Модель для периневральная инвазия в области головы и шеи карцинома роговых клеток

Perineural invasion (PNI) is a common feature of head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC), conferring lower survival rates. Its mechanisms are poorly understood. Utilizing neurites generated from murine dorsal root ganglia confined to a semisolid matrix, the pathways involved in the PNI of HNSCC cell lines can be investigated.

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, radiation, and chemotherapy, locoregional recurrences and distant metastases occur at higher rates, and overall survival is decreased by 40% compared to HNSCC without PNI. In vitro studies of the pathways involved in HNSCC PNI have historically been challenging given the lack of a consistent, reproducible assay. Described here is the adaptation of the dorsal root ganglion (DRG) assay for the examination of PNI in HNSCC. In this model, DRG are harvested from the spinal column of a sacrificed nude mouse and placed within a semisolid matrix. Over the subsequent days, neurites are generated and grow in a radial pattern from the cell bodies of the DRG. HNSCC cell lines are then placed peripherally around the matrix and invade preferentially along the neurites toward the DRG. This method allows for rapid evaluation of multiple treatment conditions, with very high assay success rates and reproducibility.

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is the sixth most common cancer in the US, with 10,000 deaths per year nationally and 300,000 deaths per year worldwide¹. The overall prognosis for HNSCC has remained unchanged at 50% for the past several decades. Perineural invasion (PNI) is one of the most prominent pathological features that portend a poor prognosis in patients with HNSCC. Unfortunately, PNI is a frequent occurrence in HNSCC and can be found in up to 40% of HNSCC patients^2,3.

PNI is the process by which malignant cells track along nerves to adjacent tissues, allowing for higher rates of local and distant spread. Accordingly, PNI-positive HNSCC tumors have higher rates of locoregional recurrences and distant metastases, resulting in lower overall survival compared to HNSCC patients without PNI^4-8.

Although the treatment of patients with PNI is typically maximized by employing surgery, radiation, and chemotherapy, the overall survival rates of these patients are still decreased by up to 40% compared to patients without PNI^9-11. Thus, it is clear that the current treatment modalities for HNSCC are ineffective in improving the adverse prognosis associated with PNI. The approach of developing targeted therapy against PNI in HNSCC has been hindered by the poor understanding of the factors that regulate this process. This is, in part, a consequence of the lack of a consistent in vitro model for the study of PNI in HNSCC.

In recent years, several groups have been utilizing an in vitro model for studying PNI in predominantly pancreatic and prostate cancers^12-19. This model uses the neurites generated from dorsal root ganglia isolated from mice or rats as a surrogate for large-nerve invasion. The dorsal root ganglia are fixed in a factor-depleted semisolid matrix, which is a solubilized basement membrane protein mixture secreted by Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells. This matrix allows for the outgrowth of the neurites and the tracking of single cancer cells along these neurites. Described here is the adaption of this model for the examination of PNI in HNSCC.

1. Приготовление культуральной среды и блюда (10 мин)

1. Добавьте 100 мкл Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM) с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) в лунки V-образным дном 96-луночного.
2. Удалить предварительно аликвоты флакона приблизительно 100 мкл полужидкой матрицы из морозильной камеры 20 ° C и поместите его непосредственно на льду.
   Примечание: Сделайте это до дорзального корневого ганглия (DRG) урожай, потому что полутвердые матрица занимает около 30 минут, чтобы добраться до жидкого состояния на льду, которая необходима для последующих шагов. Неспособность держать полутвердые матрицы на льду в любое время приведет матрицу капельку некачественный.
3. Этикетка со стеклянным дном культуры плиты с несмываемыми чернилами, создавая уникальные идентификаторы в каждом из четырех углов на нижней поверхности пластины. Место пластин правой стороной вверх на льду для охлаждения поверхности пластины.
   Примечание: выходы Каждая мышь 32 - 40 DRG, поэтому маркировать их от 1 до 40. Не надо предварительно холодок пидомашнее животное советы, как и охлажденные советы будут согревать в течение размещения капель матрицы, потенциально вводя различия в матричной последовательности.

