머리와 목 편평 ​​세포 암에서 신경초 침략을위한 모델

Perineural invasion (PNI) is a common feature of head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC), conferring lower survival rates. Its mechanisms are poorly understood. Utilizing neurites generated from murine dorsal root ganglia confined to a semisolid matrix, the pathways involved in the PNI of HNSCC cell lines can be investigated.

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, radiation, and chemotherapy, locoregional recurrences and distant metastases occur at higher rates, and overall survival is decreased by 40% compared to HNSCC without PNI. In vitro studies of the pathways involved in HNSCC PNI have historically been challenging given the lack of a consistent, reproducible assay. Described here is the adaptation of the dorsal root ganglion (DRG) assay for the examination of PNI in HNSCC. In this model, DRG are harvested from the spinal column of a sacrificed nude mouse and placed within a semisolid matrix. Over the subsequent days, neurites are generated and grow in a radial pattern from the cell bodies of the DRG. HNSCC cell lines are then placed peripherally around the matrix and invade preferentially along the neurites toward the DRG. This method allows for rapid evaluation of multiple treatment conditions, with very high assay success rates and reproducibility.

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is the sixth most common cancer in the US, with 10,000 deaths per year nationally and 300,000 deaths per year worldwide¹. The overall prognosis for HNSCC has remained unchanged at 50% for the past several decades. Perineural invasion (PNI) is one of the most prominent pathological features that portend a poor prognosis in patients with HNSCC. Unfortunately, PNI is a frequent occurrence in HNSCC and can be found in up to 40% of HNSCC patients^2,3.

PNI is the process by which malignant cells track along nerves to adjacent tissues, allowing for higher rates of local and distant spread. Accordingly, PNI-positive HNSCC tumors have higher rates of locoregional recurrences and distant metastases, resulting in lower overall survival compared to HNSCC patients without PNI^4-8.

Although the treatment of patients with PNI is typically maximized by employing surgery, radiation, and chemotherapy, the overall survival rates of these patients are still decreased by up to 40% compared to patients without PNI^9-11. Thus, it is clear that the current treatment modalities for HNSCC are ineffective in improving the adverse prognosis associated with PNI. The approach of developing targeted therapy against PNI in HNSCC has been hindered by the poor understanding of the factors that regulate this process. This is, in part, a consequence of the lack of a consistent in vitro model for the study of PNI in HNSCC.

In recent years, several groups have been utilizing an in vitro model for studying PNI in predominantly pancreatic and prostate cancers^12-19. This model uses the neurites generated from dorsal root ganglia isolated from mice or rats as a surrogate for large-nerve invasion. The dorsal root ganglia are fixed in a factor-depleted semisolid matrix, which is a solubilized basement membrane protein mixture secreted by Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells. This matrix allows for the outgrowth of the neurites and the tracking of single cancer cells along these neurites. Described here is the adaption of this model for the examination of PNI in HNSCC.

1. 문화 매체의 준비 및 요리 (10 분)

1. 100 μL를 96 웰 V 바닥 플레이트의 웰에 10 % 소 태아 혈청 (FBS)을 가진 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)로 추가한다.
2. 20 ° C의 냉동고에서 반고체 행렬의 약 100 μL의 사전 분주-병을 제거하고 얼음에 직접 배치합니다.
   참고 : 반고체 행렬은 후속 단계에 필요한 얼음에 액체 상태에 도달하는 데 약 30 분 걸리기 때문에이 전에 후근 신경절에 (DRG) 수확 작업을 수행합니다. 항상 얼음에 반고체 매트릭스를 유지하지 않으면 저품질 매트릭스 방울을 초래할 것이다.
3. 라벨 유리 바닥 영구 잉크 배양 플레이트, 플레이트의 저면의 네 모서리 각각에 고유 식별자를 생성. 판 표면의 온도를 얼음에 플레이트가 오른쪽을 놓습니다.
   참고 : 각 마우스 수익률 32-40 DRG, 소위 냉각 사전 파이 할 필요가 없습니다 (40)에 1에서 그들을 레이블냉장 팁 잠재적 매트릭스 방울을 배치하는 매트릭스 일관성의 차이를 도입하는 과정을 통해 따뜻한 같이, 팁 애완.

