מודל הפלישה Perineural ב קרצינומה תא ראש וצוואר קשקש

Perineural invasion (PNI) is a common feature of head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC), conferring lower survival rates. Its mechanisms are poorly understood. Utilizing neurites generated from murine dorsal root ganglia confined to a semisolid matrix, the pathways involved in the PNI of HNSCC cell lines can be investigated.

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, radiation, and chemotherapy, locoregional recurrences and distant metastases occur at higher rates, and overall survival is decreased by 40% compared to HNSCC without PNI. In vitro studies of the pathways involved in HNSCC PNI have historically been challenging given the lack of a consistent, reproducible assay. Described here is the adaptation of the dorsal root ganglion (DRG) assay for the examination of PNI in HNSCC. In this model, DRG are harvested from the spinal column of a sacrificed nude mouse and placed within a semisolid matrix. Over the subsequent days, neurites are generated and grow in a radial pattern from the cell bodies of the DRG. HNSCC cell lines are then placed peripherally around the matrix and invade preferentially along the neurites toward the DRG. This method allows for rapid evaluation of multiple treatment conditions, with very high assay success rates and reproducibility.

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is the sixth most common cancer in the US, with 10,000 deaths per year nationally and 300,000 deaths per year worldwide¹. The overall prognosis for HNSCC has remained unchanged at 50% for the past several decades. Perineural invasion (PNI) is one of the most prominent pathological features that portend a poor prognosis in patients with HNSCC. Unfortunately, PNI is a frequent occurrence in HNSCC and can be found in up to 40% of HNSCC patients^2,3.

PNI is the process by which malignant cells track along nerves to adjacent tissues, allowing for higher rates of local and distant spread. Accordingly, PNI-positive HNSCC tumors have higher rates of locoregional recurrences and distant metastases, resulting in lower overall survival compared to HNSCC patients without PNI^4-8.

Although the treatment of patients with PNI is typically maximized by employing surgery, radiation, and chemotherapy, the overall survival rates of these patients are still decreased by up to 40% compared to patients without PNI^9-11. Thus, it is clear that the current treatment modalities for HNSCC are ineffective in improving the adverse prognosis associated with PNI. The approach of developing targeted therapy against PNI in HNSCC has been hindered by the poor understanding of the factors that regulate this process. This is, in part, a consequence of the lack of a consistent in vitro model for the study of PNI in HNSCC.

In recent years, several groups have been utilizing an in vitro model for studying PNI in predominantly pancreatic and prostate cancers^12-19. This model uses the neurites generated from dorsal root ganglia isolated from mice or rats as a surrogate for large-nerve invasion. The dorsal root ganglia are fixed in a factor-depleted semisolid matrix, which is a solubilized basement membrane protein mixture secreted by Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells. This matrix allows for the outgrowth of the neurites and the tracking of single cancer cells along these neurites. Described here is the adaption of this model for the examination of PNI in HNSCC.

1. הכנת בינוני תרבות ומנות (10 דקות)

1. הוספת 100 μL של בינוני הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) עם 10% בסרום שור העובר (FBS) אל הבארות של צלחת 96-גם V-התחתון.
2. הסר בקבוקון-טרום aliquoted של כ 100 μL של מטריקס חצי קשות מהמקפיא 20 ° C, ולמקם אותו ישירות על הקרח.
   הערה: האם זה לפני השורש הגבה גנגליון (DRG) קציר כי המטריצה ​​למחצה לוקחת כ -30 דקות להגיע במצב נוזלי על קרח, אשר הוא הכרחי עבור השלבים הבאים. אי שמירת המטריצה ​​חצי הקשה על קרח בכל העת יגרום אגל מטריקס באיכות ירודה.
3. זכוכית תחתונה תווית צלחות תרבויות עם דיו קבע, יצירת מזהים ייחודיים בכל אחת מארבע הפינות על המשטח התחתי של הצלחת. מניחים את הצלחות בצד הימני על קרח כדי לקרר את פני צלחת.
   הערה: כל תשואות עכבר 32 - 40 DRG, ואז הם קוראים אותם מ -1 עד 40. אין צורך לאשר מראש צמרמורת piללטף טיפים, עצות מצוננות תתחממנה במהלך הצבת טיפות מטריקס, פוטנציאל מציגים הבדלים עקביים מטריקס.

