Ein Modell für Perineurale Invasion in Kopf- und Hals-Plattenepithelkarzinom

Perineural invasion (PNI) is a common feature of head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC), conferring lower survival rates. Its mechanisms are poorly understood. Utilizing neurites generated from murine dorsal root ganglia confined to a semisolid matrix, the pathways involved in the PNI of HNSCC cell lines can be investigated.

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, radiation, and chemotherapy, locoregional recurrences and distant metastases occur at higher rates, and overall survival is decreased by 40% compared to HNSCC without PNI. In vitro studies of the pathways involved in HNSCC PNI have historically been challenging given the lack of a consistent, reproducible assay. Described here is the adaptation of the dorsal root ganglion (DRG) assay for the examination of PNI in HNSCC. In this model, DRG are harvested from the spinal column of a sacrificed nude mouse and placed within a semisolid matrix. Over the subsequent days, neurites are generated and grow in a radial pattern from the cell bodies of the DRG. HNSCC cell lines are then placed peripherally around the matrix and invade preferentially along the neurites toward the DRG. This method allows for rapid evaluation of multiple treatment conditions, with very high assay success rates and reproducibility.

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is the sixth most common cancer in the US, with 10,000 deaths per year nationally and 300,000 deaths per year worldwide¹. The overall prognosis for HNSCC has remained unchanged at 50% for the past several decades. Perineural invasion (PNI) is one of the most prominent pathological features that portend a poor prognosis in patients with HNSCC. Unfortunately, PNI is a frequent occurrence in HNSCC and can be found in up to 40% of HNSCC patients^2,3.

PNI is the process by which malignant cells track along nerves to adjacent tissues, allowing for higher rates of local and distant spread. Accordingly, PNI-positive HNSCC tumors have higher rates of locoregional recurrences and distant metastases, resulting in lower overall survival compared to HNSCC patients without PNI^4-8.

Although the treatment of patients with PNI is typically maximized by employing surgery, radiation, and chemotherapy, the overall survival rates of these patients are still decreased by up to 40% compared to patients without PNI^9-11. Thus, it is clear that the current treatment modalities for HNSCC are ineffective in improving the adverse prognosis associated with PNI. The approach of developing targeted therapy against PNI in HNSCC has been hindered by the poor understanding of the factors that regulate this process. This is, in part, a consequence of the lack of a consistent in vitro model for the study of PNI in HNSCC.

In recent years, several groups have been utilizing an in vitro model for studying PNI in predominantly pancreatic and prostate cancers^12-19. This model uses the neurites generated from dorsal root ganglia isolated from mice or rats as a surrogate for large-nerve invasion. The dorsal root ganglia are fixed in a factor-depleted semisolid matrix, which is a solubilized basement membrane protein mixture secreted by Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells. This matrix allows for the outgrowth of the neurites and the tracking of single cancer cells along these neurites. Described here is the adaption of this model for the examination of PNI in HNSCC.

1. Herstellung von Kulturmedium und Geschirr (10 min)

1. Füge 100 & mgr; l Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) in die Vertiefungen einer 96-Well-V-Bodenplatte.
2. Entfernen Sie eine pre-aliquotiert-Fläschchen von etwa 100 & mgr; l halbfest Matrix aus dem 20 ° C Gefrierschrank und legen Sie sie direkt auf dem Eis.
   HINWEIS: Führen Sie diese vor dem Dorsalwurzelganglion (DRG) Ernte, weil die halbfeste Matrix etwa 30 min nimmt flüssigen Zustand auf Eis zu erreichen, die für die nachfolgenden Schritte erforderlich ist. Wird der halbfest Matrix auf Eis zu allen Zeiten zu halten, wird eine schlechte Qualität der Matrix Tröpfchen führen.
3. Label-Glasbodenkulturen Platten mit dauerhafter Tinte, eine eindeutige Kennzeichnung in jeder der vier Ecken auf der Unterseite der Platte. Legen Sie die Platten der rechten Seite nach oben auf Eis, um die Plattenoberfläche zu kühlen.
   HINWEIS: Jede Maus Erträge 32 - 40 DRG, so beschriften von 1 bis 40. Es ist nicht notwendig pi vorab ChillHaustier-Tipps, wie gekühlt Tipps, um den Verlauf der Platzierung der Matrix Tröpfchen aufwärmen wird, möglicherweise Unterschiede in der Matrix Konsistenz einzuführen.