쥐 DRG 2. 해부 (45 분)

1. 이러한 CO ₂ 챔버 개흉술의 사용을 통해 특정 실험 프로토콜, 당 등의 무 흉선 누드 마우스를 안락사.
2. 해부 영역과 현미경을 설정합니다. 15 또는 50 ML 원뿔 튜브 폴리스티렌 용기의 살균, 깨끗하고 평평한 밑면을 사용합니다.
   주 : 또한 그들은 일회용 저렴 같이 해부 표면으로 사용하기 위해 적합하며, 핀 또는 바늘을 사용하는 척추 고정을 허용한다. 만 멸균 악기와 바늘을 사용합니다.
3. 천연 시각에서 직선 또는 곡선 섬세한 가위로 마우스의 꼬리 헤드의 루트에서 척주를 따라 세로 절개를 만든다.
4. SACR 아래에 가로 분할에 같은 가위를 사용하여알 척추. 모든 방법을 사용 가위 두개골베이스까지 척추 양쪽 해부. 이 시점에서, 경추가 가위 가능한 두개쪽으로까지 횡단되어 있는지 확인합니다.
5. 낮은 전력에서 운영 현미경 척추의 자궁 끝을 준수하십시오. 백색 척수 척추 주위 근육 및 연부 조직의 다양한 양으로 둘러싸인 뼈 링의 중앙에 명백하다.
6. 미세한 스프링 가위로 3 척추 기관 - 제 2의 지느러미 또는 우수한면을 분할합니다. 가위의 스프링 작용을 이용하여, 척추체 박리가 중심선에서 발생되도록 절단 초기 뼈를 연다. 성례의 척추쪽으로 조금씩 계속하고 추체의 복부 또는 열등한 측면에서 동일한 상처를 완료하여 척추를 이등분.
   참고 : 낮은 DRG 수율가 발생합니다 뼈 척추의 중간 선 절개를 확인하지 않으면.
7. 생에서의 포인트는, 척추는 두 부분으로 나누어 져 있습니다. 장소 및 멸균 접시에 아래로 향하게 척수로, 옆으로 하나의 헤미 - 척추를 놓습니다.
   참고 : 장소에서 척수를 떠나는 것은 DRGs는 척수에 깊은만큼, 건조에서 DRGs를 방지 할 수 있습니다.
8. 폴리스티렌 해부 플랫폼이 18 게이지 바늘과 다른 헤미 - 척추의 양쪽 끝을 고정합니다. 경부 끝부터 부드럽게 약 4 척추 수준에서 척수를 다시 박리 (척추가 좁아지고 있기 때문에 명백한 상기 DRG는 서로 근접하며, 리브 삽입있다).
9. DRG를 연결하는 감각 신경 (일반적으로 두)를 관찰한다. 신경이 DRG에 삽입 영역에서 부드럽게 미세 집게로 주변 근막을 파악. 해부 및 DRG을 확보하기 위해 미세한 스프링 가위로이 밴드와 다른 신경 조직을 잘라. 부드러운 철회는 뼈 척추 내 위치 밖으로 DRG을 가져올 것이다.
   참고 : 증가이 단계에서 현미경 전력은 유리하다. 크게 신경 돌기의 성장을 제한 할 DRG에 부상을 크러시. 이것은 결코 직접 DRG 파악하지 피할 아니라 주변의 밴드를 파악하는 것이다.
10. 주변 신경을 DRG를 해제하는 미세한 스프링 가위로합니다 (DRG는 일반적으로 해부보기로 깊은 기준으로 한 말초 신경을 가지고) 잘라.
    주 : 신경 말단과 DRG 지금이 시점에서 DRG에 가능한 한 가까운이 컷을 긴장에있는 동안 시작 이상적입니다 확인하는 가장 쉬운 방법입니다. 이 말단 지점이 절단되면, 근위 분기도 트리밍된다.
11. 미세한 스프링 가위로 어떤 길 잃은 신경 섬유 또는 근막 첨부 파일의 DRG를 낸다. 적절한 분리 한 후, 96 웰 V-바닥 판 내 상온 매체에 DRG를 배치했다.
    참고 : 접시는 흰색 DRGs 쉽게 하위 mm를 시각화 수 아래 어두운 배경을 배치. 만 EAC 한 DRG를 배치시간 잘; 이러한 방식으로, 그들은 쉽게 후속 단계에서 설명 될 수있다.
12. 한 헤미 - 척추 후 다른 아래로이 과정을 모든 방법을 반복합니다. 40-32 총 20 DRGs, - 각 팀은 16을 산출한다.
    주 :이보다 적은 DRGs가 있다면 척추 해부 상기 cephalad 및 / 또는 미부를 행할 필요가있다. DRGs 하나가 꼬리 쪽이 진행됨에 따라 점점 덜 잘 정의된다.

