نموذج للمحيط بالعصب الغزو في الرأس والرقبة قشري سرطان الخلايا

Perineural invasion (PNI) is a common feature of head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC), conferring lower survival rates. Its mechanisms are poorly understood. Utilizing neurites generated from murine dorsal root ganglia confined to a semisolid matrix, the pathways involved in the PNI of HNSCC cell lines can be investigated.

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, radiation, and chemotherapy, locoregional recurrences and distant metastases occur at higher rates, and overall survival is decreased by 40% compared to HNSCC without PNI. In vitro studies of the pathways involved in HNSCC PNI have historically been challenging given the lack of a consistent, reproducible assay. Described here is the adaptation of the dorsal root ganglion (DRG) assay for the examination of PNI in HNSCC. In this model, DRG are harvested from the spinal column of a sacrificed nude mouse and placed within a semisolid matrix. Over the subsequent days, neurites are generated and grow in a radial pattern from the cell bodies of the DRG. HNSCC cell lines are then placed peripherally around the matrix and invade preferentially along the neurites toward the DRG. This method allows for rapid evaluation of multiple treatment conditions, with very high assay success rates and reproducibility.

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is the sixth most common cancer in the US, with 10,000 deaths per year nationally and 300,000 deaths per year worldwide¹. The overall prognosis for HNSCC has remained unchanged at 50% for the past several decades. Perineural invasion (PNI) is one of the most prominent pathological features that portend a poor prognosis in patients with HNSCC. Unfortunately, PNI is a frequent occurrence in HNSCC and can be found in up to 40% of HNSCC patients^2,3.

PNI is the process by which malignant cells track along nerves to adjacent tissues, allowing for higher rates of local and distant spread. Accordingly, PNI-positive HNSCC tumors have higher rates of locoregional recurrences and distant metastases, resulting in lower overall survival compared to HNSCC patients without PNI^4-8.

Although the treatment of patients with PNI is typically maximized by employing surgery, radiation, and chemotherapy, the overall survival rates of these patients are still decreased by up to 40% compared to patients without PNI^9-11. Thus, it is clear that the current treatment modalities for HNSCC are ineffective in improving the adverse prognosis associated with PNI. The approach of developing targeted therapy against PNI in HNSCC has been hindered by the poor understanding of the factors that regulate this process. This is, in part, a consequence of the lack of a consistent in vitro model for the study of PNI in HNSCC.

In recent years, several groups have been utilizing an in vitro model for studying PNI in predominantly pancreatic and prostate cancers^12-19. This model uses the neurites generated from dorsal root ganglia isolated from mice or rats as a surrogate for large-nerve invasion. The dorsal root ganglia are fixed in a factor-depleted semisolid matrix, which is a solubilized basement membrane protein mixture secreted by Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells. This matrix allows for the outgrowth of the neurites and the tracking of single cancer cells along these neurites. Described here is the adaption of this model for the examination of PNI in HNSCC.

1. إعداد متوسطة الثقافة وأطباق (10 دقيقة)

1. إضافة 100 ميكرولتر من Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) إلى آبار لوحة-V القاع 96-جيدا.
2. إزالة aliquoted ما قبل-قنينة ما يقرب من 100 ميكرولتر من المصفوفة نصف صلبة من الفريزر 20 ° C ووضعه مباشرة على الجليد.
   ملاحظة: هل هذا قبل العقدة الجذرية الظهرية (DRG) الحصاد لأن المصفوفة نصف صلبة تأخذ تقريبا 30 دقيقة للوصول إلى حالة سائلة على الجليد، وهو أمر ضروري لخطوات لاحقة. والفشل في الحفاظ على مصفوفة نصف صلبة على الجليد في جميع الأوقات ينتج مصفوفة ذات نوعية رديئة قطرة.
3. التسمية الزجاج القاع الثقافات لوحات بالحبر الدائم، وخلق معرفات فريدة من نوعها في كل من الزوايا الأربع على السطح السفلي من لوحة. وضع لوحات اليمين حتى الجانب على الجليد لتبريد سطح اللوحة.
   ملاحظة: عائدات كل الماوس 32-40 DRG، لذلك تسمية لهم من 1 إلى 40. وليس من الضروري لمرحلة ما قبل البرد بيالحيوانات الأليفة النصائح، ونصائح المثلجة والحارة على مدار وضع قطرات مصفوفة، ويحتمل أن إدخال الاختلافات في اتساق المصفوفة.

