在头颈部鳞状细胞癌的神经浸润模型

Perineural invasion (PNI) is a common feature of head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC), conferring lower survival rates. Its mechanisms are poorly understood. Utilizing neurites generated from murine dorsal root ganglia confined to a semisolid matrix, the pathways involved in the PNI of HNSCC cell lines can be investigated.

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, radiation, and chemotherapy, locoregional recurrences and distant metastases occur at higher rates, and overall survival is decreased by 40% compared to HNSCC without PNI. In vitro studies of the pathways involved in HNSCC PNI have historically been challenging given the lack of a consistent, reproducible assay. Described here is the adaptation of the dorsal root ganglion (DRG) assay for the examination of PNI in HNSCC. In this model, DRG are harvested from the spinal column of a sacrificed nude mouse and placed within a semisolid matrix. Over the subsequent days, neurites are generated and grow in a radial pattern from the cell bodies of the DRG. HNSCC cell lines are then placed peripherally around the matrix and invade preferentially along the neurites toward the DRG. This method allows for rapid evaluation of multiple treatment conditions, with very high assay success rates and reproducibility.

Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is the sixth most common cancer in the US, with 10,000 deaths per year nationally and 300,000 deaths per year worldwide¹. The overall prognosis for HNSCC has remained unchanged at 50% for the past several decades. Perineural invasion (PNI) is one of the most prominent pathological features that portend a poor prognosis in patients with HNSCC. Unfortunately, PNI is a frequent occurrence in HNSCC and can be found in up to 40% of HNSCC patients^2,3.

PNI is the process by which malignant cells track along nerves to adjacent tissues, allowing for higher rates of local and distant spread. Accordingly, PNI-positive HNSCC tumors have higher rates of locoregional recurrences and distant metastases, resulting in lower overall survival compared to HNSCC patients without PNI^4-8.

Although the treatment of patients with PNI is typically maximized by employing surgery, radiation, and chemotherapy, the overall survival rates of these patients are still decreased by up to 40% compared to patients without PNI^9-11. Thus, it is clear that the current treatment modalities for HNSCC are ineffective in improving the adverse prognosis associated with PNI. The approach of developing targeted therapy against PNI in HNSCC has been hindered by the poor understanding of the factors that regulate this process. This is, in part, a consequence of the lack of a consistent in vitro model for the study of PNI in HNSCC.

In recent years, several groups have been utilizing an in vitro model for studying PNI in predominantly pancreatic and prostate cancers^12-19. This model uses the neurites generated from dorsal root ganglia isolated from mice or rats as a surrogate for large-nerve invasion. The dorsal root ganglia are fixed in a factor-depleted semisolid matrix, which is a solubilized basement membrane protein mixture secreted by Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells. This matrix allows for the outgrowth of the neurites and the tracking of single cancer cells along these neurites. Described here is the adaption of this model for the examination of PNI in HNSCC.

1.培养基的制备和食品（10分钟）

1. 添加的Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）和10％胎牛血清（FBS）到96孔V型底板的孔中微升的100。
2. 从20℃冰箱中取出大约100半固体基质的微升预等分小瓶，并直接将其放置在冰上。
   注意:做这个的背根神经节之前（DRG）收获，因为半固体基质大约需要30分钟，在冰上，这是必要的后续步骤达到液体状态。未能保持半固体基质冰在任何时候都将导致质量差的矩阵滴。
3. 标签玻璃底与永久墨水培养板，在板的下创建的每个四角的唯一标识符。将平板右侧朝上冰上冷却板面。
   注意:每个小鼠收率32 - 40 DRG，所以从1标记它们以40这是没有必要预先寒意圆周宠物提示，冷冻提示将在温暖放置矩阵液滴，可能引入矩阵一致性差异的过程。

