Method Article
Мы здесь, в описания анализа путем сочетания идентификации ДНК аденин метилтрансферазы (DamID) для высокой пропускной последовательности (DamID-след). Этот усовершенствованный способ обеспечивает более высокое разрешение и широкий динамический диапазон и позволяет анализировать DamID-SEQ данные в сочетании с другими данными секвенирования с высокой пропускной способностью, таких как чип-SEQ, РНК-SEQ и т.д.
The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is an alternative approach to chromatin immunoprecipitation (ChIP). An expressed fusion protein consisting of the protein of interest and the E. coli DNA adenine methyltransferase can methylate the adenine base in GATC motifs near the sites of protein-DNA interactions. Adenine-methylated DNA fragments can then be specifically amplified and detected. The original DamID assay detects the genomic locations of methylated DNA fragments by hybridization to DNA microarrays, which is limited by the availability of microarrays and the density of predetermined probes. In this paper, we report the detailed protocol of integrating high throughput DNA sequencing into DamID (DamID-seq). The large number of short reads generated from DamID-seq enables detecting and localizing protein-DNA interactions genome-wide with high precision and sensitivity. We have used the DamID-seq assay to study genome-nuclear lamina (NL) interactions in mammalian cells, and have noticed that DamID-seq provides a high resolution and a wide dynamic range in detecting genome-NL interactions. The DamID-seq approach enables probing NL associations within gene structures and allows comparing genome-NL interaction maps with other functional genomic data, such as ChIP-seq and RNA-seq.
ДНК метилтрансферазы идентификация аденин (DamID) 1,2 является метод обнаружения взаимодействий белок-ДНК в естественных условиях и является альтернативным подходом к иммунопреципитации хроматина (чип) 3. Он использует относительно небольшое количество клеток и не требует химической сшивки белка с ДНК или очень специфических антител. Последнее особенно полезно, когда целевой белок слабо или косвенно связаны с ДНК. DamID успешно используется для отображения сайты связывания различных белков, включая ядерное белков оболочки 4-10, хроматина белков, ассоциированных с 11-13, хроматина изменения ферменты 14, транскрипционных факторов и сопутствующих факторов и РНК-интерференции 15-18 механизмов 19. Метод применим в различных организмов, включая S. Cerevisiae 13, С. pombe 7, С. Элеганс 9,17, Д. MELANOGASTER 5,11,18,20, А. THALIANA 21,22, а также мыши и человека клеточных линий 6,8,10,23,24.
Разработка анализа DamID была основана на специфической детекции аденина-метилированных фрагментов ДНК в эукариотических клетках, которые не имеют эндогенной аденин метилирование 2. Выраженный слитый белок, состоящий из ДНК-связывающего белка, представляющего интерес и Е. палочка ДНК аденин метилтрансферазы (плотины), может метилировать аденин базу в последовательности GATC, которые находятся в пространственной близости (наиболее значительно в течение 1 кб и до примерно 5 кб) сайтов связывания белка в геноме 2. Модифицированные ДНК-фрагменты могут быть специфично амплифицируют и гибридизуют с микрочипов для выявления геномных сайтов связывания белка, представляющего интерес 1,25,26. Это оригинальный способ DamID был ограничен наличием микрочипов и плотности заданных зондов. Поэтому мы интегрировали высокой пропускной последовательности вчтобы DamID 10 и обозначены метод как DamID-SEQ. Большое количество краткосрочных читает полученные от DamID-SEQ позволяет точную локализацию взаимодействий белок-ДНК генома. Мы обнаружили, что DamID-след обеспечил более высокое разрешение и более широкий динамический диапазон, чем DamID по микрочипов для изучения генома ядерной пластинки (NL) ассоциации 10. Это усовершенствованный метод позволяет зондирования NL ассоциации в пределах гена структур 10 и облегчает сравнение с другими данными секвенирования высокой пропускной способностью, таких как чип-SEQ и РНК-SEQ.