2. تشريح الفئران DRG (45 دقيقة)

1. الموت ببطء ماوس عارية athymic حسب البروتوكولات مختبر معينة، وذلك من خلال استخدام غرفة CO ₂ وبضع الصدر.
2. إعداد منطقة تشريح والمجهر. استخدام السفلي نظيفة، معقمة، وشقة الحاويات البوليسترين ل15- أو أنابيب مخروطية 50 مل.
   ملاحظة: بالإضافة إلى ذلك، فهي مناسبة للاستخدام على سطح تشريح، كما أنها غير مكلفة، يمكن التخلص منها، والسماح لتثبيت العمود الفقري باستخدام دبابيس أو الإبر. فقط استخدام الأدوات والإبر المعقمة.
3. تحت الرؤية الطبيعية، وجعل شق طولي على طول العمود الفقري من جذر الذيل في الرأس من الفأرة مع زوج من مقص غرامة مستقيمة أو منحنية.
4. استخدام نفس المقص لفرق مستعرض تحت sacrآل العمود الفقري. تشريح جانبي العمود الفقري وصولا إلى قاعدة الجمجمة باستخدام المقص. عند هذه النقطة، تأكد من أن العمود الفقري العنقي ومقطوع cranially إلى أقصى حد ممكن مع مقص.
5. نلاحظ نهاية عنق الرحم العمود الفقري تحت المجهر التشغيل في الطاقة المنخفضة. الحبل الشوكي الأبيض هو واضح في منتصف حلقة العظمية، والتي تحيط بها كميات متفاوتة من عضلات محيطة بالنخاع والأنسجة اللينة.
6. تقسيم الظهرية أو الجانب العلوي من الأولى 2 - الهيئات 3 الفقري مع مقص الربيع المجهرية. باستخدام إجراء الربيع من مقص، فتح هذا عظمي الأولي قطع للتأكد من أن تشريح الجسم الفقري وقع في خط الوسط. تواصل بزيادات صغيرة نحو العمود الفقري المقدسة، ثم شطر العمود الفقري من خلال استكمال تخفيضات مماثلة على الجانب البطني أو أدنى من الهيئات الفقري.
   ملاحظة: فشل لضمان تشريح خط الوسط من العمود الفقري عظمي سيؤدي إلى العائد DRG أقل.
7. في ثيالصورة النقطة، يتم تقسيم العمود الفقري إلى نصفين. مكان واحد نصفي العمود الفقري جانبا، مع الحبل الشوكي في مكان وأسفل على لوحة العقيمة.
   ملاحظة: إن ترك الحبل الشوكي في مكان منع DRGs من الجفاف، كما DRGs هي عميقة إلى الحبل الشوكي.
8. تأمين حد سواء من الآخرين نصفي العمود الفقري مع اثنين من الإبر عيار 18 على منصة البوليسترين تشريح. ابتداء من نهاية عنق الرحم (والذي هو واضح لأن العمود الفقري أضيق، وDRG هي أقرب إلى بعضها البعض، وهناك الإدراج الضلع)، قشر بلطف ذهابا والحبل الشوكي من حوالي 4 مستويات الفقري.
9. مراقبة الأعصاب الحسية (عادة اثنين) الذي يربط بين DRG. في المنطقة حيث أعصاب تضاف إلى DRG، فهم بلطف اللفافة المحيطة بها مع ملقط المجهرية. تشريح وتقليم هذه اللفافة والأنسجة العصبية الأخرى مع مقص الربيع مجهرية لتحرير DRG. وتراجع لطيف يجلب DRG الخروج من مركزها في العمود الفقري عظمي.
   ملاحظة: زيادةقوة المجهر في هذه الخطوة هو مفيد. سحق إصابة DRG سوف تحد بشكل كبير من نمو neurites التي. يتم تجنب هذا عن طريق أبدا استيعاب DRG مباشرة، ولكن بدلا من استيعاب اللفافة المحيطة بها.
10. قطع الأعصاب الطرفية (في DRG ديه عموما الأعصاب الطرفية واحد، وهو عميقة بالنسبة إلى عرض تشريح) مع مقص الربيع المجهرية للافراج عن DRG.
    ملاحظة: من الأسهل للتأكد حيث ينتهي العصبية وDRG يبدأ أثناء التوتر، مما يجعل هذا الخفض في أقرب وقت ممكن إلى DRG في هذه المرحلة هو المثل الاعلى. مرة واحدة يتم قطع هذا الفرع البعيدة، يتم قطع الفروع القريبة أيضا.
11. تقليم DRG من أي الألياف العصبية الضالة أو المرفقات اللفافي مع مقص الربيع المجهرية. بعد عزل كافية، ضع DRG في المتوسط ​​درجة حرارة الغرفة ضمن لوحة-V القاع 96-جيدا.
    ملاحظة: وضع خلفية داكنة تحت لوحة يجعل تصور شبه ملم DRGs البيضاء أسهل. المكان الوحيد DRG واحد في مجموعة شرق افريقياح جيدا. بهذه الطريقة، يمكن أن تمثل أكثر سهولة في الخطوات اللاحقة.
12. كرر هذه العملية على طول الطريق واحد نصفي العمود الفقري وثم من جهة أخرى. كل جانب غلة 16-20 DRGs، بلغ مجموعها 32 - 40.
    ملاحظة: إذا كان هناك DRGs أقل من هذا، تشريح العمود الفقري يجب أن تنفذ المزيد من رأسيا و / أو caudally. وDRGs تصبح على نحو متزايد تعريف أقل كذلك العائدات واحد caudally.