2.鼠DRG的夹层（45分钟）

1. 安乐死的无胸腺裸小鼠按特定实验室协议，例如通过使用_在 CO ₂室和开胸。
2. 成立了解剖区域和显微镜。使用聚苯乙烯容器的清洁，灭菌，和平面底面为15或50毫升锥形管中。
   注:此外，它们适合用作解剖表面，因为它们是便宜的，一次性的，并且允许使用销或针的脊椎固定。只用消毒器械和针头。
3. 在自然的视野，使沿着从尾部到鼠标的头部有一对直线或曲线精剪根脊柱的纵向切口。
4. 使用相同的剪刀横向鸿沟下面SACR人的脊椎。剖析脊柱两侧一路用剪刀颅底。在这一点上，确保该颈椎被颅尽量横断尽可能用剪刀。
5. 观察在低功率在手术显微镜下的脊柱的颈椎端。白色脊髓处于骨环，它是由不同量的椎旁肌肉和软组织包围的中间显而易见。
6. 驳头2的背部或上级的方面 - 与微观弹簧剪刀3椎体。使用剪刀的弹簧作用，打开切断，以确保在椎体解剖发生在中线该初始骨。继续在朝向骶棘小增量，然后通过完成对椎体的腹侧或劣方面相同的切口对开脊椎。
   注意:如果不确保骨脊柱中线切开，将导致一个较低的DRG收率。
7. 在THI角度看，它的脊柱被分成两半。放置一个半脊椎一边，与脊髓到位，向下置于无菌板。
   注:在地方离开脊髓将防止的DRG变干，作为病种深至脊髓。
8. 固定其他半脊柱两端与聚苯乙烯解剖平台上的两个18号针头。在颈端开始（这是显而易见的，因为脊椎是窄，DRG更接近彼此，和有肋插入），轻轻剥离背部约4椎骨水平的脊髓。
9. 观察连接DRG的感觉神经（通常为两个）。在神经插入到DRG的区域，轻轻抓住与显微镊周围筋膜。解剖和修剪这筋膜等神经组织与微观弹簧剪刀以释放DRG。温和回缩将带来DRG其位置的脊柱骨内。
   注:增加在此步骤显微镜功率是有益的。挤压伤到DRG将显著限制突起的增长。这是通过从不直接抓DRG避免，而是通过抓住周围的筋膜。
10. 切周围神经（DRG的通常有一个外周神经，这是相对于深解剖视图）与微观弹簧剪刀释放DRG。
    注意:这是最简单的，以确定在那里神经末端和背根神经节开始，而在张力，所以使该切口尽可能接近到DRG在这一点是理想的。一旦该远侧分支被切断，近侧分支被修整为好。
11. 修剪任何杂散神经纤维或筋膜附件中微观弹簧剪刀的DRG。后足够的隔离，将DRG到96孔V形底板中的室温介质。
    注:放置在深色背景下的板使得可视化分毫米的白色病种付费更容易。只有放在EAC 1 DRGħ好;这样，它们可占更容易在随后的步骤。
12. 重复此过程，一路向下半脊椎，然后其他。每一方产生16 - 20病种付费，总额为32 - 40。
    注意:如果有的DRG比这更少，需要进行进一步的头侧和/或尾端脊柱的解剖。按病种付费将变得越来越不那么定义为一个收益尾部。

3.半固态基质液滴制备（<每平板1分钟）

1. 从冰中取出一块玻璃以及底板，并将其放置冰块，在手术显微镜下的。确保矩阵的等分在任何时候都保持在冰上。
2. 放置基质的各玻璃底板的四个角的1.5微升液滴具有2μL或10微升micropipetter，留下的距离至少一样大液滴本身从玻璃的良好的边缘。
   1. 放置吸管尖上直接该玻璃以45度角。慢慢地吸取矩阵。在矩阵上板接合后，慢慢地从玻璃底搬走。
      注:基体与玻璃之间的表面张力应创建一个完美的半球各一次。
   2. 停止吸移之前的前端是空的，因为意外注入空气进入矩阵液滴使得矩阵液滴更大的直径，并且难以去除。
      注:使用二手稳定吹打手利于更准确的位置。