2. Препарирование крысиных DRG (45 мин)

1. Эвтаназии в бестимусных голых мышей в соответствии с конкретными лабораторных протоколов, например, путем использования СО ₂ камеры и торакотомии.
2. Настройте область рассечение и микроскоп. Используйте чистую, стерилизуют и плоскую нижнюю сторону полистирола контейнеров для 15- или 50-мл конические пробирки.
   Примечание: Кроме того, они пригодны для использования в качестве поверхности рассекает, поскольку они недороги, одноразовые, и позволяют фиксации позвоночника с помощью булавок или игл. Используйте только стерилизованные инструменты и иглы.
3. Под естественным зрением, сделать продольный разрез вдоль позвоночника от корня хвоста к голове мыши с парой прямых или изогнутых тонких ножниц.
4. Используйте те же ножницы, чтобы поперечно разделяй ниже SacrАль позвоночника. Рассеките обе стороны позвоночника вплоть до основания черепа, используя ножницы. На данный момент, убедитесь, что шейный отдел позвоночника перерезают краниальном, насколько это возможно с помощью ножниц.
5. Обратите внимание на цервикальный конец позвоночника под операционным микроскопом при низкой мощности. Белый спинного мозга проявляется в середине костным кольцом, которое окружено различными количествами параспинальных мышц и мягких тканей.
6. Отделить спинной или превосходящую аспект первых 2 - 3 тел позвонков с микроскопическими пружинными ножницами. Используя пружинящее действие ножниц, открыть этот первоначальный костистые вырезать, чтобы гарантировать, что позвоночный рассечение тела произошел в средней линии. Продолжить небольшими шагами по направлению к крестцового отдела позвоночника, а затем рассекают позвоночника, выполнив одинаковые разрезы на брюшной или нижней аспекте тел позвонков.
   Примечание: необеспечение средней линии рассечения костного позвоночника приведет к снижению выхода DRG.
7. В This точка, позвоночник делится на две половины. Поместите один полугидрата позвоночник в сторону, со спинным мозгом на месте и лицевой стороной вниз на стерильную тарелку.
   Примечание: Выход из спинного мозга в месте будет препятствовать ДРГ от высыхания, так как DRGs глубоко в спинной мозг.
8. Закрепите либо конец другого полугидрата позвоночника с двумя 18-калибровочных игл на полистирольной рассечения платформе. Начиная с шейки матки конца (что очевидно, так как позвоночник уже, КСГ ближе друг к другу, и есть ребро инсерций), осторожно отгибают спинной мозг от приблизительно 4 вертебральных уровней.
9. Обратите внимание на сенсорные нервы (обычно два), соединяющие DRG. В области, где нервы вставки к DRG, мягко понять окружающие фасции с микроскопическими щипцов. Проанализируйте и дифферента этот фасции и другие нервные ткани с микроскопическими пружинными ножницами, чтобы освободить DRG. Нежный втягивание принесет DRG из своей позиции в костяной позвоночника.
   Примечание: УвеличениеМикроскоп мощности на этом этапе является полезным. Размозжение к DRG существенно ограничит рост невритов. Чтобы избежать этого, никогда не захватывая DRG непосредственно, а скорее путем захвата окружающих фасции.
10. Обрежьте периферических нервов (The DRG обычно имеет один периферийный нерв, который глубоко по отношению к рассекает зрения) с микроскопическими пружинными ножницами, чтобы освободить DRG.
    Примечание: Это проще всего выяснить, где нервные окончания и DRG начинается в то время как по напряжению, так что делает это сокращение как можно ближе к DRG на данный момент является идеальным. После этого дистальной ветви вырезают, ближние ветви обрезают, а также.
11. Обрежьте DRG любых паразитных нервных волокон или фасциальным вложений с помощью микроскопических пружинных ножниц. После адекватной изоляции, поместите DRG в комнатной температуре среды в 96-луночного V-образным дном.
    Примечание: Размещение темный фон под пластина делает визуализируя суб-мм белый DRGs легче. Только поместите один DRG в EACч хорошо; Таким образом, они могут быть объяснены более легко в последующих стадиях.
12. Повторите этот процесс весь путь вниз один полугидрата позвоночника, а затем другой. Каждая сторона дает 16 - 20 ДРГ, на общую сумму 32 - 40.
    Примечание: Если есть меньше DRGs, чем это, рассечение позвоночника необходимо проводить дальнейшую цефально и / или каудально. В DRGs становятся все более менее хорошо определена как один идет каудально.