3. إعداد مصفوفة شبه الصلبة قطرات (<1 دقيقة لكل لوحة)

1. إزالة كوب واحد لوحة القاع جيدا من الثلج ووضعه على كتلة الجليد تحت المجهر التشغيل. تأكد من أن قسامة من مصفوفة تبقى على الجليد في جميع الأوقات.
2. وضع قطرات 1.5 ميكرولتر من المصفوفة في كل من الزوايا الأربع من لوحة من الزجاج السفلي مع 2 ميكرولتر أو 10 ميكرولتر micropipetter، وترك مسافة لا تقل كبيرة مثل قطرات نفسه من حافة الزجاج جيدا.
   1. مكان غيض من ماصة مباشرة علىالزجاج في زاوية 45 درجة. ببطء الماصة المصفوفة. تحرك ببطء بعيدا عن أسفل الزجاج بعد تعمل المصفوفة على لوحة.
      ملاحظة: التوتر السطحي بين المصفوفة والزجاج يجب إنشاء نصف الكرة الكمال في كل مرة.
   2. وقف pipetting للتو قبل طرف فارغ، لأن حقن غير مقصود من الهواء إلى قطرة مصفوفة يجعل قطر الحبرية مصفوفة أكبر بكثير ويصعب إزالتها.
      ملاحظة: استخدام اليد الثانية لتحقيق الاستقرار من ناحية pipetting ليسهل موضع أكثر دقة.

4. الإدراج من DRG في شبه الصلبة مصفوفة قطرات (<2 دقيقة لكل لوحة)

1. ترك لوحة مع قطرات مصفوفة لفترة وجيزة في درجة حرارة الغرفة (~ 1 دقيقة). هذا تصلب قليلا المصفوفة، مما يجعل من الأسهل لوضع دقيق للDRG.
2. سكوب (ما لا يدرك) وDRG بلطف مع ملقط المجهرية مغلقة في اليد اليسرى. مرة أخرى، على خلفية مظلمة ضد صغير، أبيضDRG يسهل التصور. نقل DRG لغيض من إبرة عيار 21 في اليد اليمنى. وهذا النقل ترك وسائل الاعلام المتبقية على ملقط.
3. إدراج بلطف DRG في وسط الحبرية مصفوفة باستخدام إبرة عيار 21 (الشكل 1). في معظم الوقت، فإن DRG الافراج بسهولة في مصفوفة ثم يمكن وضعه مركزيا مع الإبرة.
   1. إذا العصي DRG إلى الإبرة، واستخدام ملقط المجهرية لدفع DRG الخروج من إبرة وفي قطرة المصفوفة. الفتيل وسائل الإعلام الزائدة بعيدا عن ملقط المجهرية مع مختبر مسح.
      ملاحظة: إدخال وسائل الإعلام إلى مصفوفة تغيير القطر، وحجم، واتساق الفحص. كتلة الجليد مع اللون أو الكتابة الملونة يوفر تباين الخلفية، التي تخفف من التصور لهذه العملية الحساسة.
4. بعد لوحة لديه كل DRGs أربعة، إجراء التفتيش النهائي للتأكد من أن DRG هو في وسط الحبرية المصفوفة. إجراء تعديلاتحسب الحاجة مع إبرة 21 GUAGE.
5. نقل لوحة الانتهاء إلى 37 درجة مئوية الحاضنة. هذا وسوف يصلب مصفوفة نصف صلبة وإصلاح DRG في الموقف.
6. كرر هذه العملية لجميع DRGs. وضع قطرات مصفوفة فارغة بدون DRG كما سيطرة سلبية.
7. إضافة 4 مل من DMEM مع 10٪ سائل الإعلام FBS إلى كل لوحة من الزجاج السفلي بعد الانتهاء من جميع لوحات وتعريضهم إلى 37 درجة مئوية الحاضنة لمدة 3 دقائق على الأقل. وضع لوحة في زاوية طفيف وإضافة ببطء المتوسط، بحيث يأتي تدريجيا في اتصال مع وحدات مصفوفة DRG.
   ملاحظة: إذا تم إضافة وسيلة بسرعة كبيرة جدا أو بقوة، المصفوفة و / أو DRG يمكن أن تخلع.
8. تخزين فحوصات في الحاضنة 37 درجة مئوية لالقادمة 48-72 ساعة.
   ملاحظة: الفحص الدوري للفحوصات تظهر ثمرة كفافي من neurites التي نحو حافة مصفوفة (الشكل 2). عندما neurites التي هي أكبر من ثلاثة أرباع الطريق إلى مصفوفة، فإنههو مناسب لوحة الخلايا.