2. Dissection של Murine DRG (45 דקות)

1. להרדים עכבר בעירום athymic לפי פרוטוקולים מעבדה ספציפית, כגון באמצעות שימוש בתא CO ₂ פתיחת בית החזה.
2. הגדר באזור לנתיחה ומיקרוסקופ. השתמש התחתון נקי, מעוקר, ושטוח מכולות פוליסטירן עבור צינורות חרוטי 15 או 50 מ"ל.
   הערה: בנוסף, הם מתאימים לשימוש כמו פני השטח לנתח, כפי שהם זולים חד פעמיים, ולאפשר קיבוע של עמוד השדרה באמצעות סיכות או מחטים. השתמש רק מכשירים מעוקרים ומחטים.
3. תחת חזון טבעי, לעשות חתך אורכי לאורך עמוד השדרה מן השורש של הזנב עד הראש של העכבר עם זוג מספריים בסדר ישר או עקום.
4. השתמש באותו מספריים לפער רוחבי מתחת sacrעמוד השדרה אל. לנתח את שני הצדדים של עמוד השדרה כל הדרך עד לבסיס הגולגולת באמצעות מספריים. בשלב זה, להבטיח כי עמוד השדרה הצווארי הוא transected cranially ככל האפשר עם מספריים.
5. להבחין בסוף צוואר הרחם של עמוד השדרה מתחת למיקרוסקופ ההפעלה בהספק נמוך. חוט השדרה הלבן בולט באמצע טבעת גרמית, המוקפת כמויות משתנות של שרירי paraspinal ורקמות רכות.
6. פיצול הגבה או היבט המעולה של 2 ראשון - גופים בחוליות 3 במספרי האביב מיקרוסקופים. באמצעות פעולת האביב של המספריים, פתח גרמי ראשוני זה לחתוך על מנת להבטיח כי לנתיחת גוף השדרה התרחשה על קו האמצע. המשך במרווחים קטנים לכיוון עמוד שדרת עצם העצה, ולאחר מכן לחצות את עמוד השדרה על ידי השלמת הקיצוצים הזהים על היבט הגחון או נח של הגופים בחוליות.
   הערה: אי להבטיח לנתיחת קו האמצע של עמוד השדרה הגרמי יגרום תשואת DRG נמוכה.
7. בשעת תינקודת ים, עמוד השדרה מחולק לשני חצאים. מניח עמוד שדרה חמה אחד הצידה, עם חוט השדרה במקום פונה כלפי מטה על צלחת סטרילי.
   הערה: השארת חוט השדרה במקום תמנע DRGs מהתייבשות, כמו DRGs עמוק אל חוט השדרה.
8. Secure משני צדי עמוד השדרה החם האחר עם שתי מחטים 18-מד בפלטפורמת לנתח הקלקר. החל בסוף צוואר הרחם (שהוא לכאורה כי עמוד השדרה צרה, את DRG קרוב אחד לשני, ויש הוספות צלעות), בעדינות לקלף בחזרה את חוט השדרה מכ -4 רמות שדרה.
9. שים את עצבי תחושה (בדרך כלל שתיים) המחברים את DRG. באזור שבו העצבים להכניס אל DRG, בעדינות לתפוס את fascia שמסביב עם מלקחיים מיקרוסקופיים. לנתח לקצץ fascia זה רקמת עצב אחרת עם המספריים באביב המיקרוסקופים לשחרר את DRG. הכחשה עדינה תביא את DRG מתוך עמדתה בתוך עמוד השדרה הגרמית.
   הערה: הגדלהכוח מיקרוסקופ בשלב זה מועיל. קראש פגיעה DRG יגביל את הצמיחה באופן משמעותי של neurites. זה הוא נמנע מעולם ידי אחיזת DRG ישירות, אלא על-ידי אחיזת fascia שמסביב.
10. חותך את העצבים ההיקפיים (את DRG יש בדרך כלל עצב אחד פריפריה, שהוא יחסית עמוק לתצוגת לנתח) עם המספריים באביב המיקרוסקופים כדי לשחרר את DRG.
    הערה: זה הכי קל לברר היכן לקצות העצבים ואת DRG מתחיל בעוד על המתח, כך עושה זה לחתוך קרוב ככל האפשר אל DRG בשלב זה הוא אידיאלי. ברגע סניף דיסטלי זה נחתך, הענפים הפרוקסימלי הם גזומים גם כן.
11. חתוך את DRG של כל סיבי עצב תועה או חיבורים fascial עם מספריים באביב מיקרוסקופיים. לאחר בידוד נאות, למקם את DRG לתוך המדיום-בטמפרטורת החדר בתוך צלחת V-התחתון 96-היטב.
    הערה: הצבת רקע כהה מתחת לצלחת עושה לדמיין את DRGs הלבן מ"מ תת קל. רק למקם DRG אחד EACh היטב; בדרך זו, ניתן להסביר להם עבור בקלות יותר בשלבים הבאים.
12. חזור על תהליך זה כל הדרך למטה-שדרה חמה אחד ואחר כך את השני. כל צד מניב 16 - 20 DRGs, בסך של 32 - 40.
    הערה: אם יש פחות DRGs מזה, דיסקציה של עמוד השדרה צריכה להתבצע cephalad נוסף ו / או caudally. DRGs להיות פחות ופחות ברור כשל אחד ממשיך caudally.

