نقل الغدة الثديية تشكيل القدرة بين الخلايا الظهارية الثديية القاعدية والخلايا اللمعية الثديية عن طريق الحويصلات خارج الخلية / إكسوسوميس

يصف هذا البروتوكول طرق لتنقية، كوانتيتاتينغ، وتوصيف الحويصلات خارج الخلية (إيفس) / إكسوسوميس من غير ملتصقة / الوسيطة الخلايا الظهارية الثديية واستخدامها لنقل الثديية تشكيل الغدة القدرة على الخلايا الطلائية الثديية اللمعية. إيف / إكسوسوميس المستمدة من الخلايا الظهارية الثديية الجذعية يمكن نقل هذه الخاصية الخلية إلى الخلايا التي تستوعب إيفس / إكسوسوميس.

يمكن للخلايا التواصل عبر إكسوسوميس، ~ 100 نانومتر الحويصلات خارج الخلية (إيفس) التي تحتوي على البروتينات والدهون، والأحماض النووية. غير ملتصقة / ميسينشيمال الخلايا الظهارية الثديية (ناميك) الحويصلات خارج الخلية -edived يمكن عزلها من وسط ناميك عن طريق التفريغ التفاضلي التفاضلي. استنادا إلى كثافتها، يمكن تنقية المركبات الكهربائية عن طريق التنبيذ الفائق في 110،000 x ز. يمكن فصل إعداد إيف من التنبيذ الفائق باستخدام التدرج الكثافة المستمر لمنع التلوث مع البروتينات القابلة للذوبان. ويمكن بعد ذلك تقييمها مرة أخرى إيفس تنقية باستخدام تحليل الجسيمات متناهية الصغر تتبع، والذي يقيس حجم وعدد من الحويصلات في إعداد. الحويصلات خارج الخلية مع حجم يتراوح بين 50 إلى 150 نانومتر هي إكسوسوميس. يمكن تناولها إيفس المستمدة / إكسوسوميس الخلايا الظهارية الثديية، والتي يمكن قياسها عن طريق التدفق الخلوي والمجهر متحد البؤر. بعض خصائص الخلايا الجذعية الثديية (على سبيل المثال، القدرة على تشكيل الغدة الثديية) يمكنيتم نقلها من ناميس مثل الجذعية للخلايا الظهارية الثديية عن طريق إيفس المستمدة من إيفس / إكسوسوميس. عزل إبكام ^مرحبا / CD49f ^لو الخلايا الطلائية الثديية اللمعية لا يمكن أن تشكل الغدد الثديية بعد زرعها في منصات الدهون الماوس، في حين إبكام ^لو / CD49f ^مرحبا الخلايا القاعدية الثديية القاعدية تشكل الغدد الثديية بعد زرع. امتصاص نامس المستمدة من ناميك / إكسوسوميس من قبل إبكام ^مرحبا / CD49f ^لو الخلايا الظهارية الثديية اللمعية يسمح لهم لتوليد الغدد الثديية بعد زرعها في منصات الدهون. و إيفس / إكسوسوميس المستمدة من الجذعية مثل الخلايا الظهارية الثديية نقل الثديية تشكيل الغدة القدرة على إبكام ^مرحبا / CD49f ^لو الخلايا اللمعية الظهارية الثديية.

إكسوسوميس يمكن أن توسط الاتصالات الخلوية عن طريق نقل الغشاء والبروتينات عصاري خلوي، والدهون، و رناز بين الخلايا ¹ . وقد أثبتت الاتصالات بوساطة إكسوسوم أن تشارك في العديد من العمليات الفسيولوجية والمرضية ( أي عرض المستضد، وتطوير التسامح ² ، وتطور الورم ³ ). إكسوسوميس غالبا ما يكون محتويات مماثلة لتلك التي من الخلايا المصدر الإفراج عنهم. وهكذا، يمكن لل إكسوسوميس تحمل خصائص خلية محددة من الخلايا المصدر ونقل هذه الخصائص إلى الخلايا التي تطعمها ⁴ .

إكسوسوميس هي حويصلات غشاء طبقة مزدوجة من 50 إلى 150 نانومتر وتقدم علامات محددة (على سبيل المثال، CD9، CD81، CD63، HSP70، أليكس، و TSG101). وبالتالي، يجب أن تتميز إكسوسوميس بطرق مختلفة لجوانب مختلفة. يمكن استخدام المجهر الإلكتروني للإرسال لتصور الحويصلات الغشاءمثل إكسوسوميس ^{4 ، 5} . ويستخدم تحليل تتبع الجسيمات النانوية (نتا) وتحليل ديناميكي نثر الضوء (دلس) لقياس حجم وعدد من إكسوسوميس المنقى ⁴ . ويمكن التحقق من محتوى غشاء الدهون من إكسوسوميس من قبل التدرج الكثافة. علامات إكسوسومال، مثل CD9، CD81، CD63، HSP70، أليكس، و TSG101 ^{6 ، 7} ، يمكن قياسها بواسطة النشاف الغربية.

الخلايا القاعدية الثديية لديها القدرة على توليد الغدد الثديية عند زرعها في منصات الدهون، في حين أن الخلايا اللمعية لا يمكن ^{8 ، 9 ، 10} . وبالتالي، الخلايا القاعدية الثديية يشار إليها أيضا وحدات إعادة الثديية. باستخدام نموذج الخلايا القاعدية والخلايا اللمعية، يمكن فحص قدرة إيف / إكسوسوميس لنقل خصائص الخلية بين السكان خلية مختلفة. هذا العمليوضح طريقة نقل القدرة تشكيل الغدة من الخلايا الظهارية القاعدية الثديية إلى الخلايا الظهارية اللمعية الثديية باستخدام إيف / إكسوسوميس المستمدة من الخلايا الظهارية القاعدية الثديية. اكتسبت الخلايا الظهارية الثديية اللمعية خصائص الخلايا القاعدية بعد ابتلاع إيفس / إكسوسوميس يفرز من الخلايا القاعدية ويمكن بعد ذلك تشكيل الغدد الثديية ⁴ .