5. إعداد الرأس والرقبة خلايا السرطان

ملاحظة: خطوط خلية أخرى من الرأس والرقبة الحرشفية الخلايا سرطان الخلايا يمكن استخدامها في هذا التصميم التجريبي.

1. الحفاظ على خطوط الحرشفية سرطان الخلايا خلية في DMEM مع FBS 10٪ في قوارير المفضل أو أطباق الثقافة في الحاضنة 37 درجة مئوية. لإعداد الخلايا لإجراء التجارب، وشفط كل وسيلة من القارورة ثقافة أو طبق، وأغسلها مرتين مع برنامج تلفزيوني. تعليق الخلايا عن طريق إضافة كمية مناسبة من 0.025٪ التربسين لمدة 5 دقائق، تليها DMEM مع FBS 10٪. ماصة 4 مل من خلية وسائل الإعلام الخليط في أطباق ثقافة 6 مل.
   ملاحظة: لوحة الثقافة 6 مل توفر أكثر من كافية الخلايا، حتى عندما يكون أقل من 50٪ متموجة.
2. كشف خطوط الخلايا HNSCC لظروف مختلفة 24 ساعة قبل تلطيخ وتصفيح على فحص DRG. إعادة إعطاء جرعات من حالة مرة واحدة ومطلي الخلايا للحفاظ على environme ثابتالإقليم الشمالي.
   ملاحظة: إضافة الأجسام المضادة، عوامل النمو، السيتوكينات، أو جزيئات أخرى إلى أطباق زراعة الخلايا 1-2 أيام بعد تشريح الفأر وزرع DRG في المصفوفة.
3. إضافة البقع خلية الفلورسنت 1 ساعة قبل طلاء الخلايا (2 - 3 أيام بعد الحصاد DRG وغرس في المصفوفة).
   ملاحظة: بقع معينة المستخدمة هنا يمر بحرية من خلال غشاء الخلية؛ ومع ذلك، بعد التفاعل مع مجموعة ثيول داخل الخلايا، وتظل وصمة عار داخل الخلية ويتم تمرير إلى الخلايا الوليدة. تلطيخ يسهل إلى حد كبير التصور داخل المقايسات. هذه البقع مؤقتة مثالية لهذه المقايسات لأن مضان موجودا ل2-3 أيام، وهو الإطار الزمني لهذه التجارب. كما يسمح لاستخدام العديد من الألوان المختلفة، ويغني عن الحاجة لإنشاء خطوط الخلايا transfected بروتين فلوري.
   1. إعداد 10 ميكرومتر من محلول الصبغة عن طريق خلط 2 ميكرولتر من 10 ملي البقع خلية الأسهم في 2 مل من DMEM المصل خاليةلكل حالة الخلية. تدفئة هذا إلى 37 درجة مئوية قبل إضافته إلى الخلايا.
   2. إزالة مستنبت داخل لوحة 6 مل، وترك الخلايا HNSCC ملتصقة على لوحة. إضافة 2 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وإزالة 2 مل من DMEM 10 ميكرومتر الخلية وصمة عار / المصل خالية تضاف إلى كل لوحة
   3. العودة لوحة الثقافة 6 مل مع وصمة عار الخلية إلى 37 درجة مئوية الحاضنة لمدة 40 دقيقة.
   4. بعد 40 دقيقة، ونضح المتوسط. إضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني وثم نضح ذلك. إضافة 1 مل من 0.025٪ التربسين إلى كل لوحة واستبدالها في الحاضنة 37 درجة مئوية.
   5. إضافة 2 مل من DMEM مع FBS 10٪ بعد 3-5 دقائق ونقل الخلايا مع وقف التنفيذ لأنبوب مخروطي 15 مل. تدور الخلايا وإعادة أوقفهم في 1 مل من DMEM مع FBS 10٪.
   6. عدد الخلايا مع عدادة الكريات أو آلية مكافحة الخلايا، ثم قم بإضافة DMEM مع 10٪ FBS لخلق تركيز الخلية النهائي من 300000 خلية لكل مليلتر.