2. Dissection von Murine DRG (45 min)

1. Euthanize eine athymische Nacktmaus gemäß spezifischen Laborprotokolle, wie beispielsweise durch die Verwendung eines CO ₂ Kammer und eine Thorakotomie.
2. Stellen Sie die Dissektion Bereich und Mikroskop auf. Verwenden Sie die saubere, sterilisiert und flache Unterseite der Styroporbehältern für 15- oder 50-ml konischen Röhrchen.
   HINWEIS: Darüber hinaus sind sie für die Verwendung als Sezieren Oberfläche geeignet, da sie kostengünstig sind, Einweg und ermöglichen eine Fixierung der Wirbelsäule unter Verwendung von Stiften oder Nadeln. Verwenden Sie nur sterilisierten Instrumente und Nadeln.
3. entlang der Wirbelsäule von der Wurzel des Schwanzes auf den Kopf der Maus mit einem Paar von geraden oder gebogenen feinen Schere Unter natürlichen Vision, einen Längsschnitt machen.
4. Verwenden Sie die gleiche Schere quer Kluft unter dem sacral Wirbelsäule. Präparieren Sie beide Seiten der Wirbelsäule den ganzen Weg bis zur Schädelbasis mit der Schere. An dieser Stelle dafür sorgen, dass die Halswirbelsäule kranial so weit wie möglich mit einer Schere durchtrennt wird.
5. Beobachten zervikalen Ende der Wirbelsäule unter dem Operationsmikroskop bei niedriger Leistung. Der weiße Rückenmark ist offensichtlich in der Mitte eines knöchernen Ring, der durch variable Mengen von paraspinalen Muskeln und Weichgewebe umgeben ist.
6. Teilen Sie die dorsale oder überlegen Aspekt der ersten 2 - 3 Wirbelkörper mit mikroskopisch kleinen Feder Schere. Mit Hilfe der Federwirkung der Schere, öffnen Sie diese anfängliche Knochen geschnitten, um sicherzustellen, dass die Wirbelkörper Dissektion an der Mittellinie aufgetreten. Weiterhin in kleinen Schritten in Richtung der sakralen Wirbelsäule und dann die Wirbelsäule bisect durch die identische Einschnitte auf der ventralen oder inferior Aspekt der Wirbelkörper vervollständigt.
   HINWEIS: Wenn der Mittellinie Präparation der knöchernen Wirbelsäule, um sicherzustellen, in einer niedrigeren DRG Ausbeute führen.
7. Bei this Punkt wird die Wirbelsäule in zwei Hälften geteilt. Legen Sie ein Hemi-Wirbelsäule zur Seite, mit dem Rückenmark an Ort und Stelle und nach unten auf eine sterile Platte.
   HINWEIS: das Rückenmark an Ort und Stelle lassen, wird die DRGs nicht austrocknen, da die DRGs tief in das Rückenmark sind.
8. Befestigen jedes Ende des anderen hemi-spine mit zwei 18-gauge-Nadeln auf der Polystyrol Sezieren Plattform. Beginnend am zervikalen Ende (was offensichtlich ist, weil die Wirbelsäule enger ist, sind die DRG näher aneinander, und es gibt rib Einfügungen), sanft in das Rückenmark abziehen von etwa 4 vertebralen Ebenen.
9. Beachten Sie die sensorischen Nerven (in der Regel zwei), die die DRG. In dem Bereich, wo die Nerven an den DRG einsetzen, greifen Sie sanft die umgebende Faszie mit mikroskopisch kleinen Zange. Präparieren und schneiden Sie diese Faszie und andere Nervengewebe mit den mikroskopisch kleinen Feder Schere, um die DRG freizugeben. Sanfte Rückzug wird die DRG aus seiner Position innerhalb der knöchernen Wirbelsäule bringen.
   HINWEIS: Eine Erhöhung derMikroskop Leistung bei diesem Schritt ist von Vorteil. Quetschverletzung zum DRG wird signifikant das Wachstum von Neuriten begrenzen. Dies wird vermieden, indem man nie direkt auf die DRG ergreifend, sondern durch die umgebende Faszie zu erfassen.
10. Schneiden Sie den peripheren Nerven (der DRG hat in der Regel einen peripheren Nerven, die tief in Bezug auf die Sezieren Ansicht ist) mit den mikroskopisch kleinen Feder Schere, um die DRG zu lösen.
    HINWEIS: Am einfachsten ist es, um festzustellen, wo die Nervenenden und die DRG beginnt, während auf Spannung, um so nah wie möglich an der DRG diesen Schnitt zu machen an dieser Stelle ideal ist. Sobald dieser distale Zweig geschnitten wird, werden die proximalen Zweige als auch getrimmt.
11. Schneiden Sie die DRG, jede streunNervenFasern oder Faszien Attachments mit den mikroskopisch kleinen Feder Schere. Nach ausreichender Isolierung, legen Sie die DRG in die Raumtemperaturmedium innerhalb der 96-Well-V-Bodenplatte.
    HINWEIS: Platzieren eines dunklen Hintergrund unter die Platte die sub-mm weiß DRGs erleichtert die Visualisierung. Platz nur eine DRG in each gut; Auf diese Weise können sie leichter in den nachfolgenden Schritten berücksichtigt werden.
12. Wiederholen Sie diesen Vorgang den ganzen Weg nach unten ein Hemi-Wirbelsäule und dann die andere. Jede Seite liefert 16-20 DRGs in Höhe von insgesamt 32 - 40.
    HINWEIS: Wenn es weniger DRGs als dies sind, ist die Präparation der Wirbelsäule muss durchgeführt weiter kranial und / oder kaudal werden. Die DRGs werden immer weniger gut definiert als ein kaudal geht.