جميع البحوث التي تنطوي على الحيوانات تمتثل للبروتوكولات التي وافقت عليها اللجنة المؤسسية للرعاية الحيوانية.

1. خارج الخلية حويصلة / إكسوسوم العزلة والتحقق من الصحة

1. ثقافة الثديية الخلايا القاعدية الظهارية، نامكس ⁴ ، مع الطازجة، المتوسطة خالية من مصل مصنوعة من 500 مل من مدب 170، ودرجة الحموضة 7.4 + 500 مل من دمم / F12 مع بيكربونات الصوديوم (0.2438٪). إغف (5 نانوغرام / مل)؛ هدروكوريتيسون (0.5 ميكروغرام / مل)؛ الأنسولين (5 ميكروغرام / مل)؛ خلاصة النخامية البقرية (بب؛ 35 ميكروغرام / مل)؛ و GW627368X (1 ميكروغرام / مل) في 15 سم الأطباق.
2. بعد عد الخلايا مع عدادة الكريات، البذور 1.2 × 10 ⁶ خلايا في 12 مل من المتوسطة لكل طبق 15 سم في اليوم 0 لمدة 4 أيام ⁴ .
3. بعد 4 أيام في الثقافة، أجهزة الطرد المركزي في وسط الثقافة في 300 x ج لمدة 5 دقائق باستخدام الطرد المركزي الجدول الأعلى. نقل طاف إلى أنبوب مخروطي الشكل ( الشكل 1 ).
4. الطرد المركزي طاففي 2000 x ج لمدة 20 دقيقة في الطرد المركزي الجدول الأعلى. نقل طاف إلى أنبوب نابذة فائقة السرعة وترك الخلايا الميتة والحطام الخلية ( الشكل 1 ).
5. الطرد المركزي طاف في 10،000 x ج لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. نقل طاف إلى أنبوب نابذة فائقة السرعة ( الشكل 1 ).
6. الطرد المركزي طاف في 110،000 x ج لمدة 60 دقيقة في 4 درجات مئوية. إزالة طاف و ريسوسبيند بيليه إيف / إكسوسوم في برنامج تلفزيوني ( الشكل 1 ).
7. الطرد المركزي طاف في 110،000 x ج لمدة 60 دقيقة في 4 درجات مئوية. إزالة طاف. ريسوسبيند إيف / إكسوسوم بيليه في برنامج تلفزيوني ( الشكل 1 ). ريسوسبيند بيليه معزولة من 240-480 مل من ناميك مكيفة مكيفة في 100 ميكرولتر.
8. قياس تركيز البروتين من تعليق إيف مع فحص البروتين بكا. تأكد من أن تركيز حوالي 20-40 ميكروغرام / 100 ميكرولتر. مخزن في -20 درجة مئوية لمزيد من التحليل.
9. قياس تركيز وحجم إيفس / إكسوسوميس عن طريق تحليل تتبع الجسيمات متناهية الصغر (نتا)، كما وصفها سابقا غاردينر وآخرون. ^{11 -} تمييع إيفس / إكسوسوميس (20 ميكروغرام / 100 ميكرولتر) مع برنامج تلفزيوني إلى 10،000 أضعاف لتحليل نتا.
   ملاحظة: نتيجة تحليل نتا يعكس عدد وحجم الحويصلات تحليلها.
10. صورة إيفس / إكسوسوميس مع المجهر ترانزميسيونلكترون (تيم)، كما هو موضح سابقا من قبل لين وآخرون ⁴ .

2. إكسوسوم تنقية باستخدام التدرج الكثافة

1. ريسوسبيند ال 110،000 بيليه من الخطوة 1.7 في 40٪ (ث / ت) يوديكسانول في برنامج تلفزيوني (2 مل). تراكب الخليط في تسلسل مع أليكوتس من 30٪، 20٪، 10٪، و 5٪ (ث / ت) يوديكسانول في برنامج تلفزيوني (2 مل لكل منهما) لتشكيل التدرج الكثافة في أنبوب نابذة فائقة السرعة.
2. الطرد المركزي الخليط في 200،000 x ج لمدة 8 ساعات في 4 درجات مئوية.
3. جمع كل جزء التدرج (10 فراكتسيالإضافات. 1 مل / جزء) مع ماصة من الجزء العلوي من الأنبوب.
4. تحليل وجود علامات إكسوسوم (على سبيل المثال، CD81، CD9، CD63، و Tsg101) في كل جزء من سدز-بادج ¹² وصمة عار الغربية. تحميل 50 ميكرولتر تعليق من كل جزء على هلام 10٪ تحتوي على 0.1٪ (ث / ت) سدز وفصل البروتينات في الكسور مع الكهربائي هلام.
5. نقل البروتينات من هلام إلى غشاء بفدف واحتضان الغشاء مع الأجسام المضادة ضد علامات إكسوسوم (على سبيل المثال، CD81، CD9، CD63، و Tsg101) والبروتين التدبير المنزلي غابد بين عشية وضحاها ( جدول المواد ) في 4 درجات مئوية.
   ملاحظة: تحدد النتيجة الكسر الذي يحتوي على إكسوسوميس.