반고체 매트릭스 방울 3. 준비 (<판 당 1 분)

1. 얼음에서 하나의 유리 잘 바닥 플레이트를 제거하고 운영 현미경 아래에 얼음 블록에 놓습니다. 확인 매트릭스의 분취 항상 얼음에 유지합니다.
2. 또한 유리의 가장자리로부터 액적 자체 적어도 큰 거리를두고 2 μL 또는 10 μL의 micropipetter으로 유리 바닥 판의 4 개의 코너 부 각각에 행렬 1.5 μL 방울을 놓는다.
   1. 직접에 피펫의 팁을 놓고45도 각도로 유리합니다. 천천히 행렬을 피펫. 매트릭스가 접시에 종사 한 후 천천히 유리 바닥에서 멀리 이동합니다.
      참고 : 매트릭스와 유리 사이의 표면 장력이 완벽한 반구 때마다 작성해야합니다.
   2. 매트릭스로 공기 방울 부주의 주입 매트릭스 액적 훨씬 큰 직경을하고 제거하기 어렵 기 때문에 팁 비어 직전 피펫 멈춘다.
      참고 : 피펫 손을 안정시키기 위해 두 번째 손을 사용하여보다 정확한 위치를 용이하게한다.

반고체 매트릭스 방울로 DRG 4. 삽입 (<접시 당 2 분)

1. 잠시 실온 (~ 1 분)에서 매트릭스 물방울 접시를 남겨주세요. 이것은 약간 DRG의 정확한 배치가 쉬워, 매트릭스를 경화된다.
2. 국자 (파악하지)가 DRG 부드럽게 왼쪽 손에 폐쇄 미세 집게로. 다시, 작은 대하여 어두운 배경, 흰색DRG 시각화를 용이하게한다. 오른쪽 손에 21 게이지 바늘의 끝 부분에 DRG를 전송합니다. 이 전송은 집게에 잔류 미디어를 떠날 것이다.
3. 천천히 21 게이지 바늘 (도 1)를 사용하여 매트릭스 방울의 중앙으로 DRG를 삽입한다. 대부분은 DRG 용이 행렬로 분리되며, 그 바늘 중앙에 위치 될 수있다.
   1. DRG이 바늘로 찌르는 경우, 바늘의 오프 매트릭스 방울에 DRG를 밀어 미세 집게를 사용합니다. 실험실과 현미경 집게에서 심지 멀리 초과 용지는 닦습니다.
      참고 : 매트릭스 미디어를 소개하는 것은 분석의 직경, 볼륨과 일관성을 변경합니다. 색 또는 색 쓰기와 얼음 블록이 섬세한 프로세스의 시각화를 쉽게 배경 대조를 제공합니다.
4. 판은 네 DRGs있다 후에 DRG 행렬 방울의 중심에 있음을 보장하기 위해 최종 검사를 수행한다. 조정21 게이지 바늘로 필요에 따라.
5. 37 ° C 배양기에 완성 된 판을 전송합니다. 이 반고체 행렬을 공고히하고 위치에 DRG가 해결됩니다.
6. DRGs 모두에 대해이 과정을 반복합니다. 음성 대조군으로 DRG없이 빈 매트릭스 방울을 놓습니다.
7. 모든 접시를 완료하고 최소 3 분 동안 37 ° C 배양기에 노출 후 각각의 유리 바닥 판에 10 % FBS 매체와 DMEM의 4 ML을 추가합니다. 약간의 각도로 접시를 놓고 천천히 점진적으로 매트릭스 DRG 단위와 접촉하도록, 매체를 추가 할 수 있습니다.
   주 : 매체가 너무 빨리 또는 적극적으로 매트릭스 및 / 또는 DRG를 추가하면 빠질 될 수 있습니다.
8. 72 시간 - 48에 대해 37 ° C 배양기에서 분석을 저장합니다.
   참고 : 분석의 정기 검사 행렬 에지 (그림 2)으로 신경 돌기의 원주 가지를 표시합니다. 신경 돌기가 매트릭스 방식의 3/4보다 큰 경우에는, 그것을세포를 도금하는 것이 적절하다.