3. Herstellung von halbfesten Matrix-Tröpfchen (<1 min pro Platte)

1. Entfernen Sie ein Glas gut Bodenplatte aus Eis und legen Sie es auf einem Eisblock unter dem Operationsmikroskop. Sicherstellen, dass das Aliquot von Matrix bleibt auf Eis zu allen Zeiten.
2. Legen Sie eine 1,5 & mgr; l Tröpfchen der Matrix in jeder der vier Ecken der Glasbodenplatte mit einer 2 & mgr; l oder 10 & mgr; l micropipetter, eine Entfernung zumindest so groß wie die Tröpfchen sich von der Kante des Glases gut bleibt.
   1. Setzen Sie die Spitze der Pipette direkt aufdas Glas in einem 45-Grad-Winkel. Pipettieren Sie langsam die Matrix. Langsam bewegen aus dem Glasboden entfernt, nachdem die Matrix auf der Platte in Eingriff ist.
      HINWEIS: Die Oberflächenspannung zwischen der Matrix und Glas eine perfekte Hemisphäre jedes Mal schaffen sollte.
   2. Pipettieren stoppen, kurz bevor die Spitze leer ist, weil eine unbeabsichtigte Injektion von Luft in die Matrix Tröpfchens den Durchmesser des Tröpfchens Matrix macht viel größer und ist schwer zu entfernen.
      HINWEIS: eine zweite Hand Mit dem Pipettieren Hand zu stabilisieren mehr und genauere Platzierung.

4. Insertion von DRG in halbharter Matrix Droplets (<2 min pro Platte)

1. Lassen Sie die Platte mit den Matrixtröpfchen kurz bei Raumtemperatur (~ 1 min). Dies versteift die Matrix leicht, wodurch es einfacher für die präzise Platzierung des DRG machen.
2. Scoop (nicht begreifen) der DRG sanft mit geschlossenen mikroskopische Pinzette in der linken Hand. Wieder ein dunkler Hintergrund, vor dem kleinen, weißenDRG erleichtert die Visualisierung. Übertragen die DRG auf die Spitze einer 21-Gauge-Nadel in der rechten Hand. Dieser Transfer wird Rest Medien an der Zange lassen.
3. Gehen Sie vorsichtig mit der DRG in der Mitte der Matrix Tröpfchen die 21-Gauge - Nadel (Abbildung 1). Die meiste Zeit wird der DRG leicht in der Matrix lösen und kann dann mittig mit der Nadel positioniert werden.
   1. Wenn die DRG an der Nadel klebt, verwenden Sie die mikroskopisch kleinen Zange die DRG abstoßen der Nadel und in die Matrix Tröpfchen. Wick entfernt überschüssige Medien aus den mikroskopischen Zange mit einem Labor wischen.
      HINWEIS: wird der Durchmesser, Volumen und Konsistenz des Assays verändern Medien auf die Matrix eingeführt wird. Ein Eisblock mit Farbe oder farbiger Schrift liefert Hintergrund-Kontrast, die Visualisierung dieser heiklen Prozess erleichtert.
4. Nachdem die Platte alle vier DRGs hat, abschließende Inspektion durchführen, um sicherzustellen, dass die DRG in der Mitte der Matrix Tröpfchen ist. Nehmen Sie die Einstellungnach Bedarf mit der Nadel 21-thon.
5. Übertragen Sie die fertige Platte auf einem 37 ° C Inkubator. Dadurch wird die halbfeste Matrix und fixieren Sie die DRG in Position zu festigen.
6. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle der DRGs. Legen Sie leere Matrix Tröpfchen ohne DRG als negative Kontrolle.
7. In 4 ml DMEM mit 10% FBS Medien auf jede Glasbodenplatte nach dem alle Platten zu vervollständigen und sie auf die 37 ° C-Inkubator für mindestens 3 min auszusetzen. Die Platte wird in einem leichten Winkel und fügen Sie langsam das Medium, so dass sie nach und nach in Kontakt mit den Matrix-DRG-Einheiten.
   HINWEIS: Wenn das Medium zu schnell hinzugefügt oder kräftig, die Matrix und / oder DRG kann sich lösen.
8. Lagern Sie die Tests in dem 37 ° C Inkubator für die nächsten 48 bis 72 h.
   HINWEIS: Eine regelmäßige Prüfung der Assays zeigen Umfangs Auswuchs von Neuriten in Richtung der Matrix Kante (Abbildung 2). Wenn die Neuriten größer als drei Viertel des Weges zu der Matrix es,geeignet ist, die Zellen zu plattieren.