3. خارج الخلية حويصلة / إكسوسوم وسم

1. تعليق إيفس / إكسوسوميس، التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.7، في 10 ميكرومتر كاربوكسيفلورسين سوتسينيميديل استر دياسيتات (كفس) في 20 ميكروغرام من البروتين إكسوسومال / 100 ميكرولتر. إعداد عينة موازية المشتركفقط كفس و بس، معالجتها بنفس الطريقة، كما سيطرة سلبية ل إيف / إكسوسوم المقايسات امتصاص في وقت لاحق. ترك الخلائط عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
2. تعليق إيفس / إكسوسوميس في حجم 50X من برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي تعليق في 110،000 x ج لمدة 60 دقيقة في 4 درجات مئوية. إزالة طاف و ريسوسبيند بيليه إيف / إكسوسوم في برنامج تلفزيوني. كرر الخطوة 3.2 مرة واحدة.
3. تعليق إيفس / إكسوسوميس في برنامج تلفزيوني بتركيز 20 ميكروغرام من البروتين إكسوسومال / 100 ميكرولتر ومن ثم تصفية إيفس / إكسوسوميس من خلال الأغشية 0.22 ميكرون قبل إضافة إيفس / إكسوسوميس إلى الخلايا.

4. خارج الخلية حويصلة / إكسوسوم امتصاص الفحص

1. لجعل وسط الثقافة، مزيج 500 مل من مدب 170، ودرجة الحموضة 7.4 + 500 مل من دمم / F12 مع بيكربونات الصوديوم (0.2438٪)؛ إغف (5 نانوغرام / مل)؛ هدروكوريتيسون (0.5 ميكروغرام / مل)؛ الأنسولين (5 ميكروغرام / مل)؛ و بب (35 ميكروغرام / مل) ⁴ . لوحة الخلايا الثديية هملان الظهارية الإنسان في 6 أطباق جيدا (1 × 10 ^{6 <}/ سوب> الخلايا / جيدا) قبل يوم واحد إيف / إكسوسوم العلاج. إضافة 2 ميكروغرام / مل كفس مضان المسمى إيفس / إكسوسوم، التي تم الحصول عليها في الخطوة 3.3، إلى الوسط الثقافي للخلايا همل لمدة 2-6 ح. علاج خلايا همل من مجموعة السيطرة السلبية مع إعداد مواز، وصفها في الخطوة 3.1.
2. بعد الحضانة 2-6 ح، وغسل الخلايا مرتين مع 4 مل من برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة.
3. فصل الخلايا مع التربسين 0.25٪ لمدة 10 دقيقة وإعادة تعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.2٪ فبس. قياس إيف / إكسوسوم امتصاص من كثافة مضان في الخلايا باستخدام محلل خلية مضان ⁴ . صورة الخلايا تعامل مع إيفس / إكسوسوميس أو السيطرة السلبية باستخدام المجهر متحد البؤر.
   ملاحظة: ويتسبب مضان الأخضر في الخلايا من قبل إيف / إكسوسوم امتصاص. انظر أسطورة الشكل 6 لإعدادات المجهر.

5. عزل ماوس الابتدائي خلايا الظهارية الثديية

إعداد الأطباق المغلفة الجيلاتين بإضافة 12 مل من محلول الجيلاتين 0.1٪ إلى 10 سم الأطباق. وضع لوحات في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. إزالة الحل الجيلاتين وترك الأغطية قبالة الأطباق في غطاء تدفق الصفحي لمدة 4 ساعات حتى تجفيف طلاء الجيلاتين.
1. تشريح عدد 2، 3، 4، و 5 الغدد الثديية ( الشكل 2 ) من 12 أسبوعا العذراء الإناث C57BL / 6 الفئران باستخدام مقص وقطع الغدد إلى قطع صغيرة (2 مم ² ) باستخدام الحلاقة.
2. وعلاوة على ذلك تنفصل الطين الغدد الثديية (من 10 الفئران) لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية، 120 دورة في الدقيقة التحريض مع 50 مل من دمم / F12 تحتوي على 0.2٪ كولاجيناز نوع الرابع، 0.2٪ التربسين، 5٪ فبس، 5 ميكروغرام / مل الجنتامايسين ، و 1x القلم-بكتيريا.
3. بيليه أسفل أورغانويدس الظهارية من الخليط بواسطة الطرد المركزي في 350 x ج لمدة 10 دقيقة.
4. تعليق أورغانويدس الظهارية في 4 مل من دمم / F12 مع 0.1 ملغ / مل دناز أنا لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. إضافة 6 مل من دمم / F12 إلى نهائيحجم 10 مل.
5. الطرد المركزي تعليق في 400 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وتجاهل طاف.
6. ريسوسبيند بيليه في 10 مل من دمم / F12. الطرد المركزي التعليق ولكن ضرب الفرامل عندما تصل السرعة 400 x ز. تجاهل طاف.
   ملاحظة: عن طريق ضرب الفرامل، أورغانويدس الظهارية يتم تكويرها بسرعة أسفل، في حين الخلايا الليفية، وخلايا واحدة، لا تزال البقاء في طاف.
7. كرر الخطوة 5.6 و 5.7 5-7 مرات. إضافة قطرة من تعليق إلى عدادة الكريات ومن ثم التحقق من إزالة الخلايا الليفية من خليط عضوي تحت المجهري بعد كل جولة من الطرد المركزي ( الشكل 3 ).
8. لوحة في أورغانويدس في طبق المغلفة الجيلاتين، التي تم الحصول عليها في الخطوة 5.1، لمدة 48 ساعة مع دمم / F12 تحتوي على 1X إيتس، 5٪ فبس، 50 ميكروغرام / مل الجنتاميسين، 10 نانوغرام / مل إغف، و 1X القلم بكتيريا.
9. بعد 48 ساعة، وإزالة الخلايا العائمة في الثقافة عن طريق استبدال المتوسطة مع وسط الاستزراع الطازج دون فبس (دمم / F12 تحتوي على 1X إيتس، 50 ميكروغرام / مل الجنتاميسين، 10 نانوغرام / مل إغف، و 1 X القلم بكتيريا).
10. تأكد من أن أحادي الطبقة من الخلايا الظهارية الثديية يهاجر وينمو من أورغانويدس الظهارية المرفقة في 3 أيام.

