Method Article
Luminescent identification of functional elements in 3’ untranslated regions (3’UTRs) (3’LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3’UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.
Люминесцентные Идентификация функциональных элементов в 3'UTRs (3'LIFE) позволяет быструю идентификацию целей конкретных микроРНК в массиве сотен запрашиваемых 3'UTRs. Целевой идентификации основан на двойной люциферазы, который обнаруживает связывания на уровне мРНК путем измерения поступательное выход, давая функциональный считывание микроРНК ориентации. 3'LIFE использует неимущественные буферы и реагенты, и публично доступные репортер библиотеки, делая генома экраны целесообразным и экономически эффективным. 3'LIFE может быть выполнена либо в стандартном лабораторных или расширены с использованием жидких роботов обработки и другой высокой пропускной приборы. Проиллюстрируем подход с использованием набора данных человеческих 3'UTRs клонированных в 96-луночных планшетах, и двух испытаний микроРНК, пусть-7c, и микроРНК-10b. Мы показываем, как выполнять препарат ДНК, трансфекцию, культуры клеток и люциферазы анализов в формате 96-луночного, и предоставляют инструменты для передачи данныхАнализ. В заключение 3'LIFE хорошо воспроизводим, быстрый, систематический и определяет высокие цели доверительные.
Общая цель этого метода заключается в выявлении и точно карту микроРНК (микроРНК) цели в высокой пропускной. МикроРНК эндогенные некодирующие РНК ~ 22 нуклеотидов в длину. После транскрипции и обработки, зрелые микроРНК включены в белковый комплекс называется РНК индуцированного глушителей комплекса (RISC). Каждый микроРНК направляет RISC целевых элементов, расположенных в основном в регионах 3'untranslated (3'UTRs) в матричных РНК (мРНК), в результате чего либо репрессий перевода или мРНК расщепления 1. Мирна признать целевые сайты, основанные на стандартной Уотсона-Крика и G: U раскачиваться спаривание оснований, и вырождаются в природе, содержащий несколько ошибочно спаренных пар оснований и выпучил регионы. Многие микроРНК широко сохраняется от растений до человека 2,3, где они играют широкий спектр биологических функций. В многоклеточных микроРНК могут влиять несколько биологических процессов, включая судьбы клеток решениями 4, сроков развития 5 И часто демонстрируют тканеспецифические паттерны экспрессии 6,7. Мирна неправильная экспрессия может также привести к аномальным регуляции генов, которые могут иметь существенное влияние на поведение клеток, основанной исключительно на функции генов-мишеней. Таким образом, микроРНК связаны с широким спектром заболеваний, в том числе нейродегенеративных 8,9, диабета и рака 10 11. Биоинформационный и мокрого стендовые подходы позволяют предположить, что каждая микроРНК могут быть способны ориентации от сотен до тысяч различных мРНК 12-14, что указывает на высокую пропускную способность или геномные широкие подходы для зонда этот большой круг потенциальных взаимодействий.
Определение целевых генов критическим компонентом механистически определяющей функции микроРНК, и сделать так, исследователи должны быть в состоянии выявить цели на больших масштабах. Несколько подходов были разработаны для выявления микроРНК целей, в том числе по биоинформатике алгоритмов прогнозирования, высокой пропускной последовательностицелевых мРНК, и журналистом анализов. Каждый из этих подходов имеет присущие сильные и слабые стороны. Учитывая, что микроРНК нацеливание ориентируется на специфичность последовательности, в первую очередь из нуклеотидов 2-6 миРНК (называемый запальной зоне), несколько алгоритмов были разработаны, чтобы предсказать целевые микроРНК во всем геноме многих организмов. Эти алгоритмы обучаются с помощью наблюдаемых спаривание оснований мотивы проверенных целей микроРНК, и часто используют такие параметры, как строгий семян спаривания, сохранения сайте, и / или термодинамической стабильности 15. В то время как эти фильтры результаты большого количества предполагаемых целей с достаточной комплементарности к только высоких целей доверия, они могут исключить видовой и неканонические микроРНК целевых сайтов, которые последние данные свидетельствуют о широко распространены 16-24. Кроме того, эти прогнозы не учитывают механизмы процессинга мРНК, которые исключают микроРНК целевых сайтов, таких как альтернативного полиаденилирования25, 26 редактирование РНК, РНК метилирование 27 и кооперативное связывание. Таким образом, высокие ложные положительные и ложные отрицательные темпы были зарегистрированы в течение многих алгоритмов 22,24,28. В то время как эти алгоритмы полезны для выявления возможных микроРНК целей для последующей экспериментальной проверки, эти высокие коэффициенты ошибок ограничить эффективность биоинформатики подходов к систематической микроРНК обнаружения цели.