3. הכנת טיפות מטריקס חצי קשות (<1 דקות לכל צלחת)

1. הסר כוס אחת צלחת היטב בתחתית מקרח ומניח אותו על בלוק קרח מתחת למיקרוסקופ ההפעלה. ודא aliquot של מטריקס נשאר על הקרח בכל עת.
2. מניחים טיפה 1.5-μL של מטריקס בכל אחת מארבע פינות של צלחת זכוכית התחתונה עם micropipetter 2-μL או 10 μL, עוזב במרחק לפחות גדול כמו אגל עצמו מקצה הכוס היטב.
   1. הנח את קצה פיפטה ישירות על גביהזכוכית בזווית של 45 מעלות. לאט pipet המטריצה. לאט להתרחק מתחתית הכוס אחרי מטריקס עוסקת על הצלחת.
      הערה: מתח הפנים בין מטריקס והזכוכית צריך ליצור אונה מושלמת בכל פעם.
   2. עצור pipetting רק לפני הטיפ הוא ריק, כי הזרקה מכוונת של אוויר לתוך אגל מטריקס עושה את הקוטר של אגל מטריקס הרבה יותר קשה להסיר.
      הערה: שימוש יד שנייה לייצב את היד pipetting מקלה מיקום מדויק יותר.

4. קלטי DRG לטיפות מטריקס חצי קשות (<2 דקות לכל צלחת)

1. השאירו את הצלחת עם טיפות מטריקס בקצרה בטמפרטורת החדר (~ 1 דק '). זה מעט מתקשח המטריצה, מה שמקל על המיקום המדויק של DRG.
2. סקופ (לא לתפוס) את DRG בעדינות עם מלקחיים מיקרוסקופיים סגור ביד שמאל. שוב, רקע כהה נגד קטן, לבןDRG מקלה ויזואליזציה. מעבירים את DRG אל קצה מחט 21-מד ביד ימין. העברה זו תעזוב תקשורת שיורית על המלקחיים.
3. הכנס בעדינות את DRG לאמצע אגל מטריקס באמצעות מחט 21-מד (איור 1). רוב הזמן, את DRG תשחרר בקלות לתוך המטריצה ​​ולאחר מכן ניתן למקם באופן מרכזי עם המחט.
   1. אם DRG מקל על המחט, להשתמש במלקחיים המיקרוסקופים לדחוף את DRG הנחה של המחט לתוך אגל מטריקס. וויק משם תקשורת עודפת המלקחיים המיקרוסקופים עם מעבדת לנגב.
      הערה: היכרות עם מדיה מטריקס תשנה את הקוטר, נפח, ועקביות של assay. בלוק קרח עם צבע או בכתב צבעוני מספק בניגוד רקע, דבר המקל להדמיה של תהליך עדין זה.
4. לאחר הצלחת יש כל ארבעת DRGs, לבצע בדיקה סופית על מנת להבטיח כי DRG נמצא במרכז של רביב מטריקס. בצע התאמותלפי הצורך עם מחט 21-מד.
5. מעביר את הצלחת הושלמה על 37 מעלות צלזיוס חממה. זה יהיה לגבש המטריצה ​​למחצה ולתקן את DRG בעמדה.
6. חזור על תהליך זה עבור כל DRGs. מניח טיפות מטריקס ריקות ללא DRG כמו השליטה השלילית.
7. הוסף 4 מ"ל של DMEM עם 10% FBS התקשורת על כל צלחת זכוכית התחתונה לאחר השלמת כל צלחות וחשיפתם אל 37 ° C חממה עבור 3 דקות לפחות. מניחים את הצלחת בזווית קלה ולאט לאט מוסיפים את המדיום, כך שהוא מגיע בהדרגה במגע עם יחידות מטריקס-DRG.
   הערה: אם המדיום הוא הוסיף מהר מדי ולא חזק, מטריקס ו / או DRG יכול להיות וחילצה.
8. אחסן את המבחנים ב 37 ° C החממה עבור 48 בא - h 72.
   הערה: בדיקה תקופתית של מבחני יראת תולדה היקפית של neurites לכיוון קצה מטריקס (איור 2). כאשר neurites הם גבוהים יותר משלושה רבעים מן הדרך אל מטריקס, זהראוי צלחת התאים.