6. فصل الابتدائي الماوس القاعدية / الخلايا الظهارية الثديية اللمعية

1. بعد الثقافة لمدة 3 أيام، وفصل الخلايا الثديية الأولية الماوس مع خليط انزيم طبيعي مع نشاط انزيم بروتين و كولاجينوليتيك لمدة 20 دقيقة. تحييد نشاط الانزيم مع فبس 5٪ في برنامج تلفزيوني.
2. أجهزة الطرد المركزي تعليق في 450 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وتجاهل طاف. ريسوسبيند بيليه الخلية في 5 ملغ / مل ديسباس لمدة 20 دقيقة. تحييد نشاط الانزيم مع فبس 5٪ في برنامج تلفزيوني.
3. أجهزة الطرد المركزي تعليق في 450 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وتجاهل طاف.
4. إعادة تعليق الخلايا في 100 ميكرولتر بس مع 0.2٪ فبس في تركيز 10 ⁷ خلية / مل مع المخففومكافحة CD49f والأجسام المضادة لمكافحة إبكام على الجليد لمدة 1 ساعة في الظلام.
5. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني ومن ثم احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الثانوية فلورفور مترافق على الجليد لمدة 30 دقيقة في الظلام.
6. غسل وإعادة تعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني مع 0.2٪ فبس.
7. فرز إبكام ^مرحبا / CD49f ^لو الخلايا الظهارية الثديية اللمعية على فارز الخلية ⁴ .

7. خارج الخلية حويصلة / إكسوسوم العلاج

1. البذور فرزها إبكام ^مرحبا / CD49f ^لو الخلايا الظهارية الثديية اللمعية من الخطوة 6.7 على أطباق الجيلاتين المغلفة 6 جيدا (2 × 10 ⁵ خلية / جيدا) ومن ثم علاجها مع برنامج تلفزيوني أو 2 ميكروغرام / مل ناميك المستمدة إيفس / إكسوسوميس التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.7.
2. لضمان فعالية بيولوجية من إيفس / إكسوسوميس في علاج الثقافة على المدى الطويل، واستبدال وسط زراعة الخلايا مع المتوسطة الطازجة التي تحتوي على برنامج تلفزيوني أو 2 ميكروغرام / مل ناميك المستمدة إيفس / إكسوسوميس كل يومين. لا تقسم الماوس الأوليري الخلايا اللمعية خلال العلاج لمدة 10 يوما.

8. الدهون وسادة حقن الخلايا الظهارية الثديية

1. تخدير الإناث البالغ من العمر 3 أسابيع C57BL / 6 الفئران مع إيسوفلوران 2-3٪ استنشاق.
2. ضع الماوس تخدير على ظهره. إزالة الفراء على منتصف البطن مع الحلاقة / كريم الشعر وتنظيف موقع الجراحة مع ثلاث دورات بالتناوب من الكحول 70٪ والبوفيدون اليود.
3. جعل شق العمودية 1.5 سم من خلال الجلد على طول المنطقة البطنية الصدري-الإربية مع مقص ثم تعريض بالتناوب الحق واليسار 4 منصات الثدي الثديية.
4. مسح كل لوحة الدهون عن طريق إزالة حمة الغدة مع مقص. تحديد العقدة الليمفاوية في لوحة الدهون ثم إزالة حمة الغدة كلها تحت العقدة الليمفاوية.
   ملاحظة: يجب أن تبقى ثلثي لوحة الدهون في مكانها.
5. فصل الخلايا التي تم الحصول عليها من الخطوة 7.2 مع خليط انزيم طبيعي (انظر جدول المواد ) مع بروتيننشاط الكولاجينولتيك انزيم لمدة 10 دقيقة. تحييد نشاط الانزيم مع فبس 5٪ في برنامج تلفزيوني.
6. أجهزة الطرد المركزي تعليق في 450 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وتجاهل طاف. عد الخلايا مع عدادة الكريات وتعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني في تركيز مثل أن 15 ميكرولتر يحتوي على جرعة الخلية المطلوبة (10 ⁴ -10 ² خلية / وسادة).
7. حقن 15 ميكرولتر من تعليق الخلايا الظهارية الثديية في لوحة الدهون باستخدام 100 حقنة الزجاج ميكرولتر تعلق على إبرة 27G.
8. كرر الخطوات 8،4-8،7 لوحة الدهون على الجانب الآخر.
9. إغلاق الجلد مع مقاطع الجرح.

9. الثديية الغدة جبل كامل

1. الموت ببطء الماوس مع كو ₂ زائد خلع عنق الرحم في 8 أسابيع بعد حقن الخلية (الخطوة 8.7).
2. إجراء شق عمودي من خلال طبقة الجلد من المنطقة الصدرية إلى المنطقة الأربية باستخدام مقص ثم كشف كل من اليمين واليسار 4 ممنصات الدهون الأمري. إزالة الغدد الثديية ^ال 4 ( الشكل 2 ).
3. انتشار منصات الدهون على الشرائح المجهر الزجاجي وإصلاح منصات الدهون مع مثبت كاهل (4٪ الفورمالديهايد، 30٪ إتوه، و 2٪ حمض الخليك الجليدي) في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
   تنبيه: مثبت كاهل هو مهيج. تنفيذ هذه الخطوة في غطاء محرك السيارة الكيميائية.
4. غسل منصات الدهون في 250 مل من 70٪ إتوه لمدة 15 دقيقة ثم في 250 مل من د ₂ O لمدة 5 دقائق. وصمة عار منصات الدهون مع الشبك القرم (1 غرام من الكارمين و 2.5 غرام من كبريتات البوتاسيوم الألومنيوم في 500 مل من د ₂ O) في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
5. غسل منصات الدهون مع 250 مل من إتوه 70٪ لمدة 15 دقيقة، 250 مل من 95٪ إتوه لمدة 15 دقيقة، و 250 مل من إتوه 100٪ لمدة 15 دقيقة.
6. تنظيف منصات الدهون في الزيلين لعدة أيام ووقف الحضانة زيلين عندما تصبح منصات الدهون شفافة.
   الحذر: الزيلين هو مهيج. تنفيذ هذه الخطوة في غطاء محرك السيارة الكيميائية.
7. جبل الشرائح وايتصاعد وسط والتقاط الصور (2،400 نقطة في البوصة) من منصات الدهون باستخدام الماسح الضوئي الشريحة الرقمية.