Систематически исследовать взаимодействие между данной микроРНК и потенциально целевых 3'UTRs мы разработали высокой пропускной анализа под названием Люминесцентные Идентификация функциональных элементов в 3'UTRs (3'LIFE) 24. Этот анализ мер прямого взаимодействия и репрессии трансляции испытательного 3'UTR запросом микроРНК с использованием двойной системы люциферазы репортер. В этой системе, 3'-UTR из интересующего гена клонируют на выходе из люциферазы светлячка (fluc) репортера рамке считывания. Репортер минусыtruct котрансфицирована с запросом микроРНК в клетках HEK293T. МикроРНК нацеливание определяется путем измерения относительного изменения между испытательной fluc :: 3'UTR репортера и второй неспецифической репортера люциферазы Renilla. Важно отметить, что люциферазы анализы обнаружить функциональные взаимодействия микроРНК / мРНК, которые влияют на поступательное выход репортера. Это главное преимущество по сравнению с традиционными методами для обнаружения регулирования микроРНК, например, RT-КПЦР и западных пятна, что это обходит различия в деградации мРНК и репрессии трансляции, а также изменения в белковых изобилии независимого регулирования, основанного 3'UTR.
Люциферазы анализы широко используются для проверки прямых целей микроРНК из-за их относительной простоты и чувствительности, но их использование в экранах с высокой пропускной способностью ограничено высоких затрат, связанных с расходными реагентами, отсутствие 3'UTR библиотек из общедоступных источников, и отсутствие стандартизированных люциферазы протocols, что приводит к трудностям в сравнении функциональную репрессии по нескольким наборам данных. Для облегчения использования 3'LIFE анализа, мы делали акцент на упрощение экспериментального проектирования, использования некоммерческих трансфекции 24 и люциферазных реагентов 29, создавая 3'UTR библиотеку, которая регулярно обновляется и расширяется, и доступна через хранилище общественной плазмиды 30.
Масштабируемость 3'LIFE анализа позволяет скрининг большого 3'UTR библиотеки для нацеливания на заданное миРНК без смещения в направлении экрана bioinformatically идентифицированных генов. В дополнение к тестированию канонические и предсказанные взаимодействия, это системный подход позволяет выявить новых целей приводом с помощью неканонических и / или видов-специфических взаимодействий. Важно отметить, что эффект микроРНК ориентации на производство белка, как правило, понимается привести к скромной репрессии трансляции 15,31 </ SUP>, предполагая, что основная роль регулирования микроРНК является точной настройки выходного белка, защиты от аберрантных уровней экспрессии генов, а также обеспечить надежность на мобильные конкретные программы 32,33. Чувствительность анализа люциферазы в сочетании с изначально большим числом отрицательных взаимодействий микроРНК / мРНК в экране 3'LIFE позволяет обнаруживать тонких эффектов микроРНК ориентации на большом количестве генов, и идентификацию множества компонентов генных сетей, которые регулируются данной микроРНК 24.
Здесь мы опишем протокол 3'LIFE, и продемонстрировать это технико-экономическое путем скрининга два хорошо охарактеризованные микроРНК Мир-10b, и пусть-7c против панели 275 человека 3'UTRs (рисунок 1).
