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Luminescent identification of functional elements in 3’ untranslated regions (3’UTRs) (3’LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3’UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.
功能元件发光鉴定3'UTRs(3'LIFE)允许数百查询3'UTRs的一个阵列内快速识别特定的miRNA的目标。目标识别是基于双荧光素酶测定法,其检测在mRNA水平通过测量平移输出,给人的miRNA靶向功能的读出绑定。 3'LIFE使用非专用的缓冲液和试剂,并公开提供记者库,使得全基因组屏幕可行和成本效益。 3'LIFE可以执行无论是在标准实验室环境或扩大了使用的液体处理机器人和其他高通量检测仪器。我们示出了使用克隆在96孔板人类3'UTRs和两个测试miRNA的数据集的方法, 让-7C和miR-10b中 。我们展示了如何执行DNA制备,转染,细胞培养和萤光素酶测定在96-孔格式,并提供工具用于数据分析。总之3'LIFE是高度可重复的,快速的,系统的,并确定高可信度的目标。
该方法的总体目标是检测并精确地映射微小RNA(miRNA)的目标高通量。 miRNA是内源性非编码RNA〜22个核苷酸长度。以下转录和加工,成熟miRNA在蛋白质复合物掺入称为诱导的沉默复合物(RISC)的RNA。每个miRNA引导RISC靶向主要位于信使RNA的3'非翻译区(3'UTRs)(的mRNA)分子,从而在任一翻译抑制或mRNA切割1。 miRNA的认识到基于标准的Watson-Crick和G靶位点:U摆动碱基配对,并在退化性质,包含多个错配碱基对和凸出的区域。许多miRNA的大致从植物保守到人类2,3,在那里他们发挥生物学作用的多元化。在后生动物miRNA能够影响多个生物过程,包括细胞命运决定4,发育时间5 ,并经常表现出组织特异性表达模式6,7。 miRNA的异常表达也可以导致异常的基因调控,其可以具有关于只对靶基因的功能基于细胞行为实质性影响。这样,微RNA被链接到一个宽范围的疾病,包括神经变性8,9,糖尿病10和癌症11。生物信息学和湿式工作台的方法表明,每个miRNA可以是能够靶向数百至数千不同的mRNA 12-14,表明高通量或全基因组的方法是必需的,以探测该大潜在的相互作用的池。
鉴定的靶基因是机械地限定的miRNA功能的重要组成部分,并且这样做的研究人员必须能够揭示大规模目标。几种方法已经被开发,以确定miRNA靶,包括生物信息学预测算法,高通量测序有针对性的mRNA,并根据记者分析。每一种方法都有固有的长处和短处。给出了miRNA的定位是通过序列特异性的指导下,最显着的核苷酸与miRNA的2-6的(称为点火区),若干算法已经被开发,以在整个许多生物的基因组中预测的miRNA靶。这些算法使用证实的miRNA靶的观察到的碱基配对图案培训,并经常利用的参数,如严格种子配对,现场保护,和/或热力学稳定性15。而这些滤波器缩小大量具有足够互补性的推定的目标,以仅高置信指标,它们可以排除种间特异性和非规范miRNA靶位点,其中最近的证据表明有广泛16-24。此外,这些预测没有考虑到mRNA加工的行为排除miRNA靶位点,如替代多聚腺苷酸账户机制25,RNA编辑26,RNA甲基化27,并协同结合。因此,较高的假阳性和假阴性率已经报道了很多算法22,24,28。虽然这些算法是有用的,以确定用于随后的实验验证候选miRNA靶,这些高错误率限制的生物信息学方法进行系统的miRNA靶标检测的功效。
为了系统地探测和给定的miRNA之间的相互作用可能有针对性3'UTRs我们已经开发了一个名为发光标识功能元素在3'UTRs(3'LIFE)24高通量检测。此测定法测量的直接相互作用,并测试3'UTR的通过使用双荧光素酶报告系统的查询的miRNA翻译抑制。在这个系统中,感兴趣的基因的3'UTR克隆萤火虫荧光素酶(fluc)记者阅读框架的下游。记者利弊truct被共转染在HEK293T细胞中的查询的miRNA。 miRNA的定位是通过测量测试fluc :: 3'UTR记者和一个第二非特异性海肾萤光素酶报道之间的相对变化来确定。重要的是,荧光素酶检测检测影响记者的平移功能输出的miRNA / mRNA的相互作用。这是优于传统方法的关键优势检测miRNA调节,如RT-qPCR的和Western印迹,在这绕过在mRNA降解和翻译抑制的差异,以及在蛋白质丰度的独立的3'UTR基于调节的变化。