5. הכנת הראש ותאי סרטן הצוואר

הערה: תא קווים שאינ ראש והתאים הסלולרי קרצינומה קשקשית צוואר ניתן להשתמש בעיצוב ניסיוני זה.

1. לשמור על שורות תאי קרצינומה של תאי קשקש DMEM עם 10% FBS צלוחיות העדיפו או תרבות מנות בתוך 37 ° C חממה. כדי להכין תאים לניסויים, יניקה כל המדיום מבקבוק התרבות או הצליח ולשטוף את זה פעמים עם PBS. להשעות את התאים על ידי הוספת כמות מתאימה של טריפסין 0.025% במשך 5 דקות, ואחריו DMEM עם 10% FBS. פיפטה 4 מ"ל של תערובת תאים ומדיה לתוך תרבות מנות 6 מ"ל.
   הערה: צלחת תרבות 6 מיליליטר מספקת די והותר תאים, גם כאשר פחות מ -50% ומחוברות.
2. לחשוף את שורות תאי HNSCC לתנאים שונים 24 שעות לפני מכתים ציפוי על assay DRG. Re-dose תנאי פעם התאים הם מצופים לשמור על environme עקביתNT.
   הערה: הוספת נוגדנים, גורמי גדילה, ציטוקינים, או מולקולות אחרות את כלי תרבית תאי 1 - 2 ימים לאחר עכבר לנתיחת השתלה של DRG לתוך המטריצה.
3. להוסיף כתמי תא פלורסנט 1 שעות לפני ציפוי התאים (2 - 3 ימים לאחר הקציר DRG והשתלת לתוך המטריצה).
   הערה: כתמים מסוימים משמשים כאן לעבור בחופשיות דרך קרום התא; עם זאת, לאחר מגיבים עם קבוצות תיאול תאיים, הכתם לא הוסר בתוך התא מועבר לתאי הבת. המכתים מאוד מקל להדמיה בתוך המבחנים. כתמים זמניים אלה הם אידיאליים עבור אלה מבחנים כי הקרינה קיימת במשך 2 - 3 ימים, המהווה את מסגרת הזמן של הניסויים הללו. זה גם מאפשר השימוש בצבעים רבים ושונים מייתר את הצורך ביצירת שורות תאי חלבון-טרנספקציה ניאון.
   1. הכן 10 מיקרומטר של פתרון לצבוע ידי ערבוב 2 μL של 10 מ"מ כתמים המניות תא 2 מ"ל של סרום ללא DMEMלכל מצב תא. לחמם זה ל -37 מעלות צלזיוס לפני הוספתו התאים.
   2. הסר את מדיום התרבות בתוך הצלחת 6-המ"ל, עוזב את תאי HNSCC החסידים על הצלחת. הוסף 2 מ"ל של בופר פוספט (PBS) ולהסיר 2 מ"ל של הכתם תא 10 מיקרומטר / DMEM סרום המתווספים כל צלחת
   3. מחזירים את הצלחת תרבות 6 מ"ל עם כתם התא אל 37 ° C חממה עבור 40 דקות.
   4. לאחר 40 דקות, לשאוב את המדיום. הוסף 2 מ"ל של PBS ולאחר מכן לשאוב אותו. הוסף 1 מ"ל של טריפסין 0.025% על כל צלחת ולהחליף אותם 37 ° C חממה.
   5. הוסף 2 מ"ל של DMEM עם 10% FBS לאחר 3 - 5 דקות ולהעביר את התאים מושעה צינור חרוטי 15 מ"ל. ספין התאים מחדש תלויה אותם 1 מ"ל של DMEM עם 10% FBS.
   6. ספירת התאים עם hemocytometer או נגד תא אוטומטי, ולאחר מכן להוסיף DMEM עם FBS 10% כדי ליצור ריכוז תא סופי של 300,000 תאים לכל מיליליטר.