6. طلاء رئيس وNخلايا السرطان إيك

1. إزالة لوحات من الزجاج السفلي مع المقايسات مصفوفة DRG من الحاضنة.
   ملاحظة: مرة أخرى، فهي المناسب عندما neurites التي هي لا يقل عن 75٪ من الطريق إلى حافة المصفوفة، والذي يحدث عادة بعد 2-3 أيام. هذا يعتبر أفضل باستخدام الهدف 10X على الأقل.
2. نضح المتوسطة داخل لوحة من الزجاج السفلي. تماما نضح المتوسطة داخل الزجاج جيدا دون إزالة وحدات مصفوفة DRG.
3. وضع 200 ميكرولتر من 300000 خلية / مل المتوسطة باستخدام الماصة 200 ميكرولتر. وضع قطرتين من الخلايا فوق بعضها فحص مصفوفة DRG. تنفيذ هذه الخطوة لكل قطرة مصفوفة، وخلق أربعة يكرر كل حالة الخلية على لوحة واحدة.
   ملاحظة: شكل نصف كروي المصفوفة تسمح للخلايا ليستقر في حلقة على طول المحيط الخارجي للفحص (الشكل 3A، الشكل 3B). العثور على الماصة مع مشغل سلس يجعل وضع زي قطرات أسهل بكثير.
4. تأكيد أرقام الهواتف المحمولة مماثلة وديstribution الشروط خلية مختلفة تحت المجهر 4X.
5. وضع لوحات من الزجاج السفلي في الحاضنة 37 درجة مئوية لحوالي 60 دقيقة. ملاحظة: على الرغم من أن هناك ليست سوى كمية صغيرة من الخلايا وسائل الإعلام (~ 150 ميكرولتر)، وفحوصات لا تجف حتى انقضت عدة ساعات من وقت الحاضنة.
6. بعد 60 دقيقة، إضافة بلطف 4 مل من DMEM مع FBS 10٪ على طول جدار من لوحة من الزجاج السفلي.
   ملاحظة: على مدى فترة من الزمن، فإن الخلايا تلتزم جزئيا إلى أسفل لوحة، وطريقة إضافة المتوسطة لا يزعج الخلايا. أنواع مختلفة من الخلايا تجعل تأخذ أكثر أو أقل من الوقت للبدء في الانضمام إلى لوحة زجاج القاع.
7. استبدال أي أدوية خارجية أو عوامل النمو في هذا الوقت للحفاظ على مستويات تركيز السابقة.
8. العودة المقايسات إلى 37 درجة مئوية الحاضنة، إلا عندما يتم فحصها مجهريا. تحديد نتائج هذا الفحص بواسطة التصوير المجهري. لفترة وجيزة، عد خيوط غزو حول العصب معفي أربعة أجزاء باستخدام 4X صورة مجهرية.
   ملاحظة: المجهر مع 4X قدرات موضوعية ومضان كافية لفحوصات توثيق الصور. حجم المقايسات يناسب جيد في مجال هدف 4X، الذي هو مفصل بما يكفي لالتقاط كل مجال من مجالات غزو حول العصب. غزو ​​حول العصب يصبح واضحا خلال 24 ساعة، ولكن بعد 48 ساعة، وسلامة فحوصات تبدأ لإضعاف، وتنقسم الخلايا السرطانية على طول المحيط الخارجي للمصفوفة وتغزو. أكثر من 48 ساعة، وهناك أيضا هروب كبير من الخلايا الليفية من DRG، الذي يحجب التصور باستخدام brightfield المجهري. ولذلك، فإنه من المستحسن أن صورة وثيقة النتائج مع 4X المجهري مرتين على الأقل خلال هذه النافذة (على سبيل المثال، في 24 و 48 ساعة بعد طلاء الخلايا السرطانية). أن تضع في اعتبارها أن هذه المقايسات 3-الأبعاد، وأنه من الصعب أن صورة تماما فحص كامل. يحدث معظم غزو حول العصب في طائرة من الجزء السفلي من لوحة، حيث tانه الخلايا هي جزء لا يتجزأ في مصفوفة أعلى قليلا من أسفل لوحة. لأن هذه الطائرة هي قريبة من الأفقي، واستولت على الغالبية العظمى من neurites التي مع الخلايا السرطانية في صورة واحدة على مستوى في 4X.

بعد تشريح DRG ووضع داخل الحبرية مصفوفة، يجب أن ظهور الفحص تشبه الشكل 1. لاحظ أن DRG ليس دائريا تماما، ولكن يتركز في غضون الحبرية المصفوفة. وهذا يسمح للثمرة من neurites التي في 360 درجة، كما هو موضح جزئيا في الشكل 2. كن على علم أن أجزاء معينة من DRG ترسل neurites التي أسرع وبأعداد أكبر من غيرها، وعادة ما تقابل حيث صادر وفروع العصب وارد دخلت وخرجت من DRG، على التوالي. نفسر هذا وعن حجم الخلافات بين DRGs من الطلاء بشكل عشوائي DRGs في مجموعات من 4 ثم تعيين عشوائيا لوحة بالنظر إلى كل حالة الخلية.

كما هو موضح أعلاه، ونحن لوحة خطوط الخلايا HSNCC مرة واحدة neurites التي قمنا بمد ¾ على الأقل من الطريق إلى حافة المصفوفة، والذي هو عادة علىاليوم 3. الخلايا وأضاف تشكل حلقة الدائرية حول مصفوفة (الشكل 3A). نحن في وقت لاحق تصوير فحوصات يوم 4 (الشكل 3B)، ويوم 5 (الشكل 3C). خط الخلية هو موضح هنا (FaDu) يدل على قدرة أعلى من المتوسط ​​لتعقب على طول neurites التي. خط الخلية SQCCY1 هو مبين في الشكل (4)، ومع ذلك، يظهر قليل من دون الميل لغزو المقايسات.

عند استخدام خط الخلايا الجديدة، فمن استيراد للاستفادة من عدة ضوابط السلبية لدراسة كيف يتصرف هذا الخط خلية معينة حول الفحص. أولا، وخلايا لوحة حول فحص "على بياض" تتكون من مصفوفة وحدها (الشكل 5). جميع خطوط الخلية التي مختبرنا درست بنشاط تنقسم حول مصفوفة ولكن لا تدخل أو تمتد فوق الجزء العلوي من المصفوفة. عندما تترك الخلايا الزائدة على رأس المصفوفة، يمكن أن يكون هناك نمو كبير خلال مصفوفة. هذا يسلط الضوء على الحاجة إلى البريدتكفل للسقوط العديد من الخلايا إلى المحيط الخارجي للمصفوفة ممكن، بدلا من تركها للراحة وتقسيم على رأس المصفوفة. ويمكن تحقيق ذلك من خلال استغلال بلطف على لوحات قبل تلتزم الخلايا أو من قبل pipetting كميات صغيرة من وسائل الاعلام مباشرة على رأس الحبرية مصفوفة مرة واحدة وقد بدأت الخلايا التمسك وحة من الزجاج.

، يمكن تشغيل السيطرة السلبية الثانية، حيث يتم مطلي الخلايا في نفس اليوم الذي DRG تندرج في المصفوفة. والهدف من هذا النهج هو إثبات أنها ليست منطقة جذب موجه للعصب الذي يدفع الخلايا إلى DRG، بل أن وجود neurites التي إلزامي. وعلاوة على ذلك، عندما الخلايا السرطانية قد أقاموا على طول المحيط الخارجي للمصفوفة لأكثر من 2 أيام، على حافة مصفوفة تصبح غير واضحة. ثم يبدأ مصفوفة لرفع من خارج أسفل الزجاج ويمكن العثور على التعويم الحر في وسائل الإعلام بعد ذلك بوقت قصير. لهذا السبب، وهذا بروتوالعقيد يصف طلاء الخلايا HNSCC مرة واحدة neurites التي قمنا بمد 75٪ من المسافة إلى حافة المصفوفة.

هناك خيارات لا تعد ولا تحصى لقياس نتائج ما هي بصريا الفروق واضحة جدا بين المقايسات. في هذه الطريقة واحدة، وتنقسم هذه الصور من المقايسات إلى أربعة أجزاء مع الرأسي وخط أفقي (الشكل 6). يتم تعيين نقطة واحدة عن كل رباعي الذي لديه سلسلة واحدة على الأقل من PNI. اذا مددت PNI وراء 50٪ من الطريق من حافة مصفوفة لDRG، يتم تعيين ثم 2 نقطة بدلا من ذلك. وبهذه الطريقة، على درجة من 0-8 نقاط يمكن تعيينها. والميزة الرئيسية لهذا النظام هو أن المقايسات التي لديها عدد كبير جدا من وحدات PNI إلى الاعتماد يمكن تقييم بسرعة. والعيب هو أن لا يعبر بشكل كاف درجة PNI (أي رباعي مع 1 محوار مع الغزو 100٪ من المسافة إلى DRG يتلقى بنفس النتيجة (2) كما تشو adrant مع 10 neurites التي مماثل غزت). مقارنة بين brightfield الفلورسنت والصور يجعل هذا النظام من السهل جدا، حتى مع هروب رأس المال الليفية كبير.

ويظهر التسجيل عينة في الشكل (6). باستخدام هذا النظام التهديف أربعة رباعي لالشكل 3، 0 نقطة 2 نقطة، و 7 نقاط تم تعيينها لوحات الشكل 3A، الشكل 3A، والشكل 3C، على التوالي. تلقى الرقم 4 بنتيجة 2 نقطة و 2 نقطة في لوحات الشكل 4A والشكل 4B، على التوالي. البيانات الواردة في الجدول 1 يصور نتائج العديد من التجارب باستخدام خطوط الخلايا FaDu وSQCCY1. لاحظ أنه حتى مع وجود جدول الدرجات محدود مثل هذه الاختلافات ذات دلاله إحصائية في درجات أربعة رباعي يعني يتم الحصول بسهولة باستخدام عينات المستقلة اختبار t.

: المحافظة على together.within الصفحات = "1">
الشكل 1. DRG مصفوفة الفحص. موضع الصحيح من العقدة الجذرية الظهرية داخل الحبرية مصفوفة، كما هو موضح مع المجهري brightfield في 4X. يمثل مقياس شريط 1 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2. ثمرة من neurites التي. neurites التي غائبة يوم 0 فورا بعد وضع DRG في الحبرية مصفوفة (A). يوم 1 (ب)، ثمرة neurite هو واضح في 10X على المجهر brightfield. يستمر نمو محوار في يوم 2 (C) ويوم 3 (D)؛ ومع ذلك، لاحظ هروب رأس المال من الخلايا الليفية. الشورييمثل شريط مزر 0.1 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3. DRG مصفوفة الفحص مع FaDu. وأضاف الرأس والرقبة الحرشفية خط سرطان الخلايا FaDu محيطيا حول مقايسة في اليوم 3 (A)، كما هو موضح في الفلورية الخضراء والفحص المجهري brightfield في 4X التقدمي الغزو العصبي وينظر في يوم 4 (ب) ويوم 5 (C). يمثل مقياس شريط 1 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4. DRG- الفحص مصفوفة مع SQCCY1. وأضاف الرأس والرقبة خط الخلية الحرشفية SQCCY1 يوم 4 (أ)، كما هو موضح في brightfield والفحص المجهري الفلورية الخضراء في 4X. لاحظ أن هذا الخط الخلية لا يتقن حتى غزو حول العصب كما FaDu، حتى يوم 5 (B). يمثل مقياس شريط 1 مم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5. مصفوفة الفحص مع FaDu. وأضاف الرأس والرقبة الحرشفية خط خلية سرطان الخلايا FaDu حول قطرات مصفوفة دون DRG في اليوم 3. brightfield والأخضر المجهر الفلورسنت (4X) التي تظهر على يوم 4 (A). لاحظ أن الخلايا السرطانية لا تدخل في مصفوفة أو تنمو على أعلى من ذلك، حتى يوم 5 (B). يمثل مقياس شريط 1 مم.طالبان الباكستانية: //ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55043/55043fig5large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 6. أسلوب أربعة رباعي للالفحص الكمي. يتم تعيين نقطة واحدة عن كل رباعي مع PNI أقل من 50٪ من المسافة من حافة مصفوفة لDRG. يتم تعيين 2 نقطة عندما يمتد PNI وراء 50٪. ان المثال الأول (A) يحصل على درجة 5 (1 نقطة عن كل رباعي لPNI أقل من 50٪، باستثناء الحق السفلي، والتي لديها PNI تتجاوز 50٪، حيث سجل 2 نقطة). وسجل المثال الثاني (B) باعتبارها 8 (أ PNI وراء 50٪ في جميع الأرباع الأربعة). يمثل مقياس شريط 1 مم. الرجاء النقر هنا لضدiew نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1. مقارنة بين PNI بين FaDu وSQCCY1. يعني عشرات أربعة رباعي كما هو مبين في الشكل (6) ما بين السطور خلية FaDu وSQCCY1 في 24 ساعة (يوم 4) و 48 ساعة (يوم 5) بعد أن تم مطلي الخلايا حول فحص DRG مصفوفة. يتم إجراء مقارنات باستخدام سام مستقلةسبيل اختبار (ت) وعرض مع انحراف معياري (SD) و ف القيم.

خطوات حاسمة في إطار بروتوكول

أهم الخطوات في هذا البروتوكول هي تشريح دقيق واستخراج العقد الجذرية الظهرية. transection الصحيح للعمود الفقري وتقسيم خط الوسط الطولي إلى قسمين نصفي العمود الفقري حاسمة لحصول على أعداد كبيرة من DRG. خلال تشريح DRGs الفردية، ينبغي أبدا أن يكون التعامل مع العقدة مباشرة، ولكن ينبغي اغتنامها بدلا اللفافة المحيطة مع ملقط المجهرية. وعدم القيام بذلك يؤدي إلى إصابة في سحق من DRG، والتي من المرجح أن السبب الرئيسي لفشل لثمرة neurite. ومن الأفضل كثيرا أن تحت تقليم الأنسجة العصبية المحيطة أثناء تشريح من لمخاطر الإفراط في التعامل مع DRG والحصول على أي نمو محوار في الفحص.

التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها

بروتوكول تجريبي على النحو المبين أعلاه يعكس الأمثل التقىعلم السبل العصبية التي أنشئت من عدد كبير من التعديلات الإجرائية التي تحققت خلال عدة سنوات. المدرجة مباشرة تحت الخطوة المقابلة في قسم البروتوكول هو عدد من الملاحظات والمزالق التي نتجت عن تجارب المؤلفين عند استخدام هذه المنهجية. ونظرا لعدد من الخطوات المتبعة، هناك العديد من الواقع التعديلات التي يمكن إدخالها على هذا البروتوكول من قبل المحققين في المستقبل. عن تجربة هذه التعديلات ينمو، ومن المتوقع أن سيلة إضافية لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها وسيتم تطوير وفقا لتفضيلات من فريق التحقيق.