머리와 목 암 세포의 5. 준비

주 : 두경부 편평 세포 암종 세포 이외의 세포 라인이 실험 설계에 사용될 수있다.

1. 37 ° C 배양기에서 선호 플라스크 또는 배양 접시에 10 % FBS와 DMEM에서 편평 상피 세포 암 세포주를 유지한다. 모든 매체 문화 플라스크 또는 접시에서 실험, 흡입 세포를 준비하고 PBS로 두 번 세척합니다. 10 % FBS DMEM으로 다음 5 분 동안 0.025 % 트립신을 적당량 첨가하여 세포를 정지. 6 mL의 배양 접시에 세포 및 미디어 혼합물의 피펫 4 mL를.
   주 : 6 ㎖의 배양 플레이트가 더 이상 충분한 세포를 제공하는 경우에도 50 % 이하로 합류한다.
2. 염색 및 DRG 분석에 도금에 24 시간 이전에 다른 조건에 HNSCC 셀 라인을 노출. 재 투여 세포 environme 일관성을 유지하는 도금되면 조건NT를.
   참고 : 세포 배양 접시에 1 항체, 성장 인자, 사이토 카인, 또는 다른 분자를 추가 - 마우스의 해부 및 매트릭스에 DRG의 주입 다음 1 일.
3. (- 삼일 행렬에 DRG 수확 및 주입 후 2) 세포를 도금하기 전에 형광 세포 얼룩에게 1 시간을 추가합니다.
   참고 : 세포막을 통해 자유롭게 통과 여기에 사용되는 특정 얼룩; 그러나, 세포 내 티올 그룹과 반응 후, 얼룩은 세포 내에서 유지와 딸 세포에 전달된다. 염색 크게 분석법에서 시각화를 용이하게한다. 이 실험의 기간 3 일 - 형광이 2 존재하기 때문에 이러한 임시 얼룩은 이러한 분석에 이상적이다. 또한, 다양한 컬러의 사용을 허용하고 형광 단백질 형질 감염된 세포주를 생성하기위한 필요성을 제거한다.
   1. 무 혈청 DMEM 2 ㎖에 2 μL 10 mM의 스톡 세포 얼룩 혼합 색소 용액 10 μM 준비모든 세포의 상태에 따라. 세포에 첨가하기 전에 37 ℃로 가온이.
   2. 플레이트에 부착 HNSCC 세포를 떠나, 6 mL의 플레이트에서 배양 배지를 제거합니다. 10 μM 세포 염색 / 무 혈청 DMEM의 용액을 인산 완충 식염수 (PBS) 2 ㎖를 첨가하고 2 분리 각 플레이트에 첨가
   3. 40 분 동안 37 ° C 배양기에 세포 얼룩 6 mL의 문화 판을 돌려줍니다.
   4. 40 분 후, 배지를 흡인. PBS의 2 mL를 넣고 다음을 대기음. 각각의 판에 0.025 % 트립신 1 ㎖를 추가하고 37 ° C 배양기에서 교체합니다.
   5. 3 후 10 % FBS와 DMEM 2 ML을 추가합니다 - 5 분, 15 ML 원뿔 튜브에 정지 세포를 전송합니다. 세포를 스핀 10 % FBS DMEM으로 1 ㎖에이를 재현 탁.
   6. 혈구 또는 자동 세포 계수기와 세포를 카운트하고 용액 당 300,000 세포의 최종 세포 농도를 만들기 위해 10 % FBS DMEM으로 추가.