萤光素酶测定法被广泛应用,以验证由于其相对简单和灵敏度,但它们在高通量筛选使用直接miRNA靶是通过用消耗品的试剂相关的高费用的限制,缺乏从公共来源3'UTR库,以及没有标准化的荧光素酶PROTocols,导致难以在多个数据集进行比较的功能抑制。为了方便使用3'LIFE分析,我们已经将重点放在了实验设计,利用非商业转24和 荧光素酶试剂29的简化,创造了3'UTR库定期更新和扩展,并且可通过公共质粒库30。
在3'LIFE检测的可扩展性使大3'UTR库筛选而不向偏置确定生物信息学的基因屏幕由给定miRNA的靶。除了测试规范和预测的相互作用,这种系统的方法允许通过非规范和/或物种特异性相互作用驱动的新靶标鉴定。重要的是,miRNA的对蛋白生产靶向的影响一般理解为导致适度翻译抑制15,31 </ SUP>,表明miRNA调节的一个主要作用是微调蛋白输出,防止基因表达的异常水平,并提供鲁棒性与细胞的具体方案32,33。萤光素酶测定法结合固有大量在3'LIFE屏幕负的miRNA / mRNA的相互作用的灵敏度允许检测的miRNA的靶上的大量基因的微妙的影响,和基因网络的多个组件的识别那由给定的miRNA 24进行调节。
在这里,我们描述了3'LIFE协议,并证明它的可行性通过筛选2良好表征的miRNA中,miR-10b和让-7c的对275人的3'UTRs( 图1)一个面板。
1.细胞培养(24-48小时之前转染)
2.准备在转染
_content">注意:应该在天转染前进行在步骤2.0-2.2的缓冲液和质粒DNA的制备,因为这些试剂的制剂可以是耗时的。3.准备下列项目紧接转
4.制备质粒DNA和细胞混合物
注意:下面的协议假定转染三个96孔平板在一个实验中对于具有两个微RNA(miRNA-#1和miRNA-#2)的画面。每块板将对应于相同的96孔平板的pLIFE-3'UTR质粒,并进行处理三次pLIFE-miRNA的空白,pLIFE-miRNA-#1,或pLIFE-miRNA-#2。
5。转
6.细胞裂解液准备萤光素酶检测
7.双萤光素酶检测
注:如果多个板块被测量顺序在一个光度计,创建缓冲区预混的一切,除了ATP和底物,加入这些试剂然后调节pH值应立即用每块板后再使用。 ATP和底物可能随时间降解;在时间这些试剂是在缓冲器量的一致性将改善在多个板的一致性。
8.数据分析
光度计的输出文件包含原始测量为萤火虫和Renilla荧光素酶的蛋白质。这种原始的格式与"3'LIFE -单盘分析"兼容,"3'LIFE -多片分析"表格可从Mangone实验室网站( www.mangonelab.com )。单板分析表格自动计算萤火虫/ 海肾比,标准化每个miRNA到相应的阴性对照,并在每个板压制标准化值。此电子表格自动识别井低Renilla荧光素酶信号,凸显井表现出抑制相比阴性对照,并提供了压制整个板的措施( 图2)。进行统计分析的详细解释见24。
多次重复可以分析d。使用的"多片分析"电子表格。每个重复比较并排,并且该数据的统计测量值自动计算( 图3)。除了比较重复与"归一压制"列,用户可以在"miRNA的#1 / miRNA的#2"的列比较两个微RNA之间压制。这一措施对于划分每个miRNA每个重复的压制指数。这一措施可指示从荧光素酶检测错误值(例如异常高或低的读数与阴性对照,参见图3,排A9,代表#3),和油井中的压制索引可能不表示实质压制,但这样做展出的miRNA之间显著的差异。虽然这一措施可以不直接用来指示一个miRNA靶标,它是用于识别未完全归因于直接的miRNA重新数据离群,有问题的井,或图案有用gulation。
所述压制指数(RI)用于调用一个假定miRNA靶,以对应于更高的相对抑制较低值。用于调用推定靶的阈值是基于由所述研究者需要严格性水平,但对RI与显示统计学显著p值(P <0.05)3'UTRs组合将指示高置信度的目标( 见图2排B8和B12)。
图1:3'LIFE测定(A)。 在3'LIFE实验中使用网关兼容载体。顶部:荧光素酶基因(FLuc)熔合到测试3'UTR,而Renilla荧光素酶基因(与Rluc)被融合到非特异性的SV40 pA的3'UTR作为对照。底部:本RFP-的miRNA - 内含子载体 - 预先的miRNA的探针,加〜400在其基因组基因座的核苷酸(复述源miRNA加工),被克隆的内含子内,以允许其共表达与的DsRed2荧光。这两种载体是公开可用的(塞勒等人 ,2013年)。 ( 二)流程图3'LIFE测定。 (C)的 3'LIFE管道:含有试验3'UTR具有或不具有所述miRNA的载体的双荧光素酶载体共转染到HEK293细胞在96孔板中。 miRNA的和善意的 3'UTR目标之间的相互作用将降低在特定的井相对发光(由橙色斑点在实验板为例)。
图2:3'LIFE试验中产生的数据样本 。每个探头的miRNA在测试一式四份(复制1-4)。颜色代表镇压水平,以红颜色指示强的miRNA / 3'UTR的相互作用。所有重复的平均值,以产生下面的黄色箭头摘要板显示高品质的假定目标。白框代表控制,失败或转染井转染效率低。
图3:表表示使用3'LIFE电子表格产生相互作用的子集的摘要数据的压抑值如在图2中的软件计算标准偏差,标准误差和z得分为每个交互。统计学显著的相互作用以红色标记。最后四个行表示一个miRNA的其他相对压制,并且被用作次级指示器到两个不同的miRNA之间比较压制。电子表格可以从以下网站下载www.mangonelab.com
表1:股票萤火虫荧光素酶试剂:10X股票甘氨酰甘氨酸的解决方案,; K X PO 4,硫酸镁,DTT和EGTA可以单独准备并储存前缓冲重建。 100X甲虫荧光素(萤火虫荧光素酶底物)可以存储ð在7.134毫升H 2 0(25毫米)将50毫克的荧光素。分装105微升/板溶解甲壳虫荧光素进入管和储存在-80ºC。每Promega公司的技术支持,这应该是稳定> 6个月,但可能是光敏感。注:EGTA不会进入中性pH溶液。慢慢紧接萤光素酶测定中添加氢氧化钠至EGTA,直到它完全溶解。*加入到最终缓冲液试剂
海肾荧光素酶试剂缓冲 | 终浓度(1X) |
氯化钠 | 1.1M的 |
的Na 2 EDTA | 2.2毫米 |
磷酸二氢钾 | 0.22 M |
NaN的3 | 1.3毫米 |
BSA * | 0.44毫克/毫升 |
腔肠* | 2.5&#956,M |
表2:库存Renilla荧光素酶缓冲试剂除外BSA和腔肠素的试剂可以以1倍浓度被混合并在室温下储存。腔肠素可以溶解在酸化的甲醇和每板等分。通过加入HCl至5mM的(<3的pH)最终浓度酸化甲醇。溶于2.36毫升酸化甲醇(250μM)等分105微升/板250微克腔肠。该混合物是稳定的,在至少6个月,也可以是光敏感。 *试剂添加荧光素酶试验之前立即缓冲。
所述3'LIFE测定标识在高通量3'UTRs官能miRNA靶。此法对研究者谁希望通过实验找出了大量的假定目标他们感兴趣的miRNA的有用。该3'LIFE测定法是有效的方法,以查询3'UTR从动调节,在该测定法提供了一个功能度量的miRNA靶向的,以及一个单一的记者的二进制测试:: 3'UTR针对单一的miRNA可以自信地解决各个基因的靶向状态。为了验证这种方法,我们筛选了275 3'UTRs一个面板和针对两种miRNA的, 让-7C和miR-10b和包括10这个库中先前验证靶基因。这十个八个基因压制展出24。我们还观察到一个显著富集未经确认的生物信息学预测目标,以及包含在我们的排名靠前的典型元素种子不可预知的3'UTRs,SUGgesting这3'LIFE能够识别真正的 miRNA的目标。
高通量筛选灵敏度的一个关键指标是假阳性和假阴性率。虽然这需要检测的假阳性率使用额外的替代方法,以验证命中进行评估,包括在证明型的原则,我们的屏幕表现出压抑的十个阳性对照八,这表明20%的假阴性率。然而,许多技术被用于识别在不同的细胞环境中的miRNA靶,和3'UTR处理和调节由反式作用因子是已知的特定高度组织。例如,大多数3'UTRs的包含多个多聚腺苷酸化位点,其中控制3'UTR在成熟mRNA的长度。在许多情况下,使用的近端多聚腺苷酸化位点是特定的组织,并且可以排除miRNA靶位点。此外,合作miRNA的目标,竞争无线第RNA结合蛋白和mRNA二级结构可以全部冲击3'LIFE的能力来检测miRNA靶在特定组织。正因为如此,由3'LIFE测定目标的检测可以基于在该测定法进行的细胞环境的不同而变化,复杂化绝对误差率的评估。此协议为HEK293T细胞进行了优化,但如果研究者希望在特定的生物环境进行测定的替代细胞系都可以使用。然而,转染效率和细胞存活与每个细胞系的优化将必须使用多个缓冲条件,脉冲代码和细胞数进行优化。的优化方案的一个例子可在 沃尔特等 24中找到。