3. Получение полутвёрдые Matrix Капельки (<1 мин на пластину)

1. Удалить один стакан хорошо нижнюю пластину из льда и поместите его на блок со льдом под операционным микроскопом. Убедитесь, что аликвоты матрицы остается на льду во все времена.
2. Поместите капельку 1,5-мкл матрицы в каждом из четырех углов со стеклянным дном пластины с 2-х мкл или 10-мкл micropipetter, оставляя расстояние по крайней мере, столь же большой, как и сама капельке от края стекла скважины.
   1. Поместите кончик пипетки непосредственно настекло под углом 45 градусов. Медленно пипеткой матрицу. Медленно отойти от стеклянным дном после того, как матрица занимается на пластине.
      Примечание: поверхностное натяжение между матрицей и стеклом должны создать идеальный полушарии каждый раз.
   2. Прекратить пипеткой непосредственно перед верхушкой пуст, так как непреднамеренное нагнетание воздуха в матрицу капельке составляет диаметр матрицы капельке гораздо большей и трудно удалить.
      Примечание: Используя вторую руку, чтобы стабилизировать пипетирования руку способствует более точного размещения.

4. Вставка DRG в полутвёрдые Matrix Капельки (<2 мин на пластину)

1. Оставьте пластину с матричными капель на короткое время при комнатной температуре (~ 1 мин). Это слегка напрягается матрицу, что делает его более легким для точного размещения DRG.
2. Совок (не понимают) DRG мягко с закрытыми микроскопическими пинцетом в левой руке. Опять же, темный фон, на маленький, белыйDRG облегчает визуализацию. Перенести DRG на кончик 21 иглы калибра в правой руке. Эта передача будет оставить остаточный носитель на пинцетом.
3. Аккуратно вставьте DRG в середину капельке матрицы с использованием 21 калибра иглы (рисунок 1). Большую часть времени, то КСГ легко релиз в матрицу и затем могут быть расположены по центру с иглой.
   1. Если КСГ прилипает к игле, использовать микроскопические щипцов, чтобы подтолкнуть DRG от иглы и в матрицу капельке. Фитиль от избыточных средств массовой информации из микроскопических щипцов с лаборатории салфеткой.
      Примечание: Введение средств массовой информации к матрице будет изменять диаметр, объем и последовательность анализа. Льдины с цветом или цветного фона письменной форме обеспечивает контраст, что облегчает визуализацию этого сложного процесса.
4. После того, как пластина имеет все четыре ДРГ, выполнить окончательную проверку, чтобы убедиться, что КСГ находится в центре матрицы капельке. приспосабливатьсяпо мере необходимости с 21-GUAGE иглой.
5. Перенести заполненную пластину на 37 ° С инкубатор. Это позволит укрепить полутвердый матрицу и зафиксировать DRG в заданном положении.
6. Повторите этот процесс для всех КСГ. Поместите пустой капли матрицы без DRG в качестве отрицательного контроля.
7. Добавить 4 мл среды DMEM с 10% FBS сред для каждого стеклянным дном пластины после завершения всех пластин и подвергая их 37 ° C инкубаторе в течение не менее 3 мин. Поместите пластину под небольшим углом и медленно добавить среды, таким образом, что он постепенно вступает в контакт с частями матрицы-DRG.
   Примечание: Если среда добавляется слишком быстро или энергично, матрицу и / или DRG может стать выбили.
8. Хранить анализы в 37 ° C инкубаторе в течение следующих 48 - 72 ч.
   Примечание: Периодическое рассмотрение анализов покажут круговую разрастание нейритов в направлении матрицы края (рисунок 2). Когда невриты больше, чем три четверти пути к матрице, егоУместно высевания клеток.