6. ראש הציפוי ו- Nתאים סרטניים Eck

1. הסר את צלחות הזכוכית תחתונה עם מבחני מטריקס-DRG מן החממה.
   הערה: שוב, הם מתאימים כאשר neurites הם לפחות 75% מן הדרך עד לקצה של מטריקס, אשר מתרחש בדרך כלל לאחר 2 - 3 ימים. הדבר בא לידי ביטוי הכי טוב באמצעות לפחות מטרה 10X.
2. לשאוב את המדיום בתוך צלחת זכוכית התחתונה. לחלוטין לשאוב את המדיום בתוך הכוס גם מבלי להסיר את היחידות מטריקס-DRG.
3. צייר את 200 μL של 300,000 תאים / מ"ל ​​בינוני באמצעות pipet 200 μL. מניחים שתי טיפות של התאים על פני כל assay מטריקס-DRG. בצע פעולה זו עבור כל אגל מטריקס, יצירת ארבע חזרות על כל תנאי תא על צלחת אחת.
   הערה: צורת חצי הכדור של המטריצה מאפשרת לתאים להתיישב טבעת לאורך בפריפריה של assay (איור 3 א, 3 ב איור). מציאת pipet עם הדק חלק עושה מיקום של מדי טיפות הרבה יותר קל.
4. אשר מספר di תא דומיםstribution תנאי התאים השונים תחת מיקרוסקופ 4X.
5. מניחים את הצלחות זכוכית התחתונה לתוך 37 ° C חממה כ -60 דקות. הערה: למרות שיש רק נפח קטן של תאים ומדיה (~ 150 μL), המבחנים שלא יתייבשו עד כמה שעות של זמן חממה שחלפו.
6. לאחר 60 דקות, בעדינות להוסיף 4 מ"ל של DMEM עם 10% FBS לאורך דפנות של צלחת זכוכית התחתונה.
   הערה: במשך תקופה של זמן, התאים חלקית לדבוק בתחתית הצלחת, ואת שיטת הוספת המדיום לא מפריע התאים. סוגי תאים שונים להפוך לקחת יותר או פחות זמן להתחיל לדבוק צלחת זכוכית התחתונה.
7. חלף כל תרופות אקסוגניים או גורמי גדילה בשלב זה לשמור על רמות הריכוז הקודמות.
8. מחזיר את המבחנים אל 37 ° C החממה, למעט כאשר נבחנים הם מיקרוסקופי. לכמת את התוצאות של assay זה על ידי הדמיה מיקרוסקופית. בקצרה, לספור את קווצות הפלישה perineural עםארבעה רביעים באמצעות תמונה מיקרוסקופית 4X.
   הערה: מיקרוסקופ עם יכולות אובייקטיביות קרינת 4X הוא נאות לפוטו-המתעד את המבחנים. גודלו של מבחני משתלב יפה בתוך השדה של מטרת 4X, אשר מפורטת מספיק כדי ללכוד את האזורים הבודדים של פלישת perineural. פלישת Perineural מתבררת תוך 24 שעות, אבל מעבר 48 שעות, על שלמות המבחנים מתחילה להיחלש, כמו התאים הסרטניים לחלק לאורך בפריפריה של מטריקס לפלוש. מעבר 48 שעות, יש גם בזרימת ניכר פיברובלסטים מן DRG, אשר מטשטש להדמיה באמצעות מיקרוסקופ brightfield. לכן, רצוי-מסמך צילום התוצאות עם מיקרוסקופיה 4X לפחות פעמים במהלך חלון זה (לדוגמא, ב 24 ו 48 שעות לאחר ציפוי התאים הסרטניים). שימו לב כי אלו הם מבחני 3-ממדי, וזה קשה התמונה לחלוטין את assay כולו. רוב הפלישה perineural מתרחשת במטוס מתחתית הצלחת, כאשר tהוא התאים המוטבעים המטריצה ​​מעט מעל בתחתית הצלחת. בגלל שאבירון קרוב אופקי, הרוב המכריע של neurites עם תאים סרטניים נלכדים בתמונה אחת ברמה ב 4X.

לאחר דיסקציה של DRG וההקצאה בתוך אגל מטריקס, את המראה של assay צריך להידמות הערה באיור 1. כי DRG אינו עגול באופן מושלם, אבל הוא מרוכז בתוך אגל מטריקס. זה מאפשר את התולדה של neurites ב 360 מעלות, הראתה חלקית באיור 2. שים לב כי חלקים מסוימים של DRG שולחים neurites מהר במספרים גדולים יותר מאשר לאחרים, בדרך כלל מתאימים שבו efferent וענפי עצב מביאים נכנסו ויצאו DRG, בהתאמה. אנו להסביר את זה ובגין הפרשים גודל בין DRGs באקראי על ידי ציפוי DRGs בקבוצות של 4 ולאחר מכן באופן אקראי הקצאת צלחת שניתן לכל מצב התא.

כפי שתואר לעיל, אנו צלחת שורות תאי HSNCC פעם neurites הרחיב לפחות ¾ של הדרך עד לקצה של מטריקס, שהוא בדרך כלל עליום 3. התאים הוסיפו ליצור טבעת היקפית סביב מטריקס (איור 3 א). אנחנו מכן לצלם את המבחנים ביום 4 (איור 3B) והיום 5 (איור 3c). שורת התא שמוצגת כאן (פאדו) מדגימה יכולת מעל ממוצע לעקוב אחרי תוואי neurites. שורת תא SQCCY1 שמוצגת באיור 4, לעומת זאת, מציגה לא מעט על מנת נטייה לפלוש מבחנים.