منذ أن تبين أن منع ي ₂ / إب ₄ تشوير يطلق إيف / إكسوسوم الافراج عن الثديية مثل الخلايا الجذعية القاعدية ⁴ ، وهذا العمل يقدم وسيلة لعزل إيفس / إكسوسوميس الناجم عن الثديية الظهارية الخلايا القاعدية (ناميك) الثقافة. منذ نامس مثقف في وسط خالية من المصل، لا يوجد أي إيفس / إكسوسومس موجودة مسبقا المستمدة من المصل ¹³ . بالنسبة للخلايا المستزرعة في الوسط المحتوي على المصل، يجب أن يتم تنظيف الأكسوسومات الموجودة مسبقا في الوسط قبل التنظير الفائق عند 110،000 x ج قبل استخدام الوسط لثقافة الخلايا المصدر لجمع المركبات الكهربائية / إكسوسوميس ⁵ . إيفس / إكسوسوميس من 4 أيام التي يسببها ناميك مكيفة مكيفة يمكن عزلها من بيليه 110،000 x ج من قبل التفريغ التفاضلي التفاضلي، كما هو موضح في الشكل 1 . عدد وحجم الحويصلات المعزولة في 110،000 زغ بيلويمكن قياسها باستخدام تحليل تتبع الجسيمات متناهية الصغر (نتا). و 110،000 ز جزء بيليه معزولة عن طريق التفاضل الفائق التفاضلي يحتوي أساسا ~ 100 حويصلات نانومتر ( الشكل 4A ). وهذا يتوافق مع حجم إكسوسوميس (50 - 150 نانومتر) ذكرت في الأدب. وبالإضافة إلى ذلك، أظهر تحليل تيم أن 110،000 ز الكسور من المتوسطة مكيفة ناميك تحتوي على حويصلات غشاء وفيرة ( الشكل 4B ). على الرغم من أن تنبيذ فائق التفاضلية يمكن أن تولد إكسوسوميس نقية بشكل معقول، فإن الخطوة تنقية التالية باستخدام التدرج الكثافة يزيل أيضا الملوثات (على سبيل المثال، مجاميع البروتين) ⁵ . في التدرج الكثافة، إكسوسوميس تطفو في التدرج بسبب محتوى الدهون في الحويصلة، في حين أن مجاميع البروتين، إن وجدت، البقاء في الجزء السفلي من التدرج. يتم جمع كل جزء من التدرج للكشف عن صناع إكسوسوم (على سبيل المثال، CD81، CD63، CD9، و TSG101 6 ^{، 7} ) بواسطة النشاف الغربي. علامات إكسوسوم يمكن الكشف عنها في جزء مع ~ 20٪ يوديكسانول ( الشكل 5 ). الكسر الذي يحتوي على إكسوسوميس يمكن أن تضعف مع برنامج تلفزيوني وتعرض إلى 200،000 xg التنبيذ الفائق لعزل إكسوسوميس. يتم غسلها بيليه إكسوسوم معزولة مرة واحدة في برنامج تلفزيوني ومن ثم معلق في برنامج تلفزيوني وتخزينها في -20 درجة مئوية لمزيد من التحليل.

قبل قياس امتصاص نامس المستمدة من إيف / إكسوسوميس من قبل نظيره غير الجذعية للخلايا الظهارية الثديية خلايا همل-إيف / إكسوسوميس يجب أن توصف بصبغة الفلورسنت (على سبيل المثال، كاربوكسيفلورسين سوتسينيميديل استر (كفس)). عينة موازية تحتوي على كفس فقط ولكن لا إيف / إكسوسوم تتم معالجتها في نفس الإجراء وضع العلامات. هذه العينة هي عنصر تحكم سلبي المستخدمة في إيف / إكسوسوم فحص امتصاص التالية لتعكس تأثير كمية أثر من كفس مجانا المتبقيةE صبغ. يتم استزراع الخلايا همل مع كفس المسمى، نامس المستمدة إيفس / إكسوسوميس أو السيطرة السلبية لمدة 2-6 ح ثم يتم إخضاعها لتدفق الخلوي. وبالمقارنة مع الخلايا همل غير المعالجة، والخلايا همل مثقف مع السيطرة السلبية تعبر عن مستوى أعلى قليلا من إشارة كفس ( الشكل 6A ، خط أحمر مقابل خط البرتقال)، والذي يعكس مستوى الخلفية الإشارات كفس الناجمة عن المتبقية كفس خالية اليسار من إيف / إكسوسوم عملية وسم. وعلاوة على ذلك، بالمقارنة مع خلايا همل المعالجة التي تسيطر عليها سلبية، والخلايا هممل مثقف مع كفس المسمى، إكسوسوميس المستمدة ناميك تعبر عن 10 أضعاف إشارة كفس أعلى ( الشكل 6A ، الخط الأزرق مقابل الخط الأحمر)، والذي ينتج عن امتصاص محددة من إيفس / إكسوسوميس المسمى كفس. امتصاص كفس المسمى، نامس المستمدة إيفس / إكسوسوميس بواسطة خلايا هممل يمكن أيضا أن يلاحظ المجهر متحد البؤر. في حين أن خلايا همل المعالجة التي تسيطر عليها سلبية لا تظهر إشارة كفس، امتصاص ناميك-المشتقة إيف / إكسوسوميس بواسطة خلايا هممل يمكن ملاحظتها مع إشارة كفس تحت المجهر متحد البؤر في الخلايا المسمى إيف / إكسوسوم المعالجة ( الشكل 6B ).