5. Подготовка головы и шеи клеток рака

Примечание: кроме головы и шеи клетки карциномы сквамозных клеток линии могут быть использованы в этой экспериментальной конструкции.

1. Поддержание плоскоклеточного линии клеток карциномы клеток в DMEM с 10% FBS в предпочтительных колбах или чашках для культивирования в 37 ° С инкубатор. Для подготовки клеток для экспериментов, а также засасывания все среды из культуральной колбы или блюдо и мыть его дважды PBS. Суспендирования клеток путем добавления соответствующего количества 0,025% трипсина в течение 5 мин с последующим DMEM с добавлением 10% FBS. Пипетка 4 мл клеточной и средств массовой смеси в культуральных чашках 6-мл.
   Примечание: Культуру пластина 6-мл обеспечивает более чем достаточное количество клеток, даже при менее чем 50% сплошности.
2. Expose клеточных линий ПРГШ к различным условиям за 24 ч до окрашивания и высева на анализе DRG. Повторная доза состояние после того, как клетки высевали, чтобы поддерживать последовательную environmeнт.
   Примечание: Добавить антитела, факторы роста, цитокины или других молекул к посуде клеточных культур 1 - 2 дней после рассечения мыши и имплантации DRG в матрицу.
3. Добавить люминесцентные клеточные пятна 1 ч до посева клеток (2 - 3 дня после сбора DRG и имплантации в матрицу).
   Примечание: Конкретные пятна, используемые здесь свободно проходят через клеточную мембрану; Тем не менее, после того, как взаимодействовать с внутриклеточными тиоловых групп, пятно остается внутри клетки и передается дочерним клеткам. Окрашивания значительно облегчает визуализацию в анализах. Эти временные пятна идеально подходят для этих анализов, поскольку флуоресценции присутствует в течение 2 - 3 дней, что сроки проведения этих экспериментов. Он также позволяет использование множества различных цветов и устраняет необходимость в создании флуоресцентного белка-трансфекции клеточных линий.
   1. Готовят 10 мкМ раствора красителя путем смешивания 2 мкл 10 мМ пятна запас клеток в 2 мл не содержащей сыворотки DMEMдля каждого состояния клеток. Подогреть это до 37 ° C перед добавлением к клеткам.
   2. Удалите культуральную среду внутри пластины 6-мл, оставляя прилипшие ПРГШ клетки на пластине. Добавить 2 мл фосфатного буферного раствора (PBS) и удалить 2 мл 10 мкМ клеток пятно / бессывороточной DMEM добавляли к каждой пластине
   3. Возвращение культуральную пластину 6 мл с клеточным пятном на 37 ° C инкубаторе в течение 40 мин.
   4. Через 40 минут, аспирата среду. Добавляют 2 мл PBS, а затем аспирацию его. Добавить 1 мл 0,025% трипсина к каждой пластине, и заменить их на 37 ° С инкубатор.
   5. Добавьте 2 мл DMEM с добавлением 10% FBS после 3 - 5 мин и переносят суспендированных клеток в конической трубе 15 мл. Спин клетки и ресуспендировали их в 1 мл DMEM с добавлением 10% FBS.
   6. Граф клеток с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток, а затем добавить DMEM с 10% FBS для создания конечной концентрации клеток 300000 клеток на мл.