בעת שימוש קו סלולארי חדש, זה לייבא לנצל מספר פקדים שליליים לבחון איך זה קו תא מסוים מתנהג ברחבי assay. ראשית, תאי צלחת סביב assay "ריק" מורכב מטריצה לבד (איור 5). כל שורות התאים במעבדה שלנו בחנה לחלק פעיל ברחבי מטריקס אבל לא נכנסות או משתרעים על פני החלק העליון של מטריקס. כאשר תאים מופרזים נותרים על גבי המטריצה, לא יכולה להיות צמיחה משמעותית מעל המטריצה. זה מדגיש את הצורך לדוארNsure כי כמו תאים רבים נופלים לפריפריה של מטריקס ככל האפשר, ולא להישאר לנוח ולחלק על גבי המטריצה. ניתן להשיג זאת על ידי הקשה בעדינות על הצלחות לפני התאים לדבוק או על ידי pipetting כמויות קטנות של מדיה ישירות על גבי אגל מטריקס פעם התאים החלו לדבוק צלחת זכוכית.

פקד שני שלילי, שבו התאים הם מצופים באותו היום כי DRG מושם בתוך המטריצה, ניתן להפעיל. מטרת גישה זו היא להדגים שזה לא אטרקציה neurotropic שמניע את תאי אל DRG, אלא שנוכחות של neurites היא חובה. יתר על כן, כאשר תאים סרטניים מתגוררים יחד בפריפריה של מטריקס עבור יותר מ -2 ימים, שפת מטריקס הופכת ברורה. המטריצה ​​אז מתחילה להרים של מתחתית הזכוכית ניתן למצוא ריחוף ללא בתקשורת כעבור זמן קצר. מסיבה זו, פרוטו זהcol מתאר ציפוי תאי HNSCC פעם neurites הרחיב 75% של המרחק לקצה של מטריקס.

ישנן אפשרויות רבות מספור לכימותי התוצאות של מה הם ויזואלית הבדלים מאוד לכאורה בין מבחנים. בשיטה כזו, את התמונות של מבחנים ומחולקת לארבעה רבעים עם אנכים וקו אופקי (איור 6). נקודה אחת מוקצה לכל ברבע הזה יש לפחות מחרוזת אחת PNI. אם PNI חורג 50% מן הדרך מהקצה של המטריצה ​​אל DRG, אז 2 נקודות מוקצות במקום. בדרך זו, ציון של 0 - 8 נקודות ניתן להקצות. היתרון העיקרי בשיטה זו הוא כי מבחנים שיש יותר מדי יחידות PNI לספור ניתן להעריך במהירות. החיסרון הוא כי הוא אינו מבטא את מידת מספקת של PNI (כלומר, מד גובה עם 1 neurite עם הפלישה 100% של המרחק אל DRG מקבל אותו ציון (2) כמו qu adrant עם 10 neurites דומה-פלש). השוואה בין תמונות brightfield ו פלורסנט עושה מערכת זו קלה מאוד, אפילו עם בזרימת פיברובלסטים משמעותית.

ניקוד לדוגמא מוצג באיור 6. באמצעות שיטת הניקוד של ארבעה רביעים זה במשך 3 איור, 0 נקודות, 2 נקודות, ו -7 נקודות חולקו עבור 3a לוחות איור, איור 3 א, וכן 3c איור, בהתאמה. איור 4 קיבל ציון של 2 נקודות ו -2 נקודות 4a לוחות איור ואיור 4b, בהתאמה. מנתוני לוח 1 מתאר את התוצאות של מספר ניסויים באמצעות שורות תאים פאדו ו SQCCY1. שים לב כי גם עם סולם לדירוג מוגבל כגון זה, הבדלים סטטיסטיים-משמעותיים הציונים של ארבעה רביעים הממוצעים מתקבלים בקלות באמצעות מבחן t דגימות העצמאיות.

: לשמור-together.within-page = "1">
איור 1. Assay-מטריקס DRG. מיקום נכון של גנגליון השורש הגבי בתוך אגל מטריקס, מוצג עם מיקרוסקופיה brightfield ב 4X. סרגל קנה מידה מייצג 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2. תולדה של neurites. Neurites נעדרים ביום 0 מיד לאחר הצבת DRG ב אגל מטריקס (א). במשך יום 1 (ב), תולדת neurite ניכרה ב 10X על מיקרוסקופ brightfield. צמיחת neurite ממשיכה ביום 2 (ג) ויום 3 (ד); עם זאת, שים לב בזרימה של פיברובלסטים. Scאייל עמודה מייצגת 0.1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3. Assay DRG-מטריקס עם פאדו. הראש וגרון הקו קרצינומה של תאי קשקש פאדו הוסיף שולי סביב assay ביום 3 (א), שמוצג ניאון ירוק מיקרוסקופיה brightfield בפלישה עצבית 4X המתקדם נתפס ביום 4 (ב) והיום 5 (ג). סרגל קנה מידה מייצג 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4. DRG- Assay מטריקס עם SQCCY1. ראש וקו תא צוואר קשקש SQCCY1 הוסיף ביום 4 (א), שמוצג brightfield ו מיקרוסקופ פלואורסצנטי ירוק ב 4X. שימו לב את שורות תאים הן לא בקיאות ליום פלישת perineural כמו פאדו, אפילו ביום 5 (ב). סרגל קנה מידה מייצג 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Assay מטריקס איור 5. עם פאדו. ראש וקו תא קרצינומה קשקשית הצוואר פאדו הוסיף סביב אגל מטריקס ללא DRG על brightfield יום 3. מיקרוסקופ פלואורסצנטי ירוק (4X) הראו ביום 4 (א). ראוי לציין, כי התאים הסרטניים לא נכנסים מטריקס או לגדול על גבי זה, אפילו ביום 5 (ב). סרגל קנה מידה מייצג 1 מ"מ.ttp: //ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55043/55043fig5large.jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 6. שיטת ארבעת הרביעים עבור כימות Assay. נקודה אחת מוקצה לכל ברבע עם פחות PNI מ -50% של המרחק מהקצה של המטריצה ​​אל DRG. 2 נקודות מוקצות כאשר PNI חורג 50%. הדוגמא הראשונה (א) תקבל ציון של 5 (1 נקודה עבור כל רביע עבור פחות PNI מ -50%, למעט הימני התחתון, אשר יש PNI חורג 50%, שבו 2 נקודות בקיע). הדוגמה השנייה (B) הוא הבקיע כמו 8 (א PNI מעבר 50% בכל אחד מארבעת הרביעים). סרגל קנה מידה מייצג 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי נiew גרסה גדולה יותר של דמות זו.

לוח 1. השוואה של PNI בין פאדו ו SQCCY1. ממוצע ציוני ארבעת הרביעים כפי שמוצג באיור 6 בין פאדו שורות תאים ו SQCCY1 ב 24 שעות (יום 4) ו 48 שעות (יום 5) לאחר התאים היו מצופה ברחבי assay-מטריקס DRG. השוואות נעשות באמצעות הסם העצמאיple מבחן t והציג עם סטיית תקן (SD) ו- P-ערכי.

צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול

הצעדים החשובים ביותר בתוך פרוטוקול זה הם לנתיחת מיצוי המדויקת של גרעיני שורש הגבה. חיתוך רוחב תקין של עמוד השדרה ועל חלוקת קו אמצע-אורך לשני חמי קוצים הם קריטיים קבלה מספר גדול של DRG. במהלך דיסקציה של DRGs הפרט, הגנגליון לא צריך להיות מטופלים באופן ישיר, אלא fascia שמסביב צריך להיתפס עם מלקחיים מיקרוסקופיים. אי ביצוע הוראה זו תיגרם פגיעה למעוך של DRG, המהווה את הגורם העיקרי סביר של כישלון עבור תולדה neurite. זה הרבה יותר טוב לתת-לקצץ את רקמות עצביות שמסביב במהלך לנתיחה מ לסיכון יתר טיפול DRG וקבלת אין צמיחה neurite ב assay.

שינויים ופתרון בעיות

פרוטוקול הניסוי כמתואר לעיל משקף את אופטימלית נפגשhodology הוקמה ממספר רב של התאמות פרוצדורליים עשו על פני מספר שנים. רשום ישירות מתחת למדרגה התואמת בקטע הפרוטוקול הוא מספר הערות ואת החסרונות שכתוצאה מניסיונם של הכותבים בעת שימוש במתודולוגיה זו. בהתחשב במספר השלבים הכרוכים, יש אכן שינויים רבים שניתן לעשות כדי בפרוטוקול זה על ידי חוקרי העתיד. כמו ניסיון עם שינויים אלה גדל, הוא צפוי כי אמצעי נוסף של פתרון בעיות יפותח בהתאם להעדפות של צוות החקירה.