DamID-след протокол, описанный здесь был первоначально разработан для отображения генома Л. объединений 10. Мы создали гибридный белок по привязывая мыши или человека Ламин B1 Е. палочка ДНК аденин метилтрансферазы и проходят протокол в 3T3 эмбриональных фибробластов мыши, мыши C2C12 миобластов 10 и IMR90 плода фибробласты легких человека (данные не опубликованы). В этом протоколе, мы начинаем с сonstructing векторы и выражая Дам-привязанных слитые белки от лентивирусного инфекции в клетках млекопитающих 24. Далее, мы опишем подробные протоколы усиления аденин-метилированных фрагментов ДНК и подготовке секвенирования библиотек, которые должны быть применимы в других организмах.
1. Генерация и экспрессия слитых белков и бесплатно Dam белков
2. Усиление аденин-метилированных фрагментов ДНК
3. Библиотека Подготовка к высокопроизводительного секвенирования
Гибридный белок Dam-V5-LmnB1 была проверена быть совместно локализованы с эндогенного белка по иммунофлуоресцентного Ламин B (рис 1).
Успешное ПЦР-амплификации из аденина-метилированных фрагментов ДНК является ключевым шагом для DamID-SEQ. Экспериментальные образцы должны усиливать мазок 0,2 - 2 Кб, отрицательных контролей (без DpnI, без лигазы или без ПЦР шаблона) должно привести к не-или-менее ясно усиления (рис 2).
Метилированные фрагменты ДНК находятся в диапазоне от 0,2 до 2 кб, в то время как желаемый размер вставки для библиотеки NGS составляет от 200 до 300 п.н.. Таким образом, важно, чтобы фрагментировать метил продуктов ПЦР в подходящем диапазоне размеров. Тем не менее, было установлено, что непрактично одновременно разрушить большие фрагменты ДНК до подходящего размерас и сохранить большинство более мелких фрагментов ДНК интактных продолжительности одного фрагментации. Таким образом, эксперименты курс время были выполнены, чтобы определить минимальное время (Т 0.2kb), необходимых для фрагмент 1 мкг ДНК в мазке с центром в 200 б.п. (рис 3). Тогда 6 раз продолжительность в равных приращений были отобраны от 5 мин и Т 0.2kb для фактического фрагментации. Ферментативная активность двойной цепи ДНК Fragmentase может варьироваться от партии к партии и может уменьшаться с течением времени, поэтому рекомендуется повторить этот шаг для новой партии Fragmentase или после хранения в течение определенного периода времени.
Желаемый размер вставки между 200 и 300 п.н., соответствующих фрагментов ДНК от 300 пар оснований и 400 (в том числе 121 п.н. секвенирования адаптеров) на агарозном геле. Три тонкие ломтики в этом диапазоне вырезали из каждого экспериментального образца, чтобы сузить диапазон размеров библиотеки и увеличить возможностьполучения по крайней мере одного квалифицированного библиотеку секвенирования (рисунок 4).
Аликвоту из 5 мкл каждого амплифицированной библиотеки ДНК анализировали на агарозном геле, чтобы определить, какие библиотеки могут претендовать на последовательности. Как показано на фиг.5А, четкое одну полосу того же размера, вырезанной куска геля должна быть видна на агарозном геле (этап 3.7.4). Далее, выбранные библиотеки были рассмотрены в Bioanalyzer (рис 5B), чтобы определить точный диапазон размера и концентрации до секвенирования. При желании, амплифицированные ДНК-библиотек могут быть непосредственно осмотрены Bioanalyzer без анализа гель. Когда несколько библиотек имеют хорошее качество, рекомендуется последовательность библиотек аналогичного размера колеблется в течение пары экспериментальных (клеток, экспрессирующих Дам-V5-POI) и контроля (клетки, экспрессирующие V5-Дам) образцы.
