Method Article
Luminescent identification of functional elements in 3’ untranslated regions (3’UTRs) (3’LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3’UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.
Luminiscentes Identificación de elementos funcionales en 3'UTRs (3'LIFE) permite la rápida identificación de los objetivos de miRNAs específicos dentro de una matriz de cientos de 3'UTRs consultados. La identificación del objetivo se basa en el ensayo de luciferasa dual, que detecta la unión a nivel de mRNA mediante la medición de la salida de la traducción, dando una lectura funcional de los genes miARN focalización. 3'LIFE utiliza buffers no propietarios y reactivos, y bibliotecas reportero públicamente disponibles, por lo que las pantallas de todo el genoma viable y rentable. 3'LIFE se puede realizar en un laboratorio estándar o ampliarse el uso de robots de manipulación de líquidos y otros instrumentos de alto rendimiento. Se ilustra el método utilizando un conjunto de datos de 3'UTRs humanos clonados en placas de 96 pocillos, y dos miRNAs prueba, vamos-7c y miR-10b. Demostramos cómo realizar la preparación de ADN, transfección, cultivo celular y ensayos de luciferasa en formato de 96 pocillos, y proporcionar herramientas para datosanálisis. En conclusión 3'LIFE es altamente reproducible, rápido, sistemático, e identifica objetivos de alta confianza.
El objetivo general de este método consiste en detectar y mapear precisamente microARN (miARN objetivos) en alto rendimiento. MiRNAs son endógenos ARN no codificantes ~ 22 nucleótidos de longitud. Después de la transcripción y el procesamiento, miRNAs maduros se incorporan en un complejo de proteína llamada el silenciamiento de ARN inducida complejo (RISC). Cada miRNA guía el RISC a elementos situados principalmente en las regiones 3 'no traducida (3'UTRs) de los ARN mensajeros (ARNm) diana, lo que resulta en cualquiera de traducción represión o mRNA división 1. Mirna reconocer sitios diana, según norma Watson-Crick y G: U wobble base de sincronización, y son degenerados en la naturaleza, que contiene varios pares de bases coincidentes y las regiones se hinchó. Muchos miRNAs son ampliamente conservadas de las plantas a los seres humanos 2,3, donde juegan una amplia gama de funciones biológicas. En metazoos miRNAs pueden influir múltiples procesos biológicos incluyendo las decisiones del destino celular 4, el calendario de desarrollo 5 , Y con frecuencia exhiben patrones de expresión específicos de tejido 6,7. MIRNA misexpression también puede resultar en la regulación génica aberrante, que puede tener una influencia sustancial en el comportamiento celular basada únicamente en la función de los genes diana. Como tal, miRNAs están vinculados a una amplia gama de enfermedades, incluyendo neurodegeneración 8,9, diabetes y cáncer 10 11. Bioinformática y enfoques húmedo banco sugieren que cada miARN puede ser capaz de apuntar a cientos de miles de ARNm distintos 12-14, lo que indica que se requieren enfoques sectoriales de alto rendimiento o del genoma para investigar este gran número de interacciones potenciales.
La identificación de genes diana es un componente crítico de la definición de la función mecánica miARN, y hacer lo que los investigadores deben ser capaces de revelar los objetivos a gran escala. Se han desarrollado varios enfoques para identificar los genes miARN objetivos, incluyendo los algoritmos de predicción bioinformáticas, secuenciación de alto rendimientodel objetivo ARNm, y el reportero ensayos basa. Cada uno de estos enfoques tiene fortalezas y debilidades inherentes. Dado que los genes miARN focalización es guiado por la especificidad de secuencia, más notablemente de los nucleótidos 2-6 de la miARN (denominada la región de la semilla), varios algoritmos se han desarrollado para predecir los genes miARN objetivos en todo el genoma de muchos organismos. Estos algoritmos son capacitados utilizando los observados motivos de apareamiento de bases de los genes miARN objetivos validados, y con frecuencia utilizan parámetros como la vinculación estricta de semillas, la conservación de sitios y / o estabilidad termodinámica 15. Si bien estos filtros refinan el gran número de supuestos objetivos con suficiente complementariedad con los objetivos de confianza solamente altas, pueden excluir especies sitios específicos y no canónicos miARN objetivo, que la evidencia reciente sugiere se han generalizado 16-24. Por otra parte, estas predicciones no tienen en cuenta los mecanismos de procesamiento de ARNm que excluyen a los sitios objetivo miARN, como alternativa polyadenylation25, 26 edición de ARN, el ARN metilación 27 y unión cooperativa. Como tal, las altas tasas de falsos negativos y falsos positivos han sido reportados para muchos algoritmos 22,24,28. Mientras que estos algoritmos son útiles para identificar candidatos miARN objetivos para la validación experimental posterior, estas altas tasas de error limitar la eficacia de los enfoques bioinformáticas para la detección sistemática miARN.
Para investigar sistemáticamente la interacción entre un miARN dado y 3'UTRs potencialmente dirigidas hemos desarrollado un ensayo de alto rendimiento llamado luminiscentes Identificación de elementos funcionales en 3'UTRs (3'LIFE) 24. Este ensayo mide las interacciones directas y la represión de traslación de la 3'UTR de prueba por una consulta miARN usando un sistema indicador de luciferasa dual. En este sistema, el 3'UTR de un gen de interés se clona aguas abajo de la luciferasa (Fluc) reportero marco de lectura luciérnaga. Los contras reporterotruct se cotransfecta con una consulta miRNA en células HEK293T. Mirna focalización se determina midiendo la variación relativa entre el Fluc prueba :: reportero 3'UTR y un segundo reportero no específica luciferasa Renilla. Es importante destacar que los ensayos de luciferasa detectan interacciones funcionales miARN / mRNA que influyen en la salida de traslación de la periodista. Esta es una ventaja clave sobre los métodos tradicionales para detectar la regulación de los genes miARN, tales como RT-qPCR y transferencias de Western, en que esta pasa por diferencias en la degradación del ARNm y la represión de traducción, así como los cambios en la abundancia de proteína independiente de la regulación basada 3'UTR.
Los ensayos de luciferasa son ampliamente utilizados para validar blancos directos miARN debido a su sencillez y sensibilidad relativa, sin embargo, su uso en pantallas de alto rendimiento está limitado por los altos costos asociados con reactivos consumibles, la falta de bibliotecas 3'UTR de fuentes públicas, y la ausencia de prot luciferasa normalizadaPROTOCOLOS, dando lugar a dificultades en la comparación de la represión funcional a través de múltiples conjuntos de datos. Para facilitar el uso del ensayo 3'LIFE, hemos puesto énfasis en la simplificación del diseño experimental, la utilización de la transfección 24 y luciferasa reactivos no comerciales 29, la creación de una biblioteca 3'UTR que se actualiza periódicamente y se expandió, y está disponible a través de un repositorio público plásmido 30.
La escalabilidad del ensayo 3'LIFE permite la detección de una gran biblioteca 3'UTR para la orientación por un miARN dado sin sesgar la pantalla hacia genes bioinformatically identificados. Además de probar las interacciones canónicas y previstos, este enfoque sistemático permite la identificación de nuevas dianas impulsadas a través de interacciones no canónicos y / o específicos de las especies. Es importante destacar que el efecto de los genes miARN la orientación en la producción de proteína se entiende generalmente para dar lugar a la represión de traducción modesto 15,31 </ Sup>, lo que sugiere que un papel primordial de la regulación miARN es para poner a punto la producción de proteínas, la protección contra los niveles aberrantes de expresión génica, y proporcionar robustez a la celda programas específicos 32,33. La sensibilidad del ensayo de luciferasa se combina con el inherentemente gran número de interacciones negativas miARN / mRNA en la pantalla 3'LIFE permite la detección de los efectos sutiles de miARN focalización en un gran número de genes, y la identificación de múltiples componentes de las redes de genes que están regulados por un determinado miARN 24.
Aquí se describe el protocolo 3'LIFE, y demostrar que es de viabilidad mediante el cribado de dos miRNAs bien caracterizados, miR-10b y let-7c contra un panel de 275 3'UTRs humanos (Figura 1).
1. Cultivo Celular (24-48 h antes de la transfección)
2. Preparación Antes de la transfección
_content "> NOTA: La preparación de los tampones y ADN plásmido en el paso 2,0-2,2 debe realizarse en los días antes de la transfección desde la preparación de estos reactivos puede llevar mucho tiempo.3. Preparar siguientes artículos Inmediatamente antes de la transfección
4. Preparación del plásmido de ADN y mezcla de células
NOTA: El siguiente protocolo asume la transfección de tres placas de 96 pocillos en un experimento para una pantalla con dos miRNAs (miRNA- # 1 y # 2 miRNA-). Cada placa se corresponderá con la misma placa de 96 pocillos de plásmidos pLIFE-3