5. Herstellung des Kopf-Hals-Krebszellen

HINWEIS: Die Zelllinien außer Kopf und Hals Plattenepithel-Zellen Zellkarzinom kann in diesem experimentellen Design verwendet werden.

1. Pflegen Plattenepithelkarzinom-Zelllinien in DMEM mit 10% FBS in bevorzugten Kolben oder Kulturschalen in einem 37 ° C Inkubator. Um Zellen für Experimente, Absaugen alle das Medium von der Kulturflasche oder einen Teller und waschen Sie es zweimal mit PBS vorzubereiten. Suspendieren der Zellen durch eine entsprechende Menge von 0,025% Trypsin für 5 min Zugabe, gefolgt von DMEM mit 10% FBS. Pipette 4 ml der Zell und Mediengemisch in 6-ml-Kulturschalen.
   HINWEIS: Ein 6-ml-Kulturplatte mehr als genug Zellen liefert, auch wenn weniger als 50% konfluent.
2. Setzen Sie die HNSCC Zelllinien zu unterschiedlichen Bedingungen 24 h vor dem Färben und Beschichten auf dem DRG-Test. Re-Dosis den Zustand, wenn die Zellen plattiert sind eine konsistente environme zu haltennt.
   HINWEIS: In-Antikörper, Wachstumsfaktoren, Zytokine oder andere Moleküle an die Zellkulturschalen 1 bis 2 Tage nach der Maus Dissektion und Implantation der DRG in die Matrix.
3. Hinzufügen fluoreszierenden Zell Flecken 1 h vor dem Ausplattieren der Zellen (2 - 3 Tage nach der Ernte und DRG Implantation in der Matrix).
   HINWEIS: Die besonderen Flecken hier verwendeten frei durch die Zellmembran passieren; Nachdem jedoch mit intrazellulären Thiolgruppen reagieren, bleibt der Fleck innerhalb der Zelle und wird an Tochterzellen weitergegeben. Die Färbung erleichtert die Visualisierung innerhalb der Assays. Diese temporären Flecken sind ideal für diese Tests, da die Fluoreszenz für 2 vorhanden ist - vor 3 Tagen, die der zeitliche Rahmen dieser Experimente ist. Es ermöglicht auch die Verwendung von vielen verschiedenen Farben und vermeidet die Notwendigkeit für fluoreszierendes Protein-transfizierten Zelllinien zu schaffen.
   1. Herstellung von 10 & mgr; M Farbstofflösung durch Mischen von 2 & mgr; l von 10 mM Stammzell Flecken in 2 ml serumfreiem DMEMfür jede Zelle Zustand. Erwärmen diese auf 37 ° C, bevor sie zu den Zellen hinzugefügt wird.
   2. Entfernen Sie das Kulturmedium innerhalb der 6-ml-Platte, die anhaftenden HNSCC Zellen auf der Platte zu verlassen. 2 mL Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) und entfernen 2 ml der 10 uM Zell Fleck / serumfreies DMEM hinzugefügt zu jeder Platte
   3. Bringen Sie die 6-ml-Kulturplatte mit der Zelle Fleck auf dem 37 ° C Inkubator für 40 min.
   4. Nach 40 min absaugen Medium. In 2 ml PBS und dann absaugen. 1 ml 0,025% Trypsin zu jeder Platte und ersetzen Sie sie in der 37 ° C-Inkubator.
   5. In 2 ml DMEM mit 10% FBS nach 3-5 min und übertragen Sie die suspendierten Zellen in ein 15-ml konischen Röhrchen. Dreh die Zellen und resuspendiert sie in 1 ml DMEM mit 10% FBS.
   6. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer oder automatisierten Zellzähler, und fügen Sie dann DMEM mit 10% FBS eine endgültige Zellkonzentration von 300.000 Zellen pro ml zu erstellen.