لتقييم ما إذا كان نامس المستمدة من إيف / إكسوسوميس يمكن نقل الثديية تشكيل الغدة القدرة من الجذعية مثل الخلايا القاعدية الثديية إلى الخلايا اللمعية الثديية، يتم عزل الخلايا اللمعية الماوس الماوس لأول مرة للسماح لتحليل تشكيل الغدة الثديية في الفئران. يتم عزل ماوس الخلايا الظهارية الثديية من الفئران 12 سنة من العمر. يتم قطع الغدد الثديية إلى قطع صغيرة ويتم فصل أكثر مع كولاجيناز والتريبسين. ويمكن فصل أورغانويدس الظهاري فصل والخلايا الليفية عن طريق التفاضلية الطرد المركزي، كما هو موضح في الخطوات 5.7 و 5.8. في كل جولة من الطرد المركزي، بيليه في الجزء السفلي من الأنابيب يجب أن تحتوي أساسا أورغانويدس الظهارية، وينبغي أن الخلايا الليفية وخلايا واحدة تطفو في سوبرناتان ر. بالمقارنة مع خليط يحتوي على كل من أورغانويدز الظهارية والألياف الليفية قبل الطرد المركزي التفاضلي ( الشكل 3 ، لوحات العلوي)، والجولات الست من الطرد المركزي واضحة من معظم الخلايا الليفية وخلايا واحدة في الخليط ( الشكل 3 ، لوحة أسفل).

يتم فصل الخلايا الظهارية الثديية ( الشكل 7 ) من أورغانويدس الظهارية باستخدام خليط الانزيم الطبيعي مع نشاط انزيم بروتين و كولاجينوليتيك و ديسباس لتوليد خلايا واحدة في التعليق. فرز تعليق خلية واحدة من خلال التعبير عن سطح الخلية CD49f و إبكام يمكن فصل الخلايا اللمعية الثديية (إبكام ^مرحبا / CD49f ^لو )، والخلايا القاعدية الثديية (إبكام ^لو / CD49f ^مرحبا )، والخلايا غير الظهارية (إبكام ^- ) ( الشكل 8 ).

n-بادج = "1"> يتم استزراع الخلايا الإبتدائية الثديية المعزولة إبكام ^هاي / CD49f مع نامس المستمدة من ناميك / إكسوسوميس لمدة 10 أيام، ويتم استبدال المركبات الطاردة / إكسوسوميس الطازجة والمتوسطة كل يومين. بعد إيف / إكسوسوم العلاج، يتم زرع الخلايا اللمعية الثديية في منصات الدهون الثديية ^ال 4 ( الشكل 2 ) من الفئران. بعد 8 أسابيع، يتم عزل منصات الدهون وملطخة لتحليل تشكيل الغدة الثديية ( الشكل 9 ). العلاج مع المستحثة ناميك إيفس / إكسوسوميس يسمح الخلايا اللمعية لاكتساب القدرة على تشكيل الغدة الثديية ⁴ . و ناميك المستمدة، إيف / إكسوسوم المعالجة الخلايا اللمعية الثديية تشكل الغدد الثديية في منصات الدهون الماوس ( الشكل 9 ).

الشكل 1: توضيح من خارج الخليةr فيسيكل / إكسوسوم بوريكاتيون طريقة من خلية ثقافة متوسطة بواسطة التفاضلية فائقة السرعة. يشار إلى سرعة وطول كل الطرد المركزي. بعد كل واحد من أول الطرد المركزي الثلاثة، يتم الاحتفاظ طاف للخطوة التالية. بعد الطرد المركزي 110،000 × g، يتم الاحتفاظ الكريات و سوبرناتانتس التخلص منها. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: الماوس الغدة الثديية التشريح. الفئران لديها خمسة أزواج من الغدد الثديية، وأشار إلى الأرقام 1-5، وتقع في منصات الدهون (الأحمر) مباشرة تحت الجلد. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من ثهو الرقم.

الشكل 3: صور خليط من أورغانويدس الظهارية وخلايا منصات الدهون قبل وبعد الطرد المركزي التفاضلي. صور مشرق- فيلد من الخلائط الخلوية وسادة وسادة معزولة قبل وبعد الطرد المركزي التفاضلي، مأخوذة من عدادة الكريات. رأس السهم: أورغانويدس الظهارية. السهم: الخلايا الليفية وخلايا واحدة. شريط مقياس = 0.5 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: حجم الحويصلة وتحليل تركيز NAMEC110،000 زغ بيليه الكسر. و 110،000 غرام بيليه جزء من وسط ناميك هو كول محاضرة وتعرض ل ( A ) تحليل تتبع الجسيمات النانوية (نتا) و ( B ) المجهر الإرسالية (تيم). شريط مقياس = 1 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: الكشف عن إكسوسوميس في الكسور من التدرج الكثافة. تحليل لطخة غربية من علامات إكسوسوم CD81، CD9، CD63، و Tsg101 والجينات التدبير المنزلي غابد يكشف عن 20٪ جزء يوديكسانول تحتوي على إكسوسوميس. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