6. Покрытие головы и NКлетки рака Eck

1. Удалите с прозрачным дном пластины с матрицей-DRG анализов из инкубатора.
   Примечание: Опять же, они уместны, когда невриты, по меньшей мере 75% пути к краю матрицы, как правило, происходит через 2 - 3 дней. Это лучше всего видно с использованием по меньшей мере, объектив 10X.
2. Аспирируйте среды внутри стеклянным дном тарелку. Полностью аспирата среды внутри стекла хорошо без удаления матрицы DRG единиц.
3. Оформи 200 мкл 300000 клеток / мл среды с использованием пипетки 200-мкл. Поместите две капли ячеек над каждым анализом матрицы-DRG. Выполните этот шаг для каждой матрицы капельке, создавая четыре повторения каждого состояния ячейки на одной пластине.
   Примечание: полусферическую форму матрицы позволяет клеткам располагаться в кольце по периферии анализа (рис 3а, 3b) На рис. Нахождение пипетку с гладкой спусковой крючок делает размещение равномерного капель намного легче.
4. Подтвердите аналогичные числа клеток и диstribution различных условий клеток при 4X микроскопии.
5. Поместите прозрачным дном листы в 37 ° C инкубаторе в течение примерно 60 мин. ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, есть только небольшой объем клеток и средств массовой информации (~ 150 мкл), анализы не высыхают до нескольких часов времени инкубатора не прошло.
6. Через 60 мин осторожно добавляют 4 мл среды DMEM с 10% FBS, вдоль боковой стенки со стеклянным дном тарелку.
   Примечание: В течение определенного периода времени, клетки частично прилипают к нижней пластине, и способ добавления среды не нарушает клетки. Различные типы клеток может занять больше или меньше времени, чтобы начать прилипать к стеклянным дном тарелку.
7. Заменить любые экзогенные препараты или факторы роста в это время, чтобы сохранить прежние уровни концентрации.
8. Возвращение анализов на 37 ° С инкубатор, за исключением того, когда они исследуют под микроскопом. Количественно результаты этого анализа с помощью микроскопического изображения. Если коротко, то рассчитывать пряди периневральным инвазиив четырех квадрантах с использованием 4X микроскопического изображения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: микроскоп с 4-кратным объективных и флуоресцентных возможностей достаточно для фото-документирующего анализов. Размер анализов прекрасно вписывается в поле объектива 4X, который подробно описан достаточно, чтобы захватить отдельные районы периневральным вторжения. Периневральная инвазия становится очевидным в течение 24 ч, а за 48 ч, целостность анализов начинает ослабевать, так как опухолевые клетки делятся по периферии матрицы и вторжению. За 48 часов, есть также существенный отлив фибробластов от DRG, который затеняет визуализацию с использованием микроскопии светлого. Поэтому желательно фото-документировать результаты с 4 - кратным микроскопом , по крайней мере в два раза в течение этого окна (например, через 24 и 48 ч после посева клеток опухоли). Помните, что эти 3-мерные анализы, и это трудно полностью изображению весь анализ. Большинство периневральная инвазия происходит в плоскости, из нижней части пластины, где Тон клетки встроены в матрицу немного выше нижней части пластины. Поскольку этот самолет находится близко к горизонтали, подавляющее большинство невриты с опухолевыми клетками захватываются в образе одноуровневой в 4 раза.

После рассечения DRG и размещение в матрице капельке, появление анализа должно походить на рисунок 1. Обратите внимание , что DRG не является идеально круглым, но по центру внутри матрицы капельке. Это позволяет разрастание нейритов в 360 градусов, как показано частично на фиг.2. Имейте в виду, что некоторые части DRG посылать невриты быстрее и в большем количестве, чем другие, как правило, соответствующие где эфферентные и афферентные нервные ветви вошли и вышли из DRG, соответственно. Учтем это и для различий в размерах между КСГ случайным металлизации ДРГ в группах по 4, а затем случайным образом назначая данную пластину каждому условию клеток.

Как было описано выше, мы высевания линии HSNCC клетки после того, как невриты продлили по меньшей мере, три четверти пути к краю матрицы, которая, как правило, наДень 3. Добавленные клетки образуют окружную кольцо вокруг матрицы (рис 3а). Впоследствии мы фотографировать анализы на 4 -й день (рис 3b) и 5 -й день (рис 3в). Линия клеток показано здесь (Фаду) демонстрирует выше среднего способность отслеживать вдоль невриты. Линия SQCCY1 клеток показано на рисунке 4, однако, показывает практически нет склонности к вторжению анализов.