6. Galvanokopfes und Neck Krebszellen

1. Entfernen Sie die Glasbodenplatten mit den Matrix-DRG-Assays aus dem Inkubator.
   HINWEIS: Auch hier sind sie geeignet, wenn Neuriten sind mindestens 75% der an dem Rand der Matrix, die nach 2 tritt in der Regel - 3 Tage. Dies wird am besten gesehen zumindest ein 10X-Objektiv verwendet wird.
2. Saugen Sie das Medium innerhalb der Glasbodenplatte. aspirieren vollständig das Medium innerhalb des Glases gut, ohne dass die Matrix-DRG-Einheiten zu entfernen.
3. Zeichnen Sie bis zu 200 & mgr; l der 300.000 Zellen / ml Medium, das eine 200-ul-Pipette. Legen Sie zwei Tropfen der Zellen über jede Matrix-DRG-Test. Führen Sie diesen Schritt für jede Matrix Tröpfchen, wodurch vier Wiederholungen jeder Zelle Zustand auf einer Platte.
   HINWEIS: Die hemisphärische Form der Matrix können die Zellen in einem Ring entlang dem Umfang des Assays (3a, 3b) zu regeln. Die Suche nach einer Pipette mit einem glatten Auslöser macht die Platzierung der Uniform fällt viel leichter.
4. Bestätigen Sie ähnliche Zellzahlen und Distribution der verschiedenen Zell Bedingungen, unter 4X Mikroskopie.
5. Legen Sie die Glasbodenplatten in den 37 ° C-Inkubator für etwa 60 min. Hinweis: Obwohl es nur ein kleines Volumen von Zellen und Medien (~ 150 & mgr; l) ist, die Tests nicht austrocknen, bis mehrere Stunden Inkubator Zeit vergangen sind.
6. Nach 60 min, fügen Sie vorsichtig 4 ml DMEM mit 10% FBS entlang der Seitenwand der Glasbodenplatte.
   HINWEIS: Über einen Zeitraum haften die Zellen teilweise an dem Plattenboden und die Methode der Zugabe des Mediums der Zellen nicht stören. Verschiedene Zelltypen machen mehr oder weniger Zeit in Anspruch nehmen zu beginnen, um die Glasbodenplatte zu kleben.
7. Ersetzen Sie alle exogenen Drogen oder Wachstumsfaktoren zu diesem Zeitpunkt die bisherigen Konzentration aufrechtzuerhalten.
8. Bringen Sie die Tests auf die 37 ° C-Inkubator, außer wenn sie mikroskopisch untersucht werden. Quantifizieren Sie die Ergebnisse dieses Tests durch mikroskopische Bildgebung. Kurz gesagt, die Stränge von perineuralen Invasion zählen mitin vier Quadranten mit einem 4X mikroskopischen Bild.
   HINWEIS: Ein Mikroskop mit einem 4-fach Objektiv und Fluoreszenz-Fähigkeiten ist ausreichend für die Foto-Dokumentation der Tests. Die Größe der Assays passt gut im Bereich eines 4X Ziel, das detailliert genug ist, um die einzelnen Bereiche der perineural Invasion zu erfassen. Perineuralen invasion wird innerhalb von 24 h offensichtlich, aber über 48 h beginnt die Integrität der Assays zu schwächen, da die Tumorzellen entlang der Peripherie der Matrix unterteilen und einzufallen. Darüber hinaus 48 h gibt es auch erhebliche Abfluss von Fibroblasten aus der DRG, die Visualisierung mit Hellfeldmikroskopie verschleiert. Daher ist es ratsam, Foto-Dokument die Ergebnisse mit 4X - Mikroskopie mindestens zweimal in diesem Fenster ( zum Beispiel bei 24 und 48 Stunden nach der Tumorzellen Plating). Denken Sie, dass diese 3-dimensionale Assays sind, und es ist der gesamte Test vollständig Bild schwierig. Die meisten perineuralen Invasion tritt in einer Ebene von der Unterseite der Platte, wobei ter Zellen in der Matrix etwas oberhalb der Unterseite der Platte eingebettet. Da diese Ebene der Nähe von horizontal ist, sind die überwiegende Mehrheit der Neuriten mit Tumorzellen in einem Single-Level-Bild bei 4X erfasst.

Nach der Präparation des DRG und die Platzierung innerhalb der Matrix Tröpfchens, sollte das Aussehen des Assays Abbildung 1. Note ähneln , dass der DRG nicht perfekt rund ist, aber es ist innerhalb der Matrix Tröpfchens zentriert. Dies ermöglicht das Auswachsen von Neuriten in 360 Grad, 2 teilweise dargestellt ist . Beachten Sie, dass bestimmte Teile des DRG schneller Neuriten aussenden und in größerer Zahl als andere, in der Regel entsprechend, wo die abführenden und zuführenden Nervenäste betreten und verlassen die DRG sind. Wir machen dies und Größenunterschiede zwischen DRGs durch Zufall die DRGs in Gruppen von 4 Plattierung und dann zu jeder Zelle Zustand eine gegebene Platte zufällig zugewiesen wird.

Wie oben beschrieben, plättchen wir die Linien HSNCC Zelle, sobald die Neuriten an den Rand der Matrix mindestens ¾ der Weise erweitert, die in der Regel eingeschaltet istTag 3. Die zusätzlichen Zellen bilden einen umlaufenden Ring um die Matrix (Abbildung 3a). Wir fotografieren anschließend die Tests am Tag 4 (3b) und Tag 5 (Abbildung 3c). Die Zelllinie hier gezeigt (FaDu) zeigt eine überdurchschnittliche Fähigkeit entlang Neuriten zu verfolgen. Die SQCCY1 Zelllinie in 4 gezeigt ist , zeigt jedoch wenig bis gar keine Neigung , die Tests zu erobern.

Wenn Sie eine neue Zelllinie verwendet, ist es importieren mehrere negative Kontrollen zu verwenden, um den Test zu untersuchen, wie diese bestimmte Zelllinie verhält. Zuerst Platte Zellen um einen "leeren" Test der Matrix , bestehend allein (Abbildung 5). Alle Zelllinien, die unserem Labor aktiv teilen um die Matrix untersucht hat, aber nicht betreten oder die Oberseite der Matrix erstrecken. Wenn übermßige Zellen auf der Matrix verbleiben, kann es ein signifikantes Wachstum über der Matrix. Dies unterstreicht die Notwendigkeit zu eNsure die so viele Zellen an der Peripherie der Matrix wie möglich fallen, anstatt gelassen wird oben auf der Matrix ruhen und dividieren. Dies kann durch leichtes Klopfen auf den Platten durchgeführt werden, bevor die Zellen anhaften oder durch Pipettieren von kleinen Mengen an Medien direkt auf der Oberseite der Tröpfchenmatrix, wenn die Zellen auf die Glasplatte begonnen haben, zu haften.

Eine zweite negative Kontrolle, wobei die Zellen am selben Tag plattiert sind, dass die DRG in der Matrix platziert ist, können ausgeführt werden. Das Ziel dieses Ansatzes ist es zu zeigen, dass es keine neurotropen Attraktion ist, dass die Zellen an die DRG antreibt, sondern vielmehr, dass die Anwesenheit der Neuriten ist obligatorisch. Darüber hinaus, wenn die Tumorzellen entlang der Peripherie der Matrix für mehr als 2 Tage gewohnt haben, wird die Matrix Kante undeutlich. Die Matrix beginnt dann aus dem Glasboden zu heben von und kann kurz darauf freischwebenden in den Medien zu finden. Aus diesem Grund ist diese protocol beschreibt Plattieren der HNSCC Zellen einmal die Neuriten 75% des Abstands zum Rand der Matrix erweitert.

Es gibt unzählige Möglichkeiten zur Quantifizierung der Ergebnisse von dem, was optisch sehr offensichtlichen Unterschiede zwischen Assays. Bei einem solchen Verfahren werden die Bilder der Assays in vier Quadranten mit einer vertikalen und einer horizontalen Linie (6) unterteilt. Ein Punkt wird für jeden Quadranten zugeordnet, die mindestens eine Reihe von PNI aufweist. Wenn der PNI über 50% des Weges von der Kante der Matrix auf den DRG erstreckt, dann 2 Punkte anstelle zugeordnet. Auf diese Weise wird ein Wert von 0 - können 8 Punkte vergeben werden. Der große Vorteil dieses Systems ist, dass Tests, die zu viele PNI Einheiten haben zu zählen schnell beurteilt werden. Nachteilig ist , dass es nicht angemessen , den Grad der PNI exprimieren (dh einem Quadranten mit 1 Neuriten mit invasion 100% des Abstands zum DRG erhält die gleiche Punktzahl (2) als quadrant mit 10 ähnlich fallenen Neuriten). Vergleich der Hellfeld- und Fluoreszenzbilder macht dieses System sehr einfach, auch mit erheblichen Fibroblasten Ausströmen.

Proben scoring ist in 6 gezeigt. Mit diesem Vier-Quadranten - Scoring - System für 3, 0 Punkte, 2 Punkte und 7 Punkte wurden für Platten 3a, 3a zugeordnet und 3c sind. Abbildung 4 erhielt eine Punktzahl von 2 Punkten und 2 Punkte in Platten 4a und 4b sind. Die Daten in Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse von mehreren Experimenten , die die Zelllinien FaDu und SQCCY1 verwenden. Man beachte, dass auch bei einer begrenzten Notenskala wie dieser statistisch signifikanten Unterschiede in der mittleren Vierquadrantenwerte werden unter Verwendung der unabhängigen Proben t-Test leicht erhalten.