מגבלות של הטכניקה

יש שלוש מגבלות משמעותיות בטכניקה זו. הראשונה היא כי מאוד neurites הגלם משמש כתחליף פלישה עצבית גדולה, וזה מה פתולוגים להתבונן בדגימות גידול. לא ידוע מה התפקיד של neurites, בניגוד הנוירונים, הם in vivo כי זיהוי perineuriteפלישה היא מעבר ליכולות של בחינת histopathological שיגרתית. שנית, פלישת perineural היא צורה של פלישה של רקמות רכות, כי לא יכול פשוט לערב תאים סרטניים לבין הנוירון סמוך, כפי מדומה assay זה. כפי גורמים כגון, אקסוגניים יליד אל המילייה הגידול במבחנה חסר assay זה. לבסוף, פרק הזמן שבמהלכו PNI ניתן ללמוד מוגבל לכ 48 שעות בשל השילוב של בזרימת פיברובלסטים ואובדן שלמות מטריקס. בדרך זו, שורות תאים יעילות בפלישה עצבית אבל הם מפריד איטי ו / או פולש תחסרנה וכפי הנראה כדי לא להיות בקיא בכל PNI.

משמעות של הטכניקה ביחס קיימים / שיטות אלטרנטיביות

למיטב ידיעתנו, זהו מודל במבחנה רק העומדים כיום לרשות לבחון PNI ב HNSCC. בהתחשב התדירות שבה PNI מתרחשת HNSCC ואת הידע המוגבל של מנגנוניםבמתכונתה הנוכחית, בשיטה זו יש יתרון מכמה סיבות. ראשית, יש שיעור הצלחה גבוה מאוד ואת שחזור מצוין. שעת הניסוי הכוללת היא גם קצרה יחסית לעומת פרוטוקולים דומים ^12,17-19. לבסוף, עם מספר הרב של מבחנים כי ניתן להפיק מן עכבר אחת, ניתן לבדוק תנאים רבים עם משכפל מדעי-מתאים. השילוב של הגורמים הללו מאפשר הערכה המהירה של תנאים שונים רבים עם תוצאות עקביות.

במקביל, האיכות הגבוהה של assay מאפשרת בחינה מדוקדקת יותר של האינטראקציה בין התאים הסרטניים ואת neurites. שימוש הדמיה לחיות תאים מאפשר ייסוף תהליך התולדה neurite ואת פלישת תא HSNCC בצורת וידאו הזמן לשגות. התוספת של תאים מוכתמים fluorescently יוצרת בידול ברור מאוד בין התאים הסרטניים וחומר רקע, כגון פיברובלסטים ו ou neurite הצפוףtgrowth (אשר לזרוח אוטומטי אדום). בין אם בעקבות פרוטוקול זה או אלה המתוארים על ידי אחרים, תכנון הניסוי הכללי הזה נמצא בחיתוליו יחסית, ויש רחוקה מלהיות סטנדרט הזהב המחקר במבחנה של PNI. מסיבות אלה, יותר גישות assay זה כי מתואר בפירוט, כך גדל ההזדמנות לפיתוח השיתופי של מתודולוגיה אידיאלי.

יישומים עתידיים או כיווני לאחר מאסטרינג טכניקה זו

בדיוק כפי שיש מספר גישות שונות להגדרת המבחנים, יש כמה גישות למדידת התוצאות. בטקסט לעיל, שיטה אחת לכימות המידה במהירות של פלישת perineural בכל assay הוצגה. זה אידיאלי עבור הקרנת ההשפעה של מסלולים שונים רבים על PNI, במיוחד בהתחשב בעובדה אפשר לבודד 32 - 40 DRGs לכל עכבר. ישנן מספר שיטות הדמיה מתקדמות כדי להעריך PNI,לרבות הסכום של קרינה באזור נתון, המרחק וקצב פלישת תא, ומספר הגלם של תאים בתוך assay. לאחר החלק הדינמי של הניסוי נגמר, התאים בתוך assay ו / או את supernatant ניתן לאסוף גם עבור ניתוח מולקולרי נוסף.

המתודולוגיה ניסיוני זה מציע הזדמנות להבהיר מנגנונים מעורבים PNI של HNSCC וסוגי סרטן אחר. ידע זה יכול לנהוג פיתוח תרופות למקד את המסלולים של PNI, אשר, בעת הנוכחית, חסרים HNSCC. מיקוד ספציפי של PNI כאשר מזוהה תכונת פתולוגי לוואי עלול לייתר את הצורך בטיפולי אדג'ובנט שאינם ספציפיים, כגון הקרנות וכימותרפיה, כי מנוצלים כיום.

The authors have no competing financial interests.

This work was supported in whole by funding from the NIH through the R21 grant, "Mechanisms of Perineural Invasion in Head and Neck Cancer" and the NCI T32 training grant, "Post-Doctoral Research Training in Head and Neck Oncology (2T32CA060397-21)." Thank you to Richard Steiman, MD, PhD and lab staff.