6. 도금 머리와 N에크 암 세포

1. 인큐베이터에서 매트릭스 DRG 분석과 함께 유리 바닥 플레이트를 제거합니다.
   주 - 삼일 신경 돌기는 일반적으로이 후 발생 행렬의 가장자리 방향의 적어도 75 % 일 때 다시, 이들은 적합하다. 이 가장 적어도 10 배 목표를 사용하여 볼 수 있습니다.
2. 유리 바닥 판에서 매체를 기음. 완전히 잘 매트릭스 DRG 유닛을 제거하지 않고, 유리 내의 매체 대기음.
3. 200 μL 피펫을 사용하여 300,000 세포 / ㎖의 매체의 200 μL를 그립니다. 각 매트릭스 DRG 분석을 통해 세포의 두 방울을 놓습니다. 한 접시에 각 셀 상태의 네 개의 반복을 만들어 각 매트릭스 방울에 대해이 단계를 수행합니다.
   참고 : 행렬의 반구 형태는 세포 분석 (그림 3a,도 3b)의 주변을 따라 링에 정착 할 수 있습니다. 부드러운 트리거와 피펫을 찾는 것은 균일 한 배치가 훨씬 쉽게 떨어질 수 있습니다.
4. 유사 세포 수 및 디 확인4X 현미경 하에서 다양한 세포 조건 stribution.
5. 약 60 분 동안 37 ° C를 인큐베이터에 유리 바닥 판을 놓습니다. 주 : 세포 및 매체 (~ 150 μL)의 소량이 있지만 인큐베이터 시간을 몇 시간이 경과 할 때까지 상기 분석법은 건조하지 않는다.
6. 60 분 후, 부드럽게 유리 바닥 판의 측벽을 따라 10 % FBS와 DMEM 4 mL를 넣어.
   주 : 일정 시간 동안 상기 세포가 부분적으로 바닥 판 및 세포를 방해하지 않는 매체를 첨가하는 방법을 준수. 상이한 세포 유형은 유리 바닥 판에 부착하기 위해 다소 시간이 걸릴 수 있도록.
7. 이전의 농도 수준을 유지하기 위해 현재 어떤 약물 또는 외인성 성장 인자를 교체.
8. 그들은 현미경으로 조사하는 경우를 제외하고 37 ° C 배양기에 분석을 돌려줍니다. 현미경에 의한 촬상이 분석의 결과를 정량화. 간단히과 신경초 침윤의 가닥을 계산네 개의 사분면에서 4 배 현미경 이미지를 사용.
   참고 : 4X 목적 및 형광 기능이있는 현미경 사진 문서화 분석법을위한 적합합니다. 분석법의 크기는 신경초 침윤의 개별 영역을 포착 할 수있을만큼 자세히 설명하는 4X 목적, 분야 내에서 잘 맞습니다. 신경초 침윤 24 시간 이내에 분명하게하지만, 48 시간을 초과하면 분석의 무결성 종양 세포 매트릭스의 둘레를 따라 나누어 침입으로 약화하기 시작한다. 48 시간을 넘어도 시야 현미경을 사용하여 시각화를 가리는 DRG에서 섬유 아세포의 상당한 유출이 있습니다. 따라서,이 기간 동안 적어도 두 광 문서 4X 현미경에서의 결과하는 것이 바람직하다 (예를 들어, 종양 세포 도금 후 24 및 48 시간에서). 이러한 3 차원 분석하고, 완전히 화상 전체 분석 어렵다는 염두. 대부분의 신경초 침윤 플레이트의 바닥, t에서 비행기에서 발생그 세포는 다소 플레이트의 바닥 위에 매트릭스에 포함된다. 이 평면은 수평으로 근접하기 때문에, 종양 세포와 신경 돌기의 대부분은 4X에서 단일 레벨의 이미지에서 캡처된다.

DRG의 절개 및 매트릭스 액적 내에 배치 한 후, 분석의 외형은 완전한 원형이 DRG 아니라고 참고도 1과 유사해야 있지만, 매트릭스 내 액적 중심. 이것은 그림 2에 부분적으로 표시된 360도에서 신경 돌기의 생장, 수 있습니다. DRG의 특정 부분이 일반적으로 원심성과 구 심성 신경 가지 입력하고 각각 DRG를 종료 한 경우에 해당, 다른 사람보다 더 빠르고 더 많은 수의 신경 돌기를 보내주의하십시오. 우리는이에 대해 무작위로 4 그룹의 DRGs을 도금 한 후 무작위로 각 셀 상태로 주어진 판을 할당하여 DRGs 사이의 크기 차이를 차지하고있다.

전술 한 바와 같이 신경 돌기는 일반적에있는 행렬의 가장자리에 방해 적어도 ¾ 확장하면 우리는 HSNCC 세포주 판형일 3. 추가 셀이 행렬 (도 3a)의 주위에 원주 링을 형성한다. 우리는 이후 4 일 (그림 3b)과 5 일 (도 3c)의 분석을 촬영. 여기에 표시된 세포주 (FaDu)는 신경 돌기를 따라 추적하는 평균 이상의 능력을 보여줍니다. 도 4에 도시 SQCCY1 세포주 그러나, 검정에 침입하는 성향없이 거의을 나타낸다.

새로운 세포주를 사용하는 경우, 그 특정 세포주 분석 주위 동작하는 방법을 검토하기 위해 여러 음성 대조군을 이용하는 가져올 것이다. 우선, 매트릭스 형으로 구성된 "빈"검정 플레이트 주위 세포 (도 5). 우리의 실험실 적극적으로 검토 모든 세포주는 매트릭스의 주위에 분할 만 입력하거나 매트릭스의 상단을 통해 연장하지 않습니다. 과도한 세포 매트릭스의 상부에 남아있는 경우, 상기 매트릭스에 비해 상당한 증가가있을 수있다. 이 전자의 필요성을 강조많은 세포가 가능한 매트릭스의 주위에 떨어 nsure가 아닌 나머지에 행렬 위에 분할 방치. 이것은 세포가 부착 전에 부드럽게 두드려서 플레이트 또는 세포 유리판에 부착하기 시작하면 직접 행렬 위에 액적 미디어 소량을 피펫 팅에 의해 달성 될 수있다.

세포가 DRG는 매트릭스 내에 배치하는 것과 같은 일에 도금되는 것을 특징으로하는 제 2 네거티브 제어가 실행된다. 이 접근법의 목적은 그것이 DRG에 셀을 구동하지만, 신경 돌기의 존재는 필수가 아니라하는 neurotropic 매력이 아니라는 것을 보여주는 것이다. 종양 세포는 2보다 큰 일 매트릭스의 둘레를 따라 상주 때 또한, 매트릭스 에지는 불명료하게된다. 매트릭스는 유리 바닥 오프의 리프트를 시작하고 자유 부동 직후 미디어에서 찾을 수 있습니다. 이 때문에,이 프로토신경 돌기 행렬의 가장자리까지의 거리의 75 %가 연장 일단 COL은 HNSCC 세포 도금 방법을 설명합니다.

시각적 분석과 매우 명백한 차이가 어떤 결과를 정량화하기위한 수많은 옵션이 있습니다. 하나의 방법에서, 분석의 이미지는 수직 및 수평 라인 (그림 6) 4 개의 사분면으로 나누어집니다. 한 점은 PNI 적어도 하나의 문자열이있는 모든 사분면에 할당됩니다. PNI가 DRG에 매트릭스 모서리 방식의 50 %를 넘어 확장하는 경우, 다음 2 점 대신에 할당된다. 이러한 방식으로, 스코어 0 - 8 포인트가 할당 될 수있다. 이 시스템의 주요 장점은 카운트 너무 많은 PNI 단위가 세이 빠르게 평가할 수 있다는 것이다. 단점은 적절 PNI의 정도 (즉, 침윤 한 DRG 신경 돌기까지의 거리의 100 % 사분면가 동일한 점수를 수신하지 않는 표현이다 (2)로서 숨어) 10 유사하게 침범 신경 돌기로 adrant. 시야 및 형광 이미지의 비교에서도 유의 한 섬유 아세포의 유출과,이 시스템은 매우 쉽습니다.

샘플 점수는 그림 6에 표시됩니다. 도 3에 대해 0 포인트 2 포인트 7 점,이 사분면의 점수 시스템을 사용하는 것은 각각의 패널도 3a,도 3a 및도 3c에 대해 할당 하였다. 그림 4는 각각 그림 (b) 2 점과 2 패널도 4a의 점의 점수를 받았다. 표 1의 데이터는 세포주 및 FaDu SQCCY1을 이용하여 여러 가지 실험 결과를 도시한다. 심지어 제한된 등급 규모 이와 같은, 평균 네 사분면 점수에서 통계적으로 유의 한 차이는 쉽게 독립적 인 샘플 t-test를 이용하여 얻을 수 있습니다.

그림 1. DRG 매트릭스 분석. 4 배에서 시야 현미경으로 표시 매트릭스 액적 내에서 후근 신경절의 정확한 위치. 스케일 바는 1mm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

신경 돌기의 2 파생물 그림. 신경 돌기 바로 매트릭스 방울 (A)의 DRG를 배치 한 후 0 일째에 존재하지 않는다. 일 1 (B)에서, 돌기 증생 시야 현미경에 10X에서 명백하다. 신경 돌기 성장은 2 일 (C)과 3 일 (D)에 계속; 그러나, 섬유 아세포의 유출을 확인합니다. 사우스 캐롤라이나맥주 바는 0.1 mm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

FaDu 그림 3. DRG 매트릭스 분석. 머리와 목 편평 상피 세포 암 라인 FaDu는 4 일 (B)과 5 일 (C)에서 볼 수있다 4X 진보적 인 신경 침공에서 녹색 형광 및 브라이트 현미경에 표시된 3 일 (A)에 대한 분석, 주위 둘레 덧붙였다. 스케일 바는 1mm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4. DRG- SQCCY1와 매트릭스 분석. 머리와 목 편평 상피 세포 라인 SQCCY1는 4 배에서 시야와 녹색 형광 현미경에 표시, 하루 4 (A)에 추가했다. 이 세포주도 5 일 (B)에 의해, FaDu로 신경초 침윤에서 같은 실력 아닙니다. 스케일 바는 1mm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

FaDu 그림 5. 매트릭스 분석. 머리와 목 편평 상피 세포 암 세포주 FaDu 하루 3 명 시야 및 녹색 형광 현미경 (4X) 일 4 (A)에 표시에 DRG없이 매트릭스 방울 주위에 추가. 종양 세포는 심지어 하루 5의 (B)에 의해, 매트릭스를 입력하거나 상단 위에 성장하지 않습니다. 스케일 바는 1mm를 나타냅니다.TTP : //ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55043/55043fig5large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

분석 정량 6. 네 사분면 방법을 그림. 원 포인트는 DRG에 매트릭스의 에지로부터의 거리의 PNI 50 % 미만으로 각 사분면에 할당된다. PNI가 50 % 이상으로 확장 할 때 2 포인트가 할당된다. 첫 번째 예 (A)는 (2 점 채점 50 % 이상 연장되는 PNI있다 오른쪽 하단 제외 PNI 50 % 미만 사분면마다 1 포인트) (5)의 점수를받을 것이다. 두 번째 예 (B)는 (모든 사분면에서 50 %를 넘어 PNI) 8로 획득된다. 스케일 바는 1mm를 나타냅니다. V 여기를 클릭하십시오이 그림의 더 큰 버전을 서평.

표 FaDu 및 SQCCY1 간의 PNI 1. 비교. 24 시간 (4 일) 및 세포가 DRG 매트릭스 분석 주위 도말 한 후 48 시간 (5 일)의 세포주 및 FaDu SQCCY1 사이도 6에 도시 된 바와 같이 네 개의 사분면 점수를 의미한다. 비교는 독립적 인 SAM을 사용하여 만들어집니다PLE t 검정 표준 편차 (SD) 및 P 값되게.

프로토콜 내에서 중요한 단계

이 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 정확한 해부 및 후근 신경절의 추출이다. 이 헤미 - 척추에 척추와 중간 선 - 세로 부문의 적절한 절개는 DRG 많은 수의 획득에 중요하다. 개별 DRGs의 해부 동안, 신경절은 직접 처리해서는 안, 오히려 주위의 근막은 미세 집게로 파악되어야한다. 이렇게하지 않으면 가능성이 신경 돌기 가지에 대한 실패의 주요 원인 인 DRG의 압박 손상 발생합니다. 그것은 오버 처리 DRG 및 분석에 더 신경 돌기의 성장을 얻을 수없는 위험에보다 해부하는 동안 주변의 신경 조직을 트림에서-훨씬 낫다.

수정 및 문제 해결

상술 한 바와 같이 실험 프로토콜을 충족 최적의 반영수년간 제조 절차 조정 다수의 확립 hodology. 프로토콜 섹션에 대응하는 단계의 바로 아래에 나열된 방법을 사용하면 저자의 경험에 기인 메모 함정의 수이다. 관련된 단계의 수를 감안할 때, 미래의 연구자에 의해 프로토콜이 이루어질 수 실제로 많은 변형이있다. 이러한 수정에 대한 경험이 성장함에 따라, 문제의 추가 수단이 조사하는 팀의 기호에 따라 개발 될 것으로 예상된다.

기술의 한계

이 기술에 대한 세 가지 주요 제한 사항이 있습니다. 첫 번째는 매우 미세한 신경 돌기가 병리학 종양 표본에서 관찰 무엇 큰 신경 침략을위한 대리로 사용되는 것입니다. 식별 때문에 뉴런 반대로 그것은 어떤 신경 돌기의 역할 공지되지 않고, 생체에 perineurite침공은 일상적인 조직 병리학 적 검사의 기능을 넘어이다. 둘째, 신경초 침윤이 분석에서 시뮬레이션 단순히 종양 세포와 인접 신경 세포를 포함하지 않을 수 있습니다 연부 조직 침공의 한 형태이다. 체외 종양 환경 네이티브 같은 외생 적 요인으로이 분석에 부족하다. 마지막 PNI가 연구 될 수있는 기간으로 인해 섬유 아세포 유출 매트릭스 무결성 손실의 조합으로 약 48 시간으로 제한된다. 이러한 방식으로, 신경 침윤 효과적이지만 느린 분할 및 / 또는 침입이다 세포주 누락되고 PNI 능숙하지 추정.

기존 / 대체 방법에 대하여 기술의 중요성

우리의 지식에,이 HNSCC에 PNI를 검사하는 현재 사용할 수있는 유일한 체외 모델입니다. PNI가 HNSCC 발생 빈도 및 메커니즘의 한정된 지식을 주어진현재이 방법은 여러 가지 이유로 장점이 존재한다. 먼저, 매우 높은 성공률과 우수한 재현성을 갖는다. 전체 실험 시간은 유사한 프로토콜 ^12,17-19에 비해 상대적으로 짧다. 마지막으로, 하나의 마우스에서 생성 될 수있는 분석의 많은 수의 여러 조건은 과학적 해당 복제로 시험 할 수있다. 이러한 요소의 조합은 일관된 결과를 여러 가지 조건의 신속한 평가를 허용한다.

동시에 분석의 높은 품질은 종양 세포 및 신경 돌기 사이의 상호 작용의 더 자세한 조사를 허용한다. 라이브 세포 이미징의 사용은 신경 돌기의 생장 과정의 이해와 시간 경과 비디오 형태 HSNCC 세포 침입을 허용한다. 형광 염색 된 세포의 첨가는 섬유 아세포 및 고밀도 돌기 OU로 암세포 배경 재료 간의 매우 분명 분화를 작성tgrowth (이 자동 형광 적색). 이 프로토콜 또는 다른 사람에 의해 설명 된 다음하든,이 일반적인 실험 설계는 상대적으로 초기 단계에 있고, PNI의 체외 연구를위한 황금 표준에서 멀리있다. 이러한 이유로, 더 이상적인 방법론 공동 개발을위한 큰 기회를 상세히 설명이 분석에 접근한다.

이 기술을 마스터 한 후 미래의 응용 프로그램 또는 방향

분석법을 설정하는 여러 방법이 존재하는 것처럼, 결과를 측정하는 여러 가지 방법이있다. 위의 텍스트에서 빠른 속도로 각 분석에서 신경초 침윤의 정도를 정량화하기위한 하나의 방법을 제시했다. 마우스 40 DRGs - 특히 한 (32)를 분리 할 수 ​​주어진 PNI에 수많은 서로 다른 경로의 영향을, 스크리닝에 이상적이다. 고급 이미징 기법 수가 PNI를 평가 있는데,주어진 영역 내에서 형광의 양, 거리 및 세포 침입의 속도 및 분석 내의 세포의 원료 수를 포함. 실험의 동적 부분이 완료되면, 상기 분석 및 / 또는 상등액 내의 셀은 또한 상기 분자 분석을 위해 수집 될 수있다.

이 실험 방법은 HNSCC과 다른 암의 PNI에 관여하는 메커니즘을 규명 할 수있는 기회를 제공합니다. 이 기술은, 현재, HNSCC 결여되어 PNI의 경로를 표적으로하는 치료제의 개발을 유도 할 수있다. PNI 특정 타겟팅 할 때 잠재적으로 현재 이용되는 방사선 요법 및 화학 요법과 같은 비특이적 면역 보강제 치료법에 대한 필요성을 미연에 방지 할 수있는 악영향 병적 특징으로 식별.

The authors have no competing financial interests.

This work was supported in whole by funding from the NIH through the R21 grant, "Mechanisms of Perineural Invasion in Head and Neck Cancer" and the NCI T32 training grant, "Post-Doctoral Research Training in Head and Neck Oncology (2T32CA060397-21)." Thank you to Richard Steiman, MD, PhD and lab staff.