4.插入DRG成半固体基质液滴（<每盘2分钟）

1. 与简单地在室温（〜1分钟）的矩阵的液滴离开板。这略微僵硬的矩阵，使它更容易为DRG的精确位置。
2. 勺（不抓）轻轻地用左手封闭微观钳DRG。同样，对小黑色背景，白色DRG方便的可视化。转移DRG到21号针头的尖端在右手。这种转移将离开镊子残留介质。
3. 轻轻插入DRG到使用21号针头（ 图1）的矩阵液滴的中间。大部分时间，背根神经节将很容易释放到基质，然后可以与针中心定位。
   1. 如果DRG粘在针，使用微观镊子推DRG落针并进入基质液滴。从实验室显微镜镊子吸走多余的介质擦拭。
      注:在介绍媒体到矩阵将改变直径，体积和测定的一致性。冰块用颜色或颜色的书写提供了背景的对比度，从而简化了这一微妙的过程可视化。
4. 板具有所有四个的DRG之后，执行最终检查以确保该DRG是在基质液滴的中心。进行调整根据需要用21号针头。
5. 已完成的板转移到37℃培养箱。这将巩固半固体基质和固定DRG的位置。
6. 重复此过程为所有的按病种付费的。放置空白基质液滴未经DRG作为阴性对照。
7. 有10％FBS培养基中添加4毫升的DMEM每个玻璃底板完成所有板，并将它们暴露于37℃培养箱中至少3分钟后。放置板以微小的角度，慢慢添加介质，使得其逐渐进入与基质DRG单元接触。
   注意:如果媒体被添加太快或大力，矩阵和/或DRG可以移位。
8. 存放在37℃培养箱的测定为未来48 - 72小时。
   注:测定的周期检查将显示向基质边缘（ 图2）突起的圆周向外生长。当轴突比的方式四分之三更大的矩阵，它适合于板上的细胞。

5.制备头颈癌细胞

注:比头和颈部鳞状细胞癌细胞的其它细胞系可以在这个实验设计中使用。

1. 保持在37℃培养箱中在DMEM鳞状细胞癌的细胞系用10％FBS的优选烧瓶或培养皿。为了准备实验，抽吸从培养瓶或培养皿所有的细胞培养基，用PBS洗两次。通过添加0.025％胰蛋白酶的5分钟适量，随后含10％FBS的悬浮细胞。吸取4毫升细胞和媒体混合成6毫升的培养皿中。
   注:一个6毫升培养板提供了超过足够的细胞，即使当小于50％汇合。
2. 露出头颈部鳞癌细胞系24小时之前，染色和电镀的DRG分析不同的条件。重剂量的条件下，一旦将细胞铺板到保持一致的environmeNT。
   注:加入的抗体，生长因子，细胞因子或其它分子与细胞培养皿1 - 以下小鼠解剖和背根神经节到矩阵的植入2天。
3. （ - 背根神经节的收获和植入基质后3天2）电镀细胞之前添加荧光细胞染色1小时。
   注:此处使用通过细胞膜自由通过特定污渍;然而，与细胞内硫醇基团反应之后，污渍保持在细胞内，并在子细胞内传递。染色极大地方便了实验中的可视化。这些临时污渍是理想的这些测定，因为荧光的存在为2 - 3天，这是这些实验的时间范围。它也允许使用的许多不同的颜色并避免了对创建荧光蛋白转染的细胞系的需要。
   1. 通过混合2 10微升10mM储备细胞污渍在2mL无血清DMEM的制备10μM的染料溶液对于每一个细胞的条件。将其添加到细胞前温暖这个至37℃。
   2. 6毫升板内取出培养基，留下粘附HNSCC细胞在平板上。添加2毫升磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，并除去2毫升10μM的细胞染色/无血清DMEM加入到每个板
   3. 与细胞染色返回6毫升培养板于37℃培养箱中40分钟。
   4. 40分钟后，吸出培养基。加入2毫升的PBS，然后吸它。添加1毫升0.025％胰蛋白酶的对各板，并在37℃培养箱替换它们。
   5. 加入2毫升的DMEM含10％FBS后3 - 5分钟，悬浮的细胞转移到15毫升锥形管中。旋转细胞，并重新悬浮他们在1毫升的DMEM含10％FBS。
   6. 计数与血球或自动细胞计数器的细胞，然后用10％的FBS添加DMEM培养基，以创建每毫升300000细胞的最终细胞浓度。