55736fig6.jpg "/>
الشكل 6: الكشف عن الحويصلة خارج الخلية / إكسوسوم امتصاص عن طريق التدفق الخلوي ومحد البؤر المجهري. تم قياس إيف / إكسوسوم امتصاص في خلايا همل. يتم إضافة كفس المسمى، نامس المستمدة إيف / إكسوسوميس والسيطرة السلبية إلى الثقافات المشار إليها لمدة 6 ساعات. بعد الحضانة، وتخضع الخلايا ل ( A ) التدفق الخلوي و ( B ) المجهري متحد البؤر. و كفس (الأخضر؛ الإثارة / الانبعاثات (نانومتر): 492/517؛ مجهر ليزر خط: 488) شدة الفلورسنت الفلوري إعادة تأثير امتصاص إيف / إكسوسوم. تم تلطخ نوى الخلية مع دابي (الأزرق؛ الإثارة / الانبعاثات (نانومتر): 358/461؛ خط ليزر المجهر: 405) وأغشية البلازما ملطخة بقمة غشاء البلازما (الأحمر؛ الإثارة / الانبعاثات (نانومتر): 649/666. المجهر خط الليزر: 633؛ انظر جدول المواد ). عدسة الهدف متحد البؤر: هكس بل أبو 63x / 1.40-0.60 النفط. شريط مقياس = 20 ميكرون.أد / 55736 / 55736fig6large.jpg "تارجيت =" _ بلانك "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 7: صور من أورغانويدس الظهارية المرفقة. صور مشرق- فيلد من الخلايا الظهارية الثديية التي شكلتها الخلايا تهاجر وتنمو من أورغانويدس الظهارية المرفقة. شريط مقياس = 100 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 8: فرز الخلايا الأولية الظهارية الثدي ماوس بواسطة إبكام السطح و CD49f. ماوس الخلايا الظهارية الثديية معزولة من منصات الدهون من الفئران البالغة من العمر 12 أسبوعا يتعرضون للفرز الخليةجي. يتم إثراء ماوس الخلايا الثديية اللمعية في إبكام ^مرحبا / CD49f ^لو السكان، ملحوظ مع دائرة زرقاء. تم إثراء الخلايا القاعدية في إبكام ^لو / CD49f ^مرحبا السكان، ملحوظ مع دائرة حمراء. يتم وضع علامة على الخلايا غير الظهارية مع الصندوق الأسود في المؤامرة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 9: تشكيل الغدة الثديية من قبل الماوس الابتدائية خلايا الثديية اللمعية. يتم التعامل مع الماوس الأساسي إبكام ^مرحبا / CD49f ^لو الخلايا اللمعية مع برنامج تلفزيوني أو نامس المستمدة إيف / إكسوسوميس في زراعة الخلايا لمدة 10 يوما وزرعها في منصات الدهون تطهير الفئران 3 أسابيع من العمر. يتم الموت الرحيم الفئران و نكروبسيد بعد 8 أسابيع لتحليل شكل الغدة الثدييةأوجه. شريط مقياس = 0.75 سم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: النسبة المئوية ومتوسط ​​كثافة الإسفار (مفي) للسكان الموصوفين في الشكل 8.

إكسوسوميس غالبا ما تحمل خصائص الخلايا التي أفرجت عنها، وكمية من إكسوسوميس الافراج عنهم يمكن أن يسببها المحفزات ⁴ . يمكن جمع وسط الثقافة من الخلايا وتعرض لتنبيذ فائق التفاضلية لجمع إيف / إكسوسوم ( الشكل 1 ). لا يوجد حاليا اتفاق عام على طريقة مثالية لعزل المركبات الكهربائية / إكسوسوميس. وقد تم تحديد الطريقة المثلى المستخدمة هنا بواسطة تطبيق المصب ¹⁴ . الطرد المركزي هو طريقة سريعة نسبيا لعزل إيفس / إكسوسوميس، والتي يمكن الحفاظ على النشاط البيولوجي لل إيفس / إكسوسوميس. ومع ذلك، فإن الحويصلات معزولة عن طريق التنبيذ الفائق تحتوي عموما على خليط من المركبات الكهربائية، التي تحتوي على إكسوسوميس المنتجة عن طريق المقصورات إندوسومال و / أو الحويصلات المنتجة عبر مهدها من غشاء الخلية.

من خلال تحليل أحجام الحويصلات مع نتا ( الشكل 4A )، والحويصلات وجدت لتنقية في 110،000 x ج خلال التفاح التفاضلي التفاضلي كانت أساسا 50-150 نانومتر، والذي يتوافق مع حجم إكسوسوميس. وتشير البيانات نتا أن إكسوسوميس المستمدة من ناميك يمكن عزلها من وسط الثقافة في 110،000 x ج خلال التفريغ التفاضلي التفاضلي. ومع ذلك، فإن نتا و تيم قدم هنا تسمح فقط لتصور الحويصلات أو قياس حجم وعدد من السكان كاملة من المركبات الكهربائية. هذه التقنيات لا يمكن قياس عدم التجانس من السكان إيف أو حتى فرز السكان إيف غير متجانسة. وقد بدأ العلماء لتطوير أساليب استخدام أجهزة قياس التدفق الخلوي لتحليل وفرز السكان إيف ¹⁵ .

على الرغم من أن التفاح التفاضلي التفاضلي يمكن أن تستخدم لتنقية إكسوسوميس، وينبغي استخدام التدرج الكثافة لمواصلة إزالة تلوث مجاميع البروتين من الحويصلات إكسوسوم في كسغ معزولة 110،000 زغ ⁵ . إكسوسوميس تحتوي على الأغشية الدهنية. الدهون في الأغشية إكسوسوم يجعل إكسوسوميس تطفو في التدرج الكثافة، في حين تقع المجاميع البروتين إلى أسفل التدرج الكثافة. إكسوسوميس تعبر عن علامات محددة (على سبيل المثال، CD81، CD63، CD9، و TSG101 ^{6 ، 7} ). من خلال تحليل وجود علامات إكسوسوم في كسور التدرج الكثافة، فمن الممكن تحديد إكسوسوميس في جزء مع ~ 20٪ يوديكسانول ( الشكل 5 ). وينبغي فحص علامات إكسوسوم متعددة لتحديد إكسوسوميس في التدرج الكثافة، حيث أن كل مجموعة من إكسوسوميس قد تعبر عن علامات إكسوسوم مختلفة ¹⁶ .