Abbildung 1. DRG-Matrix - Assay. Die korrekte Platzierung des Dorsalwurzelganglion innerhalb der Matrix Tröpfchen, mit Hellfeldmikroskopie bei 4X gezeigt. Maßstabsbalken entspricht 1 mm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2. Auswachsen von Neuriten. Neuriten sind abwesend am Tag 0 unmittelbar nach der DRG in der Matrix Tröpfchen (A) platzieren. Am Tag 1 (B) ist das Neuritenwachstum offensichtlich bei 10X auf Hellfeldmikroskopie. Neuriten Wachstum setzt sich fort am Tag 2 (C) und Tag 3 (D); Beachten Sie jedoch die Ausströmen der Fibroblasten. scAle-Bar steht für 0,1 mm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3. DRG-Matrix - Assay mit FaDu. Kopf und Hals Plattenepithelkarzinome Linie FaDu hinzugefügt peripher um einen Assay am Tag 3 (A), in grün fluoreszierendes und Hellfeldmikroskopie bei 4X Progressive neuronalen Invasion am Tag gesehen gezeigt 4 (B) und Tag 5 (C). Maßstabsbalken entspricht 1 mm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4. DRG- Matrix-Assay mit SQCCY1. Kopf und Hals - Plattenepithelkarzinom - Zelllinie SQCCY1 hinzugefügt am Tag 4 (A), gezeigt in Hell- und grüne Fluoreszenz - Mikroskopie bei 4X. Beachten Sie, dass diese Zelllinie bei perineuralen Invasion als FaDu, auch von Tag 5 (B) nicht so geübt ist. Maßstabsbalken entspricht 1 mm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 5. Matrix - Assay mit FaDu. Kopf und Hals Plattenepithel-Karzinom - Zelllinie FaDu hinzugefügt um eine Matrix Tröpfchen ohne DRG am 3. Tag Hell- und grüne Fluoreszenz - Mikroskopie (4X) gezeigt am Tag 4 (A). Beachten Sie, dass die Tumorzellen nicht die Matrix eindringen oder wachsen über die Spitze davon, auch von Tag 5 (B). Maßstabsbalken entspricht 1 mm.ttp: //ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55043/55043fig5large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 6. Vier-Quadranten - Verfahren für einen Assay Quantifizierung. Ein Punkt wird für jeden Quadranten mit PNI weniger als 50% des Abstandes vom Rand der Matrix zu dem DRG zugeordnet. 2 Punkte zugewiesen werden, wenn die PNI über 50% erstreckt. Das erste Beispiel (A) würde (für jeden Quadranten für einen PNI weniger als 50%, mit Ausnahme der unteren rechten Ecke, 1 Punkt , die über 50% eine PNI erstreckt hat, wo zwei Punkte erzielt werden) eine Punktzahl von 5 erhalten. Das zweite Beispiel (B) als 8 (eine PNI über 50% in allen vier Quadranten) erzielt. Maßstabsbalken entspricht 1 mm. Bitte klicken Sie hier , um die vIEW eine größere Version dieser Figur.

Tabelle 1. Vergleich der PNI Zwischen FaDu und SQCCY1. Bedeuten Vierquadranten - Scores wie in Figur 6 zwischen den Zelllinien FaDu und SQCCY1 bei 24 Stunden (Tag 4) und 48 Stunden (Tag 5) , nachdem die Zellen um die DRG-matrix - Assay plattiert gezeigt. Vergleiche werden mit dem unabhängigen sam gemachtB. t-Test und mit der Standardabweichung (SD) und P-Werte dargestellt.

Kritische Schritte im Rahmen des Protokolls

Die wichtigsten Schritte in diesem Protokoll sind die genaue Präparation und Extraktion der Dorsalwurzelganglien. Proper transection der Wirbelsäule und einer Mittellinie-Längsunterteilung in zwei hemi-Stacheln sind kritisch für den Erhalt einer großen Anzahl von DRG. Während der Präparation von Einzel DRGs sollte das Ganglion nie direkt gehandhabt werden, sondern die umgebende Faszie sollten mit den mikroskopischen Zange gegriffen werden. Gelingt dies nicht, wird in einem Quetschverletzungen der DRG zur Folge haben, die wahrscheinlich die Hauptursache des Scheiterns für das Neuritenwachstum ist. Es ist viel besser zu unter trimmen die umliegenden Nervengewebe bei der Präparation als Risikoüber Umgang mit der DRG und in dem Test kein Neuritenwachstum zu erhalten.

Technische Änderungen und Fehlerbehebung

Das experimentelle Protokoll wie oben beschrieben, spiegelt die optimal erfüllthodology aus einer großen Anzahl von Verfahrensanpassungen über mehrere Jahre etabliert. direkt unter dem entsprechenden Schritt in der Protokoll-Abschnitt aufgelistet wird eine Reihe von Notizen und Fallen, die aus den Erfahrungen der Autoren führte, wenn mit dieser Methode. Da die Anzahl der Schritte beteiligt sind, gibt es in der Tat viele Modifikationen, die durch zukünftige Forscher diesem Protokoll gemacht werden kann. Wie die Erfahrung mit diesen Modifikationen wächst, wird erwartet, dass zusätzliche Mittel zur Fehlersuche nach der Untersuchungsteam auf die Präferenzen entwickelt werden.