6.电镀头和N埃克癌细胞

1. 与从培养箱基质-DRG测定中取出玻璃底板。
   注: - 1天同样，当突起是的方式向基体，这通常发生后2的边缘至少75％它们是合适的。这是通过使用至少一个10X物镜最清楚地看到。
2. 吸出玻璃底板内的网上平台。完全吸出玻璃内的介质以及不去除矩阵DRG单元。
3. 制定使用200微升吸管30万细胞/ mL培养基200μL。放置细胞的两滴在每个矩阵DRG测定。执行此步骤每个矩阵液滴，在一个板上创建每个细胞条件4个重复。
   注:基质的半球形状允许细胞在沿测定（ 图3a，图3b）的外周的环沉降。找到一个吸管具有光滑的触发使得统一安置下降容易得多。
4. 确认类似细胞数和二下4X显微镜各种细胞条件stribution。
5. 放置玻璃底板到37℃培养箱中培养大约60分钟。注意:虽然只有细胞和培养基（〜150微升）中的一小体积，测定法不干燥直到孵化时间几个小时已经过去了。
6. 60分钟后，轻轻地用10％FBS的沿着玻璃底板的侧壁加入4毫升的DMEM。
   注:经过一段时间，将细胞部分地附着到板底，并添加培养基不干扰细胞的方法。不同类型的细胞使采取更多或更少的时间来开始粘附到玻璃底板。
7. 在这个时候更换任何外源性药物或生长因子保持了以往的浓度水平。
8. 返回检测到37℃培养箱，显微镜时进行检查，他们除了。量化该测定通过显微成像的结果。简单地说，算上与神经浸润的股在四个象限使用4X显微镜图像。
   注:带有4X目标和荧光功能的显微镜是足够的照片记录了实验。该测定的尺寸非常适合一个4X物镜，其详细足以捕捉神经浸润的各个区域的视野内。神经浸润变得在24小时内显现，但超过48小时，该实验的完整性开始减弱，因为肿瘤细胞沿着矩阵的周边划分和侵入。超过48小时，也有从背根神经节，采用明场显微术这掩盖可视成纤维细胞的大量流出。因此，这个窗口期间是可取的照片文档与4X显微镜的结果的至少两倍（ 例如，在电镀的肿瘤细胞后24和48小时）。牢记这些是3维测定法，它是难以完全图像整个测定法。大多数神经浸润的平面中发生从板的底部，其中t他的细胞包埋在基质中的板的底部略高于。因为这架飞机是接近水平，绝大多数肿瘤细胞轴突都在4X单级图像捕获。

背根神经节的解剖和基质液滴中放置后，测定的外观应该类似于图1。注意，在DRG不完全是圆的，但它是在基质液滴内居中。这允许在360度突起的生长，在图2中部分示出。请注意，DRG的某些部位发出的神经突更快，数量更多比别人，通常对应到传出和传入神经分支进入和退出的DRG，分别为。我们考虑到这一点，并为病种之间大小的差异通过随机电镀的DRG中的4个组，然后，随机分配一个给定的板到每个单元的状态。

如上所述，我们镀HSNCC细胞系一旦突起已经扩展的方式至少¾到矩阵的边缘，这是通常在第3天增加的细胞形成围绕矩阵（ 图3a）的周向环。我们随后拍摄第4天（ 图3b）和第5天（ 图3c）的测定。这里显示的细胞系（法度）演示了沿轴突跟踪高于平均水平的能力。在图4所示的SQCCY1细胞系，然而，示出了很少或几乎没有倾向侵入测定。

当使用新的细胞系，它是导入到利用几个阴性对照，以检查该特定细胞系围绕该测定的行为方式。首先，围绕仅由基质的"空白"试验板的细胞（ 图5）。我们的实验室已经积极地检查了所有的细胞系划分基质周围，但不进入或延伸过基体的顶部。当过大的细胞被留在基质的顶部，可以有在基质显著增长。这凸显了需要电子nsure尽可能多的细胞落到矩阵尽可能的外周，而不是被静置和在矩阵的顶部分裂。这可通过在平板上轻轻拍打细胞附着之前或吹打少量直接在基质液滴的顶部媒体一旦细胞已开始粘附到玻璃板来实现。

第二个阴性对照，其中所述细胞在同一天的DRG被放置在基质内镀，可以运行。这种方法的目的是要证明，它不是驱动细胞的DRG，而是在突起的存在是强制性的一种嗜神经吸引力。此外，当肿瘤细胞已经沿着矩阵为大于​​2天的周边居住，基质边缘变得模糊。矩阵然后开始解除掉玻璃底，可以自由浮动在媒体此后不久被发现。由于这个原因，此原山口描述电镀HNSCC细胞一旦神经突延长了距离的75％到基质的边缘。

有量化的东西是视觉检测之间很明显的差异，结果无数的选项。在一个这样的方法中，测定的图像被分成四个象限有垂直和水平线（ 图6）。一个点被指定为具有PNI的至少一个字符串的每个象限内。如果PNI延伸超出的方式50％来自基质的DRG的边缘，然后2点，而不是分配。以这种方式，0分 - 8分可以分配。这种系统的主要优点是，有太多的PNI单位计数测定法可快速评估。缺点是不能充分表达PNI的程度（即与1突起与入侵的DRG的距离100％的象限接收相同的比分（2）作为曲10同样，入侵突起adrant）。在明和荧光图像的对比，使这个系统非常容易，即使有显著成纤维细胞外排。

样品评分示于图6。使用这种四象限评分系统为图3中 ，0分，2分，和7分被分配，用于分别板图3a， 图3a和图3c。 图4接收得分2分和2个板图4a和图4b分别。 表1中的数据描述了用细胞系FADU和SQCCY1几个实验的结果。请注意，即使在有限的分级量表如此，可容易地使用独立样本t检验得到的平均四象限得分统计学-显著差异。

图1. DRG矩阵分析。矩阵液滴内的背根神经节的正确位置，与4X明显微镜所示。比例尺条为1毫米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2. 生长轴突。突起的第0天缺席放置在DRG矩阵液滴（A）之后。通过1天（B）中 ，神经突增生的明场显微术在10X是显而易见的。轴突生长继续第2天（C）和3天（D）;但是，请注意成纤维细胞的外排。钪啤酒酒吧代表为0.1mm。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3. DRG矩阵分析与法度。头和颈部鳞状细胞癌线FADU圆周周围添加第3天（A）一种测定法中，在以4×逐行神经侵袭绿色荧光和明显微镜所示看出在第4天（B）和第5天（C）。比例尺条为1毫米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4. DRG-矩阵分析与SQCCY1。头颈部鳞状细胞系SQCCY1加入在第4天（A）中 ，以4×在明和绿色荧光显微镜中。注意，该细胞系是未在神经浸润作为法度如精通，即使由第5天（B）。比例尺条为1毫米。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5.矩阵分析与法度。头颈部鳞状细胞癌细胞系FADU加入周围的基质微滴而对天3第4天（A）所示的明和绿色荧光显微镜（4X）一个DRG。需要注意的是，肿瘤细胞不进入基质或生长在它的顶部，即使由第5天（B）。比例尺条为1毫米。TTP://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55043/55043fig5large.jpg"目标="_空白">点击此处查看该图的放大版本。

图 6. 分析定量四象限法。一个点被分配用于与从基质到DRG的边缘的距离的PNI小于50％的每个象限中。当PNI延伸超出50％的2点被指定。第一个例子（A）将获得5分（1点每象限的PNI少于50％，除了右下角，其中有一个PNI超出50％，其中2得分点）。第二个例子（B）的（在所有四个象限一个PNI超出50％）得分为8。比例尺条为1毫米。 请点击此处到vIEW这个数字的放大版本。

表1. PNI法度和SQCCY1的比较。意味着四象限分数作为在24小时（4天）和48小时（第5天）的细胞周围的DRG-基质测定铺板后示于图6中的细胞系FADU和SQCCY1之间。比较使用独立的SAM做PLE t检验，并与标准偏差（SD）和P值呈现。