Короткий читает порождаетсяупорядоченные системы были впервые отображены обратно к соответствующему генома. Уникально выровнены читает затем были переданы в последующих анализах. Трубопровод для обработки короткого читает, построить генома Л. карту взаимодействия анализа генов и-NL ассоциации были подробно описаны в нашей предыдущей работе 10. Типичные результаты показаны на фиг.6.
Рисунок 1. Проверка субъядерных локализации слитых белков иммунофлуоресцентного. IMR90 человека фибробластов легких клетки трансфицированы плазмидой, выражающей Дам-V5-LmnB1 и окрашивали анти-Ламин B (A, красный) и анти-V5 (B, зеленый). (С) Слияние изображений в А и В. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию Тего фигура.
Рисунок 2. ПЦР амплификации аденин-метилированных фрагментов ДНК. Аликвоту 5 мкл от каждой ПЦР-реакции анализировали на 1% агарозном геле. Мазок от 0,2 до 2 кб усиливается с каждой экспериментальной выборки, но не усиление не наблюдалось отрицательных контролей (не DpnI в шаге 2.1, не лигазы в шаге 2.2, или нет шаблона ПЦР). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию из этой фигуры.
Рисунок 3. Определение оптимальных длительности фрагментации. Очищенные продукты ПЦР метил подлежали дроблению на время длительности от 5 до 55 мин при приращения 10 мин (непереваренной ДНК , Помечены как "0 мин"). 1 мкг ДНК лестнице и 0,5 мкг каждого образца ДНК фрагментированной анализировали на агарозном геле. Минимальное время для переваривания большинство мазка ДНК приблизительно 200 п.н. был определен около 35 мин, поэтому шесть равномерно расположенных времени продолжительности от 5 до 35 мин (5 и 35 мин в комплекте) были выбраны для выполнения фактического фрагментации. Пожалуйста, Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Размер выбора библиотеки ДНК. Образцы ДНК Дам-V5-LmnB1 и V5-Дам с шага 3.6 были работать на 2% агарозном геле, и три одинаковых по размеру кусочки геля (L, M и H, соответствующий низкий, средний и высоко в размере) вырезали между 300 и 400 п.о., как показано желтых линий. ом / файлы / ftp_upload / 53620 / 53620fig4large.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5. Библиотеки амплифицированной ДНК для секвенирования высокой. (А) Усиленный библиотек ДНК анализировали на агарозном геле. Шаблоны ПЦР очищали из геля ломтиками указанных на фиг.4. (Б) Результаты Bioanalyzer о V5-Дам (L) выборки и плотины-V5-LmnB1 (L) выборки, которые были подчеркнуты в (а). Эти две библиотеки были подобные диапазоны узкие размера и, следовательно, право на высокой пропускной последовательности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
JPG "/>
Рисунок 6. Данные, отображаемые в NGS УСК генома браузер. Mouse хромосомы 1 в качестве примера. Данные последовательности были получены из мыши С2С12 миобластов 10. Треки "MB.LmnB1.w2k" и "MB.Dam.w2k", что соответствует данным клеток, экспрессирующих Дам-V5-LmnB1 и V5-Dam, соответственно, участок нормализуется плотности чтения (чтение за килобаза на миллион однозначно отображается читает, или RPKM ) в непересекающихся подряд окон 2 кб вдоль хромосомы. Трек "MB.log2FC.w2k" участки генома NL ассоциации, то есть log 2 RPKM отношения LmnB1 более плотины, в разрешением 2 кб. Трек "MB.sLADs" рисует секвенирования на основе Lamina Ассошиэйтед Домены (sLADs, т.е. геномных регионов, имеют более высокие плотности читаем LmnB1 над плотины со статистической значимостью) в черной, не sLADs в серых и неопределенных областей в белом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы downloaD этот файл.