Einschränkungen der Technik

Es gibt drei Hauptbeschränkungen dieser Technik. Die erste ist, dass sehr feine Neuriten als Ersatz verwendet werden, für große neuronale Invasion, das ist das, was Pathologen in Tumorproben beobachten. Es ist nicht das, was die Rolle der Neuriten bekannt, wie Neuronen im Gegensatz in vivo sind , weil die Identifizierung perineuriteInvasion ist über die Fähigkeiten einer Routine histopathologischen Prüfung. Zweitens ist perineural invasion eine Form von Weichgewebe-Invasion, die nicht nur Tumorzellen, und eine benachbarte Neuron umfassen kann, wie in diesem Test simuliert wird. Als solche exogene Faktoren stammt aus dem in vitro Tumormilieu sind in diesem Test fehlt. Schließlich kann die Zeitspanne, während der PNI wird auf etwa 48 h auf die Kombination von Fibroblasten-Efflux und Verlust der Integrität Matrix aufgrund sucht werden begrenzt. Auf diese Weise können Zelllinien, die auf neurale invasion wirksam sind, aber langsam Teilungs sind und / oder eindringenden wird nicht gut um PNI verpasst und angenommen werden.

Bedeutung der Technik in Bezug auf bestehende / Alternativmethoden

Unseres Wissens ist dies die einzige in - vitro - Modell derzeit verfügbaren PNI in HNSCC zu untersuchen. In Anbetracht der Häufigkeit, mit der PNI tritt in HNSCC und die begrenzte Kenntnis der Mechanismen,Derzeit existiert, dieses Verfahren ist aus mehreren Gründen vorteilhaft. Erstens hat es eine sehr hohe Erfolgsrate und eine hervorragende Reproduzierbarkeit. Die Gesamtversuchszeit ist auch relativ kurz im Vergleich zu ähnlichen Protokolle ^12,17-19. Schließlich mit der großen Anzahl von Tests, die von einer einzelnen Maus erzeugt werden kann, können viele Bedingungen mit wissenschaftlich entsprechenden Replikate getestet werden. Die Kombination dieser Faktoren ermöglicht die schnelle Beurteilung von vielen verschiedenen Bedingungen mit konsistenten Ergebnissen.

Zur gleichen Zeit wird die hohe Qualität des Assays ermöglicht detailliertere Untersuchung der Wechselwirkung zwischen den Tumorzellen und den Neuriten. Die Verwendung von Live-Cell-Imaging ermöglicht die Aufwertung des Neuritenwachstum Prozesses und der HSNCC Zellinvasion in Zeitraffer-Video Form. Die Zugabe von fluoreszenzgefärbten Zellen erzeugt sehr klare Unterscheidung zwischen den Krebszellen und Hintergrundmaterial, wie Fibroblasten und dichte Neuriten outgrowth (die Auto-fluoreszieren rot). Ob nach diesem Protokoll oder die von anderen beschrieben, diese allgemeine experimentelle Design ist in seiner relativen Kindheit, und es ist weit von einem Goldstandard für die in - vitro - Studie von PNI. Aus diesen Gründen erreicht die mehr auf diesen Test, der im Detail, desto größer ist die Möglichkeit zur gemeinsamen Entwicklung eines idealen Methodik beschrieben.

Zukünftige Anwendungen oder Anfahrt nach dieser Technik Mastering

So wie es verschiedene Ansätze sind die Assays zur Einrichtung, gibt es mehrere Ansätze, um die Ergebnisse zu messen. In dem obigen Text, ein einziges Verfahren zur schnellen, den Grad der perineuralen Invasion in jedem Test Quantifizierung vorgestellt. Dies ist ideal für das Screening der Wirkung von zahlreichen verschiedenen Wegen auf PNI, vor allem in Anbetracht, dass man 32 isolieren kann - 40 DRGs pro Maus. Es gibt eine Anzahl von fortschrittlichen Abbildungstechniken PNI zu bewerten,einschließlich der Menge an Fluoreszenz in einem gegebenen Bereich, den Abstand und die Geschwindigkeit der Zellinvasion und die rohe Anzahl von Zellen innerhalb des Assays. Sobald der dynamische Teil des Versuchs beendet ist, können die Zellen innerhalb der Test und / oder dem Überstand auch für weitere molekulare Analyse gesammelt werden.

Diese experimentelle Methodik bietet die Möglichkeit, Mechanismen in der PNI von HNSCC und anderen Krebsarten beteiligt aufzuklären. Dieses Wissen kann die Entwicklung von Therapeutika fahren die Bahnen von PNI zum Ziel, die in der heutigen Zeit, in HNSCC fehlt. Spezifisches Targeting von PNI, wenn sie als negative pathologisches Merkmal identifiziert wurden, können möglicherweise die Notwendigkeit für die nicht-spezifischen Adjuvans-Behandlungen, wie Bestrahlung und Chemotherapie vermeiden, die derzeit verwendet werden.

The authors have no competing financial interests.

This work was supported in whole by funding from the NIH through the R21 grant, "Mechanisms of Perineural Invasion in Head and Neck Cancer" and the NCI T32 training grant, "Post-Doctoral Research Training in Head and Neck Oncology (2T32CA060397-21)." Thank you to Richard Steiman, MD, PhD and lab staff.