При использовании новой клеточной линии, то импорт использовать несколько отрицательных элементов управления, чтобы исследовать, как этот конкретный клеточная линия ведет себя вокруг анализа. Во- первых, пластина клетки вокруг "пустой" анализа , состоящей из матрицы в одиночку (рисунок 5). Все клеточные линии, которые в нашей лаборатории исследовал активно делят вокруг матрицы, но не входят или простираться на верхней части матрицы. При чрезмерном клетки оставлены на верхней части матрицы, может быть значительный рост по всей матрице. Это подчеркивает необходимость по электроннойNsure, что, как многие клетки попадают на периферии матрицы, как это возможно, а не оставляют в покое и разделить на верхней части матрицы. Это может быть достигнуто путем осторожного постукивания по пластинам, прежде чем клетки прилипать или пипеткой небольшие количества сред непосредственно на верхней части матрицы капельке как только клетки начинают прилипать к стеклянной пластине.

Второй отрицательный контроль, в котором клетки высевают в тот же день, что КСГ помещен в матрицу, могут быть запущены. Цель этого подхода состоит в том, чтобы продемонстрировать, что это не аттракцион нейротропные, который приводит в движение клетки в DRG, а то, что присутствие невритов является обязательным. Кроме того, когда опухолевые клетки проживали по периферии матрицы в течение времени более 2-х дней, матрица край проваливается. Матрица затем начинает поднимать Офф стеклянным дном и могут быть найдены свободно плавающие в средствах массовой информации вскоре после этого. По этой причине, это протоCol описывает металлизации ПРГШ клетки после того, как невриты расширили 75% от расстояния до края матрицы.

Есть бесчисленное множество вариантов для количественной оценки результатов того, что визуально очень очевидные различия между анализами. В одном таком способе, образы анализов разделены на четыре квадранта с вертикальной и горизонтальной линии (рисунок 6). Один балл присваивается для каждого квадранта, который имеет по крайней мере одну строку ПНИ. Если ПНИ выходит за пределы 50% пути от края матрицы к DRG, затем 2 очка присваиваются вместо. Таким образом, оценка 0 - 8 пунктов могут быть назначены. Основным преимуществом этой системы является то, что анализы, которые имеют слишком много единиц PNI рассчитывать можно быстро оценить. Недостатком является то, что это не адекватно выразить степень ПНИ (т.е. квадрант с 1 нейритов с инвазией 100% от расстояния до DRG получает одинаковое количество очков (2) как Quadrant с 10 аналогичным инвазированных невриты). Сравнение Светлое и флуоресцентных изображений делает эту систему очень легко, даже со значительным оттоком фибробластами.

Пример подсчета очков показан на рисунке 6. Используя эту систему подсчета очков четыре квадранта на рисунке 3, 0 очков, 2 очка и 7 очков были назначены на панели Рисунок 3а, рис 3а и рис 3в, соответственно. Рисунок 4 получил оценку 2 пункта и 2 пункта в панели Рисунок 4а и 4б, соответственно. Данные в таблице 1 представлены результаты нескольких экспериментов с использованием клеточных линий Фаду и SQCCY1. Обратите внимание, что даже при ограниченной шкале оценок, таких как это, статистически значимых различий в средних баллов четырехквадрантном легко получены с использованием независимых выборок т-тест.