القيود المفروضة على تقنية

هناك ثلاثة قيود كبيرة على هذه التقنية. الأول هو أن يتم استخدام neurites التي دقيقة جدا كبديل للغزو العصبي كبير، وهو ما تتقيد الأطباء في عينات الورم. ومن غير المعروف ما دور neurites التي، على عكس الخلايا العصبية، هي في الجسم الحي لتحديد perineuriteالغزو هو أبعد من قدرات امتحان الأنسجة الروتينية. ثانيا، غزو حول العصب هو شكل من أشكال غزو الأنسجة الرخوة التي قد لا ببساطة تنطوي على الخلايا السرطانية والخلايا العصبية المجاورة، كما هو محاكاة في هذا الاختبار. على هذا النحو، والعوامل الخارجية موطنها في المختبر الورم الوسط تعاني من نقص في هذا الاختبار. وأخيرا، فإن الفترة الزمنية التي يمكن دراستها PNI يقتصر على ما يقرب من 48 ساعة بسبب مزيج من هروب رأس المال الليفية وفقدان النزاهة المصفوفة. وبهذه الطريقة، خطوط الخلايا التي تكون فعالة في الغزو العصبي ولكن هي الفاصل بطيئة و / أو الغازية سيتم تفويتها ويفترض أن لا يكون بارعا في PNI.

أهمية تقنية مع الاحترام لالحالية / الطرق البديلة

على حد علمنا، وهذا هو الوحيد في المختبر نموذج المتاحة حاليا لدراسة PNI في HNSCC. وبالنظر إلى الوتيرة التي يحدث PNI في HNSCC والمعرفة محدودة من الآليات التيالقائم حاليا، وهذا الأسلوب هو مفيد لعدة أسباب. أولا، أنه يحتوي على نسبة نجاح عالية جدا واستنساخ ممتازة. الوقت الإجمالي التجربة هو أيضا قصيرة نسبيا مقارنة بروتوكولات مماثلة ^12،17-19. وأخيرا، مع عدد كبير من المقايسات التي يمكن توليدها من ماوس واحدة، ويمكن اختبار العديد من الظروف مع مكررات علميا المناسبة. مزيج من هذه العوامل يسمح للتقييم السريع للعديد من الظروف المختلفة مع نتائج متسقة.

في نفس الوقت، والجودة العالية للفحص تصاريح فحص أكثر تفصيلا من التفاعل بين الخلايا السرطانية وneurites التي. استخدام التصوير الخلية الحية يسمح لتقدير عملية ثمرة neurite وغزو الخلايا HSNCC في شكل فيديو مرور الزمن. إضافة خلايا ملطخة fluorescently يخلق تمايز واضح جدا بين الخلايا السرطانية والمواد الأساسية، مثل الخلايا الليفية وأوو محوار كثيفtgrowth (التي لصناعة السيارات في يتألق الأحمر). إذا كان اتباع هذا البروتوكول أو تلك التي وصفها من قبل الآخرين، وهذا التصميم التجريبي العام هو في مرحلة الطفولة النسبية، وهناك بعيدا عن معيار الذهب للدراسة في المختبر من PNI. لهذه الأسباب، فإن أكثر النهج لهذا الاختبار الموضحة في التفاصيل، كلما زادت فرصة لتطوير التعاونية منهجية مثالية.

التطبيقات المستقبلية أو الاتجاهات بعد اتقان هذه التقنية

كما أن هناك عدة طرق مختلفة لإعداد المقايسات، وهناك عدة طرق لقياس النتائج. في النص أعلاه، تم تقديم طريقة واحدة لقياس بسرعة لدرجة غزو حول العصب في كل فحص. هذا هو المثل الأعلى لفحص تأثير العديد من مسارات مختلفة على PNI، خصوصا ان واحد يمكن عزل 32 - 40 DRGs في الماوس. هناك عدد من تقنيات التصوير المتقدمة لتقييم PNI،بما في ذلك مبلغ مضان داخل منطقة معينة، والمسافة ومعدل غزو الخلايا، وعدد الخام من الخلايا داخل الفحص. وبمجرد الانتهاء من الجزء الحيوي من التجربة، والخلايا داخل فحص و / أو طاف يمكن أيضا أن يتم جمعها لمزيد من التحليل الجزيئي.

تقدم هذه المنهجية التجريبية الفرصة لتوضيح الآليات التي تشارك في PNI من HNSCC وأنواع أخرى من السرطان. هذه المعرفة يمكن أن تدفع تطوير علاجات لاستهداف مسارات PNI، والتي، في الوقت الحاضر، تعاني من نقص في HNSCC. الاستهداف المحدد للPNI عندما يتم تحديدها كميزة المرضية السلبية من المحتمل أن يغني عن الحاجة إلى العلاج مادة مساعدة غير محددة، مثل العلاج الإشعاعي والعلاج الكيميائي، والتي تستخدم حاليا.

The authors have no competing financial interests.

This work was supported in whole by funding from the NIH through the R21 grant, "Mechanisms of Perineural Invasion in Head and Neck Cancer" and the NCI T32 training grant, "Post-Doctoral Research Training in Head and Neck Oncology (2T32CA060397-21)." Thank you to Richard Steiman, MD, PhD and lab staff.