امتصاص إيف / إكسوسوميس بواسطة الخلايا يمكن قياسها باستخدام الفلورسنت صبغ المسمى إيفس / إكسوسوميس. يمكن قياس عدد الخلايا استيعاب إيفس المسمى / إكسوسوميس عن طريق التدفق الخلوي ( الشكل 6A ). لتأكيد أن فلووالرجوع من الخلايا نتيجة لامتصاص إيفس المسمى / إكسوسوميس ولكن ليس من الصبغة الحرة، تم فحص نمط مضان في الخلايا باستخدام المجهر. يظهر المجهر متحد البؤر أن نمط مضان في الخلايا إيف / إكسوسوم المعالجة منقط ( الشكل 6B اللوحة اليمنى). ومن المرجح أن تنتج الإشارات المنقطية من إيفس / إكسوسوميس المسمى، وليس من مضان الحرة. إشارات منقط في الخلايا يمكن إجراء مزيد من التحليل مع إضاءة منظمة فائقة الدقة المجهر، الذي لديه أعلى دقة في 85 نانومتر ^{4 ، 17} . يمكن فائقة الدقة المجهر تأكيد أن الإشارات منقط من ~ 100 نانومتر حويصلات جوفاء، والتي تشبه إكسوسوميس ⁴ . وتشير هذه النتائج إلى أن إكسوسوميس المستمدة من ناميك يمكن تناولها من قبل الخلايا الظهارية الثديية في الثقافة.

غالبا ما تحمل المركبات النانوية المستمدة من ناميك / إكسوسوميس جزيئات (على سبيل المثال، بروتينات و ميرنا) ضرورية لخصائص خلايا معينة ¹ . هذا يشير إلى أن نامس المستمدة من إيفس / إكسوسوميس يمكن نقل خصائص نامكس ( مثل القدرة على تشكيل الغدة الثديية) نظرائهم الخلايا الظهارية. منذ الخلايا الظهارية الثديية الإنسان لا يمكن أن تشكل الغدد الثديية بشكل زيني في منصات الدهون الماوس ^{18 ، 19} ، ويمكن فحص نقل القدرة تشكيل الغدة باستخدام الماوس الخلايا الظهارية الثديية الماوس. الماوس الأساسي الثديية إبكام ^مرحبا / CD49f ^لو الخلايا اللمعية، والتي لا تشكل الغدد الثديية، ويمكن عزلها من الفئران البالغة من العمر 6 أسابيع ( الشكل 7 والشكل 8 ). ويمكن تقسيم الخلايا المعزولة من منصات الدهون الماوس إلى ثلاث مجموعات ( أي، إبكام ^مرحبا / CD49f ^لو الخلايا اللمعية، إبكام ^لو / CD49f ^مرحبا الخلايا القاعدية، و إبكام - الخلايا غير الظهارية) من خلال دراسة لوفيلس من سطح إبكام و CD49f ( الشكل 8 ). إبكام ^لو / CD49f ^مرحبا الخلايا القاعدية يمكن أن تشكل الغدد الثديية في البدع الدهون عند زرعها في منصات الدهون، ولكن إبكام ^مرحبا / CD49f ^لو الخلايا اللمعية لا يمكن ⁴ . وهكذا، يمكن استخدام إبكام ^مرحبا / CD49f ^لو السكان الخلايا اللمعية لدراسة القدرة الناجمة عن نامس المستمدة إيف / إكسوسوميس لنقل القدرة على تشكيل الغدة الثديية. يمكن الاحتفاظ إبكام ^مرحبا / CD49f الخلايا اللمعية ^لو معزولة في الثقافة لمدة 7-10 أيام لعلاج إيف / إكسوسوم ⁴ . وتجدر الإشارة إلى أن الحفاظ على الخلايا الظهارية الثديية الأولية في المختبر لفترة أطول يمكن أن يخفف من جدوى الخلايا.

يمكن زرع الخلايا اللمعية إيف / إكسوسوم الثديية في منصات الدهون مسحها لتحليل القدرة على تشكيل الغدة الثديية. يجب إزالة منصات الدهون من الفئران المستخدمة لزرع في 3 أسابيع من العمر. ار 3 أسابيع من العمر، وتقتصر الخلايا الظهارية الثديية في المنطقة بين الحلمة واللمف من لوحة الدهون. الظهارة الثديية في لوحة الدهون يمكن مسحها عن طريق إزالة المنطقة بين الحلمة واللمف في 3 أسابيع من العمر. يتم زرع الخلايا اللمعية الثديية مباشرة بعد تطهير لوحة الدهون، ويمكن تحليل تشكيل الغدة من قبل الخلايا المزروع في 8 أسابيع بعد الزرع. تأثير نامس المستمدة من إيف / إكسوسوميس على نقل القدرة على تشكيل الغدة الثديية للخلايا اللمعية الثديية يمكن تقييمها من قبل تشكيل الغدة من الخلايا اللمعية والخلايا اللمعية إيف / إكسوسوم المعالجة ( الشكل 9 ). وتحمل المركبات إيف / إكسوسوميس المستحثة من نامكس ممتلكات الخلايا الظهارية القاعدية الثديية - القدرة على تشكيل الغدة - والخلايا اللمعية التي تستوعب إيفس / إكسوسوميس الناجم عن نامكس يمكن الحصول على الممتلكات من نامكس عن طريق إيف / إكسوسوميس. هذا العمل يدل على الأدلة التي تبين أن الجزيئات المسؤولة عن إيف / إكسوسوم وسائل الإعلامتيد نقل الغدة الثديية تشكيل القدرة موجودة في الطوافات الدهنية من إيفس / إكسوسوميس ⁴ .

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من معاهد البحوث الصحية الوطنية (05A1-CSPP16-014، هجل) ومن وزارة العلوم والتكنولوجيا (موست 103-2320-B-400-015-MY3، هجل).