1. Культура клеток (24-48 ч до трансфекции)
2. Подготовка перед трансфекцией
_content "> Примечание: подготовка буферов и плазмидной ДНК на стадии 2,0-2,2 должна быть выполнена за несколько дней до трансфекции с подготовкой этих реагентов может занять много времени.3. Подготовить следующие предметы непосредственно перед Трансфекцию
4. Подготовка плазмидной ДНК и клеточной смеси
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий протокол предполагает трансфекции три 96-луночных в одном эксперименте для экрана с двумя микроРНК (miRNA- # 1 и # 2 miRNA-). Каждая пластина будет соответствовать той же 96-луночного планшета в pLIFE-3'UTR плазмид, и лечиться три раза pLIFE-микроРНК-пустой, pLIFE-miRNA- # 1, или pLIFE-miRNA- # 2.
5. Трансфекция
6. клеточного лизата Подготовка к люциферазы
7. Двойной анализа люциферазы
ПРИМЕЧАНИЕ: Если несколько пластин измеряется последовательно на одном люминометра, создать буферные смеси мастер со всем, кроме АТФ и субстратов, добавив эти реагенты с последующим доведением рН непосредственно перед использованием с каждой пластины. АТФ и субстраты могут со временем ухудшаться; последовательность в количестве времени, эти реагенты в буфере улучшит согласованность между несколькими пластинами.
Анализ 8. Данные
Выход люминометра файл содержит сырые измерения для обоих светлячков и Renilla люциферазных белков. Это сырье формат совместим с "3'LIFE - одноместное анализа пластины" и "3'LIFE - многодисковое анализа" электронных таблиц доступной из лаборатории сайт Mangone ( www.mangonelab.com ). Одну таблицу анализ пластина автоматически вычисляет светлячка / соотношение Renilla, нормализует каждый Мирна к соответствующему отрицательного контроля, нормализует значения репрессий по каждой пластины. Эта таблица автоматически определяет скважин с низким Renilla люциферазы сигнала, подчеркивает скважин, которые обладают репрессии по сравнению с отрицательным контролем, и обеспечивает репрессии по всей пластине (рисунок 2). См 24 для детального объяснения статистического анализа.
Несколько повторов можно анализироватьд с помощью "анализа многодисковое" таблицу. Каждый повторной сравнивается бок о бок, и статистические показатели данных рассчитываются автоматически (рисунок 3). В дополнение к сравнению повторов с «нормализованной репрессий" колонки, пользователь может сравнить репрессии между двумя микроРНК под "микроРНК # 1 / # 2 микроРНК" столбцов. Эта мера делит индекс репрессии для каждого микроРНК для каждой повторности. Эта мера может указывать ошибочных значений из люциферазы (например аномально высокие или низкие показания с отрицательным контролем, рисунок 3, строка A9, Rep # 3), и лунки, где индекс репрессии не могут указывать значительную репрессии, но, что делать демонстрируют существенные различия между микроРНК. В то время как эта мера не может быть использован непосредственно для указания цели микроРНК, это полезно для выявления выбросов, проблемные скважины, или закономерности в данных, которые не только отнести направить микроРНК Regulation.
Репрессии индекс (RI), используется для вызова предполагаемый микроРНК цель, с более низкими значениями, соответствующими высокой относительной репрессий. Порог для вызова предполагаемых целей на основе уровня жесткости, требуемого исследователя, но комбинируя RI с 3'UTRs, которые отображают статистически значимые р-значения (р <0,05) укажет высокое доверие цели (рис 2 Строки В8 и В12).
Рисунок 1: 3'LIFE анализ (А). Шлюз-совместимые векторы, используемые в анализе 3'LIFE. Вверху: ген люциферазы (FLuc) слит с 3'-UTR тестовой, в то время как ген люциферазы Renilla (RLuc) слит с неспецифической SV40 рА 3'-UTR в качестве контроля. Внизу: RFP- микроРНК-интрон вектор - зонд предварительно микроРНК, плюс ~ 400нуклеотидов в пределах своей геномной локуса (резюмировать эндогенного обработку микроРНК), клонируют в интрона, чтобы его сотрудничество с выражением DsRed2 флуорохромом. Оба вектора публично доступны (Зайлер и др., 2013). (Б) Блок-схема на 3'LIFE анализе. (С) 3'LIFE трубопроводов: двойной люциферазы вектор, содержащий тестовый 3'UTR с или без векторов микроРНК ко-трансфицировали в клетки HEK293 в 96-луночных планшетах. Взаимодействие между микроРНК и добросовестного 3'UTR цели снизит относительную свечение в отдельных скважинах (на примере оранжевым пятном в экспериментальной пластины).