此协议已被优化在96-孔格式,并指定使用某些高通量检测仪器。在这种情况下,该机构不具有所需的96的设备- 嗯核转,备选的转染试剂,可以用于执行3'LIFE测定法,只要转染效率仍然很高。此外,荧光素酶分析是3'LIFE测定的最耗时的方面。因此,使用多个光度计的推荐用于高通量筛选。
This work is supported by funds from the College of Liberal Arts and Science and the Biodesign Institute at Arizona State University and NIH Exploratory/Developmental Research Grant 1R21CA179144-01A1.
We thank Stephen Blazie, Karen Anderson, Josh LaBaer for advice and discussion. Karen Anderson, John Chaput, and Josh LaBaer for sharing reagents and instrumentation, Michael Gaskin and Andrea Throop for technical advise and protocols. Justin Wolter is a Maher scholar and thanks the Maher family for their generous support.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | |||
glycylglycine | Sigma | G1127-25G | |
Kx PO4 | Sigma | P2222 | |
EGTA | Sigma | E3889 | |
ATP | Sigma | FLAAS | |
DTT | Sigma | D0632 | |
MgSO4 | Sigma | M7506 | |
CoA | Sigma | C4282 | |
luciferin | Sigma | L9504 | |
NaCl | Sigma | S7653 | |
Na2EDTA | Sigma | E0399 | |
K H2 P O4 | Sigma | 1551139 | |
BSA | Sigma | A2153 | |
NaN3 | Sigma | S2002 | |
Coelenterazine | Sigma | C3230 | |
PBS/HEPES | Corning | 21-040-CV | |
DMEM | Sigma | D5546 | |
FBS | Sigma | F2442 | |
Pennicilin/Streptomicin | Sigma | P4333 | |
Trypsin | T2600000 | ||
Consumables | |||
MaxiPrep Kit | Promega | A2392 | |
96-well miniprep plate | Pall | 8032 | |
96-well shuttle plates | Lonza | V4SP-2096 | |
5x Lysis Buffer | Promega | E1941 | |
Instruments | |||
96-well GloMax Plate Reader | Promega | E9032 | |
Biomech FX Liquid Handler Robot | Beckmann | A31842 | |
4D-Nucleofector Core Unit | Lonza | AAF-1001 | |
96-well Shuttle System | Lonza | AAM-1001 | |
Cell Counter Countess | Invitrogen | C10227 |
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