Рисунок 1. DRG-матрица анализа. Правильное размещение спинномозговых ганглиев в матрице капельке, показано с светлопольному микроскопии в 4 раза. Шкала бар представляет 1 мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2. выроста нейритов. Невритов отсутствуют на 0 -й день сразу после размещения DRG в матричном капельке (A). К 1 -й день (B), нейритов проявляется при 10X на светлопольному микроскопии. Нейритов рост продолжается на 2 -й день (C) и день 3 (D); Тем не менее, обратите внимание на вытекание фибробластов. Южная Каролинаэля столбик представляет 0,1 мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3. DRG-матрица анализа с Фаду. Голова и шея плоскоклеточный рак линии Фаду добавил периферического вокруг анализа на 3 -й день (А), как показано на зеленый флуоресцентный и светлопольному микроскопии на 4X Progressive нервного вторжения виден на 4 -й день (B) и 5 -й день (C). Шкала бар представляет 1 мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4. DRG- матрица анализа с SQCCY1. Голова и шея плоскоклеточный клеточная линия SQCCY1 добавлен 4 -й день (А), как показано на светлом поле и зеленой флуоресцентной микроскопии на 4X. Обратите внимание , что эта клеточная линия не столь искусны в периневральным вторжения как Фаду, даже 5 -й день (B). Шкала бар представляет 1 мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5. Матрица анализа с Фаду. Голова и шея плоскоклеточный клеточная линия клеток карциномы Фаду добавили вокруг матрицы капли без DRG на 3 день и светлого зеленого флуоресцентного микроскопа (4X) , указанной на 4 -й день (А). Обратите внимание , что опухолевые клетки не входят в матрицу или зарастать поверх него, даже 5 -й день (B). Шкала бар представляет 1 мм.TTP: //ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55043/55043fig5large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6. Метод четырехквадрантном для анализа Количественное. Одна точка назначается для каждого квадранта с PNI менее чем на 50% от расстояния от края матрицы к DRG. 2 балла присваивается, когда ПНИ выходит за пределы 50%. Первый пример (А) получит 5 баллов (1 балл для каждого квадранта для PNI менее чем на 50%, за исключением того, в нижнем правом углу , который имеет PNI , проход щую за 50%, где 2 выигранных очков). Второй пример (В) оценивается как 8 (ПНИ выше 50% во всех четырех квадрантах). Шкала бар представляет 1 мм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы VIEW большую версию этой фигуры.

Таблица 1. Сравнение PNI между Фаду и SQCCY1. Средняя четырехквадрантном оценки , как показано на рисунке 6 между линиями клеток Фаду и SQCCY1 через 24 часа (день 4) и 48 ч (день 5) после того, как клетки высевали вокруг анализа DRG-матрицы. Сравнения производятся с использованием независимого СэмуPLE Т-тест и представлен со стандартным отклонением (SD) и P-значений.

Критические шаги в рамках Протокола

Наиболее важные шаги в рамках этого протокола являются точное рассечение и извлечение спинальных ганглиях. Правильное перерезка позвоночника и срединный-продольного деления на две Hemi-шипов имеют решающее значение для получения большого количества DRG. Во время вскрытия отдельных КСГ, ганглий никогда не следует обращаться непосредственно, а окружающие фасции должны быть схвачена с микроскопическими щипцов. Несоблюдение этого требования приведет к размозжение в DRG, который, вероятно, основной причиной отказа для аксонов. Это гораздо лучше, чтобы под-подрезать окружающие нервные ткани при рассечении, чем риск чрезмерной обработки DRG и не получая никакого роста аксонов в анализе.

Модификации и устранение неисправностей

Экспериментальный протокол, как описано выше, отражает оптимальный встретилhodology создана из большого числа процедурных корректировок, сделанных в течение нескольких лет. Включенный в список непосредственно под соответствующим шагом в секции протокола является количество записей и подводных камней, полученных в результате опыта авторов при использовании этой методики. С учетом числа этапов, на самом деле есть много модификаций, которые могут быть сделаны к этому протоколу будущими исследователями. Как опыт работы с этими изменениями растет, ожидается, что дополнительные средства устранения неполадок будут разработаны в соответствии с предпочтениями следственной группы.