Рисунок 2: Пример данных, полученных с 3'LIFE анализа. Каждый зонд микроРНК тестируется в четырех (повторяет 1-4). Цвета представляют уровни репрессий, с краснымцвета, указывающие сильный микроРНК / 3'UTR взаимодействия. Все повторности усредняются для получения высокого качества предполагаемых целей, показанные в итоговом пластины ниже желтой стрелкой. Белая коробка представляет управления, не удалось трансфекций или скважин с низкой эффективностью трансфекции.
Рисунок 3:. Таблица, представляющая сводные данные подмножества взаимодействий, произведенных с использованием 3'LIFE таблицу Значения репрессии являются как показано на рисунке 2. Программа вычисляет стандартное отклонение, стандартная ошибка и Z-счет для каждого взаимодействия. Статистически значимых взаимодействий отмечены красным. Последние четыре строки показывают относительную репрессии одной микроРНК в друга, и используется в качестве вторичного показателя для сравнения репрессии между двумя различными микроРНК. Таблицы могут быть загружены с www.mangonelab.com
Таблица 1: Фото люциферазы светляков реактивы: 10x Исходные растворы глицилглицин, К х PO 4, MgSO 4, DVB-T и ЭГТА могут быть получены отдельно и хранятся до буфера восстановления. 100x Жук Люциферин (люциферазы светляков субстрат) может быть магазинd путем растворения 50 мг люциферин в 7,134 мл H 2 0 (25 мм). Алиготе 105 мкл / чашку растворенного Beetle люциферина в пробирки и хранят при -80 ° С. За технической поддержкой Промега, это должно быть стабильным в течение> 6 месяцев, но может быть чувствительна к свету. ПРИМЕЧАНИЕ: ЭГТА не переходят в раствор при нейтральном рН. Медленно добавляют NaOH до EGTA, пока он не полностью растворяется. * Реагенты добавл ли до конечных буфере непосредственно перед люциферазы
Renilla люциферазы буферные реагенты | Конечная концентрация (1x) |
NaCl | 1.1 М |
На 2 ЭДТА | 2,2 мм |
KH 2 PO 4 | .22 М |
NaN 3 | 1,3 мм |
БСА * | 0,44 мг / мл |
Коэлентеразин * | 2.5 & #956; М |
Таблица 2: сток Renilla люциферазы буферные реагенты Все реагенты, кроме BSA и коэлентеразином могут быть смешаны в концентрации 1х и хранили при комнатной температуре. Коэлентеразином можно растворить в подкисленным метанолом и аликвоты каждой чашке. Подкислите метанол добавлением HCl до конечной концентрации 5 мМ (<3 рН). Растворите 250 мкг коэлентеразин в 2,36 мл метанола подкисляют (250 мкМ) аликвотные 105 мкл / пластина. Смесь стабильна в течение по крайней мере 6 месяцев, но может быть чувствительна к свету. * Реагенты добавляют в буфер непосредственно перед люциферазы.
3'LIFE анализ выявляет функциональные цели микроРНК в 3'UTRs в высокой пропускной. Этот анализ является полезным для исследователей, которые хотят, чтобы экспериментально определить большое количество предполагаемых целей их микроРНК интерес. 3'LIFE анализ является мощным подход для запроса 3'UTR приводом регулирования, в том анализ обеспечивает функциональную меру микроРНК адресности и двоичный тестирование одного репортера :: 3'UTR против одного микроРНК можно с уверенностью решения таргетинг состояние отдельных генов. Для проверки этого подхода, мы провели скрининг панель 275 3'UTRs и против двух микроРНК, пусть-7с и Мир-10b, и включены 10 ранее утвержденные целевые гены в этой библиотеке. Восемь из этих десяти генов выставлены репрессии 24. Мы также наблюдали значительное обогащение необоснованных bioinformatically прогнозируемых целей, и непредвиденных 3'UTRs, которые содержат канонические элементы семян среди наших топ-хитов, SuGgesting что 3'LIFE способна определять добросовестных микроРНК целей.
Ключевым показателем чувствительности экранов высокой пропускной это ложные положительные и ложные отрицательные темпы. В то время как процент ложных срабатываний этого анализа необходимо оценить с помощью дополнительных альтернативных подходов для проверки хиты, восемь из десяти положительных контролей включены в наш доказательством правильности принципа экран выставленный репрессий, предлагая ложные отрицательные темпы 20%. Тем не менее, многие методы используются для идентификации микроРНК цели в различных клеточных контекстах, и обработка 3'-UTR и регулирование транс-действующих факторов, как известно, высоко специфический ткани. Например, большинство 3'UTRs содержать несколько сайты полиаденилирования, которые контролируют длину 3'-UTR в зрелой мРНК. Во многих случаях использование проксимальных участках полиаденилирования специфичен ткани, и может исключить микроРНК целевых сайтов. Кроме того, кооператив таргетинг микроРНК, конкуренция Wiй РНК-связывающие белки, и мРНК вторичная структура может все это влияет способность 3'LIFE обнаруживать цели микроРНК в определенных тканях. Из-за этого, обнаружение мишеней в анализе 3'LIFE может изменяться в зависимости от клеточного контекста, в котором осуществляется анализ, усложняя оценку абсолютных коэффициентов ошибок. Этот протокол оптимизирован для HEK293T клеток, но альтернативные клеточные линии могут быть использованы, если исследователь хочет выполнить анализ в специфической биологической контексте. Тем не менее, оптимизации эффективности трансфекции и выживание клеток с каждой клеточной линии должны быть оптимизированы с использованием нескольких буферных условий, импульсные коды, и количество клеток. Пример схемы оптимизации можно найти на Wolter соавт. 24.
Этот протокол был оптимизирован в формате 96-луночного и определяет использование определенной высокой пропускной приборов. В случае, учреждение не имеет оборудование, необходимое для 96Ну Nucleofection, альтернативные реагенты трансфекции может быть использован для выполнения анализа 3'LIFE, при условии, что эффективность трансфекции остается высокой. Кроме того, анализ люциферазы является наиболее трудоемким аспектом 3'LIFE анализа. Таким образом, использование нескольких люминометров рекомендуется для экранов высокой пропускной.
This work is supported by funds from the College of Liberal Arts and Science and the Biodesign Institute at Arizona State University and NIH Exploratory/Developmental Research Grant 1R21CA179144-01A1.
We thank Stephen Blazie, Karen Anderson, Josh LaBaer for advice and discussion. Karen Anderson, John Chaput, and Josh LaBaer for sharing reagents and instrumentation, Michael Gaskin and Andrea Throop for technical advise and protocols. Justin Wolter is a Maher scholar and thanks the Maher family for their generous support.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | |||
glycylglycine | Sigma | G1127-25G | |
Kx PO4 | Sigma | P2222 | |
EGTA | Sigma | E3889 | |
ATP | Sigma | FLAAS | |
DTT | Sigma | D0632 | |
MgSO4 | Sigma | M7506 | |
CoA | Sigma | C4282 | |
luciferin | Sigma | L9504 | |
NaCl | Sigma | S7653 | |
Na2EDTA | Sigma | E0399 | |
K H2 P O4 | Sigma | 1551139 | |
BSA | Sigma | A2153 | |
NaN3 | Sigma | S2002 | |
Coelenterazine | Sigma | C3230 | |
PBS/HEPES | Corning | 21-040-CV | |
DMEM | Sigma | D5546 | |
FBS | Sigma | F2442 | |
Pennicilin/Streptomicin | Sigma | P4333 | |
Trypsin | T2600000 | ||
Consumables | |||
MaxiPrep Kit | Promega | A2392 | |
96-well miniprep plate | Pall | 8032 | |
96-well shuttle plates | Lonza | V4SP-2096 | |
5x Lysis Buffer | Promega | E1941 | |
Instruments | |||
96-well GloMax Plate Reader | Promega | E9032 | |
Biomech FX Liquid Handler Robot | Beckmann | A31842 | |
4D-Nucleofector Core Unit | Lonza | AAF-1001 | |
96-well Shuttle System | Lonza | AAM-1001 | |
Cell Counter Countess | Invitrogen | C10227 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены