссионную электронную микроскопию (TEM). Шкала шкалы = 1 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Обнаружение экзосом в фракциях градиента плотности. Вестерн-блот-анализ маркеров экзосомы CD81, CD9, CD63 и Tsg101 и ген домашнего хозяйства GAPDH показывает 20% иодиксанольную фракцию, содержащую экзосомы. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

55736fig6.jpg "/>
Рисунок 6: Обнаружение внеклеточного пузырька / поглощение экзосом методом проточной цитометрии и конфокальной микроскопии. Поглощение EV / exosome измерялось в клетках HMLE. CFSE-меченые, NAMEC-полученные EVs / экзосомы и отрицательный контроль добавляют к указанным культурам в течение 6 часов. После инкубации клетки подвергают ( A ) проточной цитометрии и ( B ) конфокальной микроскопии. CFSE (зеленый, возбуждение / излучение (нм): 492/517, лазерная линия микроскопа: 488). Интенсивность флуоресценции отражает поглощение EV / exosome. Ядра клеток окрашиваются DAPI (синий, возбуждение / излучение (нм): 358/461, лазерная линия микроскопа: 405), а плазменные мембраны окрашиваются пятно плазматической мембраны (красный, возбуждение / излучение (нм): 649/666; Лазерная линия микроскопа: 633, см. Таблицу материалов ). Конфокальная линза объектива: HCX PL APO 63x / 1.40-0.60 Масло. Шкала шкалы = 20 мкм.Ad / 55736 / 55736fig6large.jpg "target =" _ blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 7: Изображения прикрепленных эпителиальных органоидов. Яркие снимки эпителиальных клеток молочной железы, образованные клетками, мигрирующими и растущими из прикрепленных эпителиальных органоидов. Шкала шкалы = 100 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 8: Сортировка первичных мышечных эпителиальных клеток мыши по поверхности EpCAM и CD49f. Эпителиальные клетки мышиной молочной железы, выделенные из жировых подушек 12-недельных мышей, подвергаются клеточной сортировкеING. Прозрачные клетки мышиной молочной железы обогащены популяцией EpCAM ^hi / CD49f ^lo, отмеченной синим кружком; Базальные клетки были обогащены популяцией EpCAM ^lo / CD49f ^hi, отмеченной красным кружком. Неэпителиальные клетки отмечены черным ящиком на участке. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 9: Формирование молочной железы первичными мышечными молочными клетками. Первичные мышиные клетки EpCAM ^hi / CD49f ^lo просвечивают PBS или полученными NAMEC EVs / экзосомами в культуре клеток в течение 10 дней и имплантируют в очищенные жировые подушки 3-недельных мышей. Мышей подвергают эвтаназии и вскрывают через 8 недель для анализа формы молочной железыция. Шкала шкалы = 0,75 см. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Процентная и средняя интенсивность флуоресценции (MFI) популяций, описанных на рисунке 8.

Экзосомы часто несут характеристики клеток, которые их высвобождают, а количество высвобожденных экзосом может индуцироваться стимулами ⁴ . Культуральную среду клеток можно собирать и подвергать дифференциальному ультрацентрифугированию для сбора EV / экзосомы ( рисунок 1 ). В настоящее время нет общего соглашения об идеальном методе выделения EVs / экзосом. Оптимальный способ, используемый здесь, был определен приложением ¹⁴ ниже по потоку. Ультрацентрифугирование является относительно быстрым методом выделения EVs / экзосом, который может сохранить биологическую активность EVs / экзосом. Однако везикулы, выделенные ультрацентрифугированием, обычно содержат смесь EVs, которые содержат экзосомы, продуцируемые эндосомальными отделениями и / или везикулами, продуцируемыми посредством почкования из клеточной мембраны.

Анализируя размеры везикул с помощью NTA ( рисунок 4A ), везикулы, обнаруженные для очистки при 110 000 xg во время дифференциального ультрацентрифугирования, были в основном 50-150 нм, что соответствует размеру экзосомы. Данные NTA показывают, что экзосомы, полученные из NAMEC, могут быть выделены из культуральной среды при 110 000 × g при дифференциальном ультрацентрифугировании. Однако введенные здесь NTA и TEM допускают только визуализацию везикул или измерение размера и количества всей совокупности EV. Эти методы не могут измерять гетерогенность популяций EV или даже сортировать гетерогенные популяции EV. Ученые начали разрабатывать методы использования проточных цитометров для анализа и сортировки популяций EV ¹⁵ .

Хотя дифференциальное ультрацентрифугирование можно использовать для очистки экзосом, необходимо использовать градиент плотности для дальнейшего удаления загрязнений белковых агрегатов из экзосомных везикул в 110 000 xg выделенной фракции ⁵ . Экзосомы содержат липидные мембраны. Липид в экзосомных мембранах заставляет экзосомы плавать в градиенте плотности, в то время как белковые агрегаты падают на дно градиента плотности. Экзосомы экспрессируют специфические маркеры ( например, CD81, CD63, CD9 и TSG101 ^{6 , 7} ). Анализируя присутствие маркеров экзосомы во фракциях градиента плотности, можно идентифицировать экзосомы во фракции с ~ 20% йодиксанола ( рис. 5 ). Следует определить множественные маркеры экзосомы, чтобы идентифицировать экзосомы в градиенте плотности, поскольку каждая популяция экзосом может выражать различные маркеры экзосомы ¹⁶ .

Поглощение EVs / экзосомами клетками можно измерить с использованием флуоресцентных меченых красителями EVs / экзосомами. Количество клеток, поглощающих меченые EVs / экзосомы, можно измерить с помощью проточной цитометрии ( рисунок 6A ). Чтобы подтвердить, что флюоИз-за поглощения меченых EVs / экзосом, но не от свободного красителя, картина флуоресценции была исследована в клетках с использованием микроскопии. Конфокальная микроскопия показывает, что картина флуоресценции в клетках, обработанных EV / exosome, является точечной ( рис. 6B справа). Точечные сигналы, вероятно, являются результатом меченых EVs / экзосом, а не от свободной флуоресценции. Точечные сигналы в клетках могут быть дополнительно проанализированы с помощью микроскопии с суперразрешением с структурированной освещенностью, которая имеет самое высокое разрешение при 85 нм ^{4 , 17} . Микроскопия с высоким разрешением может подтвердить, что точечные сигналы имеют полые пузырьки ~ 100 нм, которые напоминают экзосомы ⁴ . Эти результаты свидетельствуют о том, что экзомомы, полученные из NAMEC, могут проникать в эпителиальные клетки молочной железы в культуре.

Выведенные NAMEC EVs / экзосомы часто несут молекулы ( например, белки и miРНК), необходимых для характеристик определенных клеток ¹ . Это говорит о том, что EVs / экзосомы, полученные из NAMEC, могут передавать свойства NAMEC ( например, способность формирования молочной железы) к их аналогам эпителиальных клеток. Поскольку эпителиальные клетки молочной железы человека не могут образовывать молочные железы ксеногенно в жировых подушечках мыши ^{18 , 19} , перенос способности формирования железы можно исследовать с использованием мышиных первичных эпителиальных клеток молочной железы. Мышцы первичной молочной железы EpCAM ^hi / CD49f ^lo люминальные клетки, которые не образуют молочные железы, могут быть выделены у 6-недельных мышей ( рис. 7 и рис. 8 ). Выделенные клетки из мышечных жировых подушечек можно разделить на три группы ( например, EpCAM ^hi / CD49f ^lo luminal cells, EpCAM ^lo / CD49f ^hi базальные клетки и EpCAM ^- неэпителиальные клетки) путем изученияВельоны поверхности EpCAM и CD49f ( рисунок 8 ). EpcAM ^lo / CD49f ^hi базальные клетки могут образовывать молочные железы в жирных причудах при трансплантации в жировые подушечки, но EpcAM ^hi / CD49f ^lo люминальные клетки не могут ⁴ . Таким образом, популяция клеток EpCAM ^hi / CD49f ^lo может использоваться для изучения способности индуцированных NAMEC-зависимых EV / экзосом для передачи способности к формированию молочной железы. Выделенные клетки ЕРКАМ ^hi / CD49f ^lo могут быть сохранены в культуре в течение 7-10 дней для лечения EV / экзосом. Следует отметить, что сохранение первичных эпителиальных клеток молочной железы in vitro дольше может ослаблять жизнеспособность клеток.

Обработанные EV / экзосомные люминесцентные клетки молочной железы могут быть имплантированы в очищенные жировые подушечки для анализа способности к образованию молочной железы. Жировые подушки мышей, используемых для имплантации, должны быть очищены в возрасте 3 недель.Т 3-недельного возраста, эпителиальные клетки молочной железы ограничиваются областью между соском и лимфой жировой прокладки. Эпителий молочной железы в жировой подушке можно очистить, удалив область между соском и лимфой в возрасте 3 недель. Ляминальные клетки молочной железы имплантируются сразу после очистки жировой прокладки, а образование железы с помощью имплантированных клеток можно анализировать через 8 недель после имплантации. Эффект EVs / экзосомы, полученных из NAMEC, на перенос способности формирования молочной железы к просветным клеткам молочной железы может быть оценен образованием железистых просветных клеток и просвечиваемыми EV / экзосомой люминовыми клетками ( рис. 9 ). Индуцированные EVs / экзосомы из NAMEC несут свойство базальных эпителиальных клеток молочной железы - способность к образованию железы, и люминесцентные клетки, которые поглощают индуцированные EV / экзосомы из NAMEC, могут получить свойство от NAMEC через EVs / экзосомы. Эта работа демонстрирует доказательства того, что молекулы, ответственные за EV / экзосомовые средыTid перенос способности формирования молочной железы присутствуют в липидных плотах EVs / экзосомы ⁴ .

Авторам нечего раскрывать.

Эта работа была поддержана грантами Национальных научно-исследовательских институтов здравоохранения (05A1-CSPP16-014, HJL) и Министерства науки и технологий (MOST 103-2320-B-400-015-MY3, HJL).