Ограничения техники

Существуют три основных ограничения этого метода. Во-первых, очень тонкие невриты используются в качестве суррогата большого нервного вторжения, который является то, что патологи наблюдать в опухолевых образцах. Не известно , что роль невриты, в отличие от нейронов, в естественных условиях , так как определение perineuriteвторжение за пределы возможностей обычной гистологической экзамена. Во-вторых, периневральная вторжение является формой вторжения мягких тканей, которые могут не просто привлекать опухолевых клеток и соседний нейрон, как моделируется в этом анализе. В качестве таких экзогенных факторов, свойственных экстракорпорального опухоли среды в отсутствуют в данном анализе. И, наконец, период времени, в течение которого ПНИ может изучаться ограничена примерно 48 ч из-за сочетания фибробластами оттоком и потере целостности матрицы. Таким образом, клеточные линии, которые являются эффективными при нейронного инвазии, но медленны разделительные и / или вторгаются будут пропущены и предположительно не быть специалистами в ПНИ.

Значимость техники в отношении существующих / альтернативных методов

Насколько нам известно, это единственная модель в пробирке имеющихся в настоящее время для изучения PNI в ПРГШ. Учитывая частоту, с которой ПНИ происходит в ПРГШ и ограниченные знания о механизмах, которыеВ настоящее время существует, этот метод является предпочтительным по нескольким причинам. Во-первых, он имеет очень высокий уровень успеха и превосходную воспроизводимость. Общее время эксперимента также относительно короткий по сравнению с аналогичными протоколами ^12,17-19. И, наконец, с большим количеством анализов, которые могут быть получены из одной мыши, много условий могут быть проверены с научной точки зрения-соответствующих повторностях. Сочетание этих факторов позволяет быструю оценку многих различных условий с последовательными результатами.

В то же время, высокое качество анализа позволяет более подробно изучить взаимодействие между опухолевыми клетками и невритов. Использование живых клеток позволяет удорожанием аксонов процесса выроста и вторжения клеток HSNCC в покадровой видео форме. Добавление флуоресцентно-окрашенных клеток создает очень четкую дифференциацию между раковыми клетками и справочных материалов, таких как фибробласты и плотной аксонов НУtgrowth (который автоматически флуоресцирует красный). Является ли следующий этот протокол или те , которые описаны другими, это общий план эксперимента находится в относительном младенчестве, и есть далеко от золотого стандарта для экстракорпоральное изучения ПНИ. По этим причинам, тем больше подходит к этому анализа, которые подробно описаны, тем больше возможностей для совместной разработки идеальной методологии.

Будущие приложения или направления после освоения этой техники

Подобно тому, как существует несколько различных подходов к настройке анализов, существует несколько подходов к измерению результатов. В приведенном выше тексте, был представлен один метод для быстрой количественной оценки степени периневральным вторжения в каждом анализе. Это идеальный вариант для скрининга воздействия многочисленных различных путей на ПНИ, особенно учитывая, что можно выделить 32 - 40 ДРГ на мышь. Есть целый ряд передовых методов визуализации для оценки PNI,в том числе количество флуоресценции в данной географической области, расстояние и скорость инвазии клеток, а также необработанный количество клеток в ходе анализа. После того, как динамическая часть эксперимента завершается, клетки в анализе, и / или супернатант также могут быть собраны для дальнейшего молекулярного анализа.

Эта экспериментальная методика дает возможность пролить свет механизмы, вовлеченные в ПНИ из ПРГШ и других видов рака. Эти знания могут стимулировать разработку терапевтических целевых путей движения ПНИ, которые в настоящее время отсутствуют в ПРГШ. Конкретная нацеливание ПНИ, когда идентифицированы как неблагоприятные патологического признака потенциально может исключить необходимость в неспецифических вспомогательной терапии, таких как лучевая терапия и химиотерапия, которые в настоящее время используется.

The authors have no competing financial interests.

This work was supported in whole by funding from the NIH through the R21 grant, "Mechanisms of Perineural Invasion in Head and Neck Cancer" and the NCI T32 training grant, "Post-Doctoral Research Training in Head and Neck Oncology (2T32CA060397-21)." Thank you to Richard Steiman, MD, PhD and lab staff.