Whether Dam-tagged proteins retain the functions of endogenous proteins should be examined before a DamID-seq experiment. The subcellular localization of Dam-tagged nuclear envelope proteins should always be determined and compared with that of the endogenous proteins. For studying transcription factors, it is suggested to examine whether the Dam-fusion protein can rescue the functions of the endogenous protein in regulating gene expression. This functional test can be performed in organisms in which knockout mutants of endogenous DNA-binding proteins are available. Because advances in genome engineering have potentially allowed knocking out any endogenous gene of interest, functions of Dam-tagged DNA-binding proteins can be examined in cultured mammalian cells.
The critical step in this protocol is to successfully fragment the DpnII-digested DamID PCR products to around 200 bp. This step is designed to render the amplified adenine-methylated fragments to a narrow size range for sequencing and to randomize the starting nucleotides of the DNA fragments in a sequencing library. Inefficient fragmentation will leave the majority of the DNA fragments starting with GATC (the 5'-overhang from the second DpnII digestion), and will result in a much lower performance and yield or even a failure in Illumina sequencing. Other DNA fragmentation methods may be used as an alternative approach.
The resolution of DamID (and DamID-seq described here) is limited by the frequency of GATCs in the genome to be studied. Moreover, even with high throughput sequencing, the genomic localizations of a DNA-binding protein can only be mapped within two consecutive GATCs rather than to the actual DNA-binding sites.
Despite its limitation, the DamID assay has important advantages. Because DamID does not require highly-specific antibodies, it can be used to detect a subset of nuclear proteins that could be difficult to assay by ChIP (such as the nuclear envelope proteins). To study how these proteins regulate genome functions, it is important to integrate and cross-analyze their genome-wide localization data with the current epigenomic mapping data (such as data from the ENCODE and NIH Roadmap Epigenomics Projects 30,31). The DamID-seq approach provides both higher resolution and higher sensitivity than DamID by microarray and enables detecting differential NL-associations within gene structures 10. A combinatorial analysis of DamID-seq data, ChIP-seq data 32 and gene expression data has identified a class of NL-associated genes with distinct epigenetic and transcriptional features (data not published).
Another advantage of DamID is that it only requires a small number of cells. In recent years, there has been an explosion in single cell analysis of gene regulation 33,34. Although genome sequence 35, genome-wide gene expression 36 and chromatin conformation 37 can be assayed in a single cell, there has not been an available approach for detecting protein-DNA interactions genome-wide in a single cell. DamID-seq is a highly promising approach for this goal, and may complement the single cell imaging approach in detecting the dynamics of genome-NL interactions 38. One complication is that because the Dam-fusion protein is expressed at a much lower level than the endogenous protein in the DamID assay, it is possible that the Dam-fusion protein may only occupy a subset of genomic binding sites as compared to the endogenous protein.
DamID assay has mostly been used in cultured animal cells to detect protein-DNA interactions. Notably, developmental biologists have applied this assay in detecting protein-DNA interactions in specific cell types in vivo. For example, Dam-tagged RNA polymerase II was expressed specifically in Drosophila neural stem cells to detect their genome-wide occupancy without cell isolation 39. DamID-seq will be highly useful to study the genome-wide localizations of nuclear envelope proteins, transcription factors and chromatin regulators during development in animal models.