该议定书中的关键步骤

该协议中最重要的步骤是精确的解剖和背根神经节的提取。脊柱和中线纵分工合理横切为两半刺都获得大量的DRG的关键。在按病种付费个人的解剖，神经节不能直接处理，而是周围筋膜应与微观镊子来把握。不这样做将导致DRG，这很可能失败的主要原因为神经突长出的挤压伤。这是再好不过的解剖过程中欠修剪周围的神经组织，而不是过度处理DRG并获得在试验中没有突起生长的风险。

修改和故障排除

如上述所述的实验协议反映满足最优从大量的数年取得程序调整既定hodology。在协议部分的相应步下直接列出的是一些笔记和陷阱使用这种方法时，起因于作者的经历。鉴于所涉及的步数，有可能这个协议被未来的研究者提出确实有很多修改。与这些修改经验的增长，可以预料，排除故障的补充手段将根据调查小组的喜好进行开发。

该技术的局限性

有这种技术三大限制。首先，非常细的神经突用作大神经侵袭，而这正是病理学家在肿瘤标本观察的替代品。它不知道什么神经突的作用，相对于神经元， 在体内 ，因为识别perineurite侵袭是超越常规组织病理学检查的功能。其次，神经浸润是软组织浸润，可能无法简单地包括肿瘤细胞和邻近的神经元，如在此测定法模拟的形式。作为原产于体外肿瘤这样的环境，外部因素是缺乏在此测定。最后，在此期间，PNI可以研究的时间段被限制为大约48小时，由于成纤维细胞流出和基质完整性的损失的组合。以这种方式，是在神经侵袭有效的，但很慢分割和/或入侵的细胞系将被错过和推定为不会在PNI熟练。

关于到现有/替代方法的技术意义

据我们所知，这是目前研究PNI头颈鳞癌中唯一的体外模型。定与PNI在HNSCC发生的频率和机制的有限知识当前存在，这种方法是有利的，原因有几个。首先，它具有非常高的成功率和优异的再现性。总的实验时间也相对较短，相比同类协议^12,17-19。最后，随着大量可以从一个单一的鼠标生成实验，很多条件可以用科学的，适当的重复测试。这些因素的组合可以用于治疗与一致的结果许多不同条件下的快速评估。

同时，测定的高质量允许肿瘤细胞和神经突之间的交互的更详细的检查。使用活细胞成像允许轴突生长过程中的升值和时间推移视频形式HSNCC细胞侵袭。在加入荧光染色的细胞产生的癌症细胞和背景材料，如成纤维细胞和密集的轴突欧之间非常清楚分化tgrowth（其中自动发出荧光红色）。无论是按照此协议，或那些被别人描述的，这一般实验设计是在其还处于起步阶段，并没有远离金标准PNI的体外研究。由于这些原因，越接近该测定，在详细描述，更大的理想方法的协作开发的机会。

掌握这一技术后，未来的应用方向或

正如有几种不同的方法来设置的测定中，有几种方法来测量的结果。在上述的文字，被提出用于快速定量在每个测定神经浸润度的单一方法。这是理想的筛选众多不同的途径对PNI，影响特别是考虑到可以隔离32 - 每只小鼠40病种付费。有许多先进的成像技术来评估PNI，包括一个给定的区域内的荧光的量，距离和细胞侵袭的速率，以及在测定中的原料数量的细胞。一旦该实验的动态部分完成后，测定和/或上清液中的细胞也可以被收集用于进一步的分子分析。

这种实验方法提供了机会，阐明参与头颈部鳞癌和其他癌症的PNI的机制。这种知识可以驱动治疗学的发展为目标PNI，其中，在当前时间，缺乏在HNSCC的通路。 PNI的特异性靶向时识别为不良病理功能可能消除对非特异性辅助治疗，如放射治疗和化学治疗，当前使用的需要。

The authors have no competing financial interests.

This work was supported in whole by funding from the NIH through the R21 grant, "Mechanisms of Perineural Invasion in Head and Neck Cancer" and the NCI T32 training grant, "Post-Doctoral Research Training in Head and Neck Oncology (2T32CA060397-21)." Thank you to Richard Steiman, MD, PhD and lab staff.