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. Bas van Steensel for providing the DamID mammalian expression vectors. We thank Yale Center for Genome Analysis and the Genomics Core in Yale Stem Cell Center for advice on preparing NGS libraries and implementing high throughput DNA sequencing. This work was supported by the startup funding from Yale School of Medicine, a Scientist Development Grant from American Heart Association (12SDG11630031) and a Seed Grant from Connecticut Innovations, Inc. (13-SCA-YALE-15).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
ViraPower Lentiviral Expression Systems | Life Technologies | K4950-00, K4960-00, K4970-00, K4975-00, K4980-00, K4985-00, K4990-00, K367-20, K370-20, and K371-20 | |
Gateway BP Clonase II Enzyme Mix | Life Technologies | 11789-020 | |
Gateway LR Clonase II Enzyme Mix | Life Technologies | 11791-020 | |
DNeasy Blood & Tissue Kit (250) | QIAGEN | 69506 or 69504 | |
Gateway pDONR 201 | Life Technologies | 11798-014 | |
293T cells | American Type Culture Collection | CRL-11268 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Life Technologies | 25300-054 | |
DMEM, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 11995-065 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma | F4135 | |
Tris | brand not critical | ||
EDTA | brand not critical | ||
200 Proof EtOH | brand not critical | ||
Isopropanol | brand not critical | ||
Sodium Acetate | brand not critical | ||
DpnI | New England Biolabs | R0176 | supplied with buffer |
DamID adaptors "AdRt" and "AdRb" | Integrated DNA Technologies | sequences available in ref. 24; no phosphorylation of the 5' or 3' end to prevent self-ligation. | |
T4 DNA Ligase | Roche Life Science | 10481220001 | supplied with buffer |
DpnII | New England Biolabs | R0543 | supplied with buffer |
DamID PCR primer "AdR_PCR" | Integrated DNA Technologies | sequences available in ref. 24 | |
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set | New England Biolabs | N0446 | 100 mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP |
Advantage 2 Polymerase Mix | Clontech | 639201 | supplied with buffer |
1Kb Plus DNA Ladder | Life Technologies | 10787018 | 1.0 µg/µl |
QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 or 28106 | |
MinElute PCR Purification Kit | QIAGEN | 28004 or 28006 | for an elution volume of less than 30 µl |
SPRI beads / Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63880 | apply extra mixing and more elution time if less than 40 µl elution buffer is used |
Buffer EB | QIAGEN | 19086 | |
NEBNext dsDNA Fragmentase | New England Biolabs | M0348 | supplied with buffer |
T4 DNA Ligase Reaction Buffer | New England Biolabs | B0202 | |
T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | M0203 | |
DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment | New England Biolabs | M0210 | |
T4 Polynuleotide Kinase | New England Biolabs | M0201 | |
Klenow Fragment (3’ → 5’ exo-) | New England Biolabs | M0212 | supplied with buffer |
sequencing adaptors | Integrated DNA Technologies | sequences available in ref. 28 | |
Quick Ligation Kit | New England Biolabs | M2200 | used in 3.4.3; supplied with Quick Ligation Reaction Buffer and Quick T4 DNA Ligase |
sequencing primer 1 and 2 | Integrated DNA Technologies | sequences available in ref. 28 | |
KAPA HiFi PCR Kit | Kapa Biosystems | KK2101 or KK2102 | supplied with KAPA HiFi DNA Polymerase, 5x KAPA HiFi Fidelity Buffer and 10 mM dNTP mix |
agarose | Sigma Aldrich | A4679 | |
ethidium bromide | Sigma Aldrich | E1510-10ML | 10 mg/ml |
QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 or 28706 | |
iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad Laboratories | 1725121 or 1725122 | |
Spectrophotometer | brand not critical | ||
0.45 μm PVDF Filter | brand not critical | ||
25 ml Seringe | brand not critical | ||
10 cm Tissue Culture Plates | brand not critical | ||
6-well Tissue Culture Plates | brand not critical | ||
S1000 Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories | ||
C1000 Touch Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories | for qPCR | |
Vortex Mixer | brand not critical | ||
Dry Block Heater or Thermomixer | brand not critical | ||
Microcentrifuge | brand not critical | ||
Gel electrophoresis system with power supply | brand not critical | ||
Magnet stand | for purification of DNA with SPRI beads; should hold 1.5-2 ml tubes; brand not critical | ||
UV transilluminator | brand not critical | ||
E-gel electrophoresis system | Life Technologies | G6400, G6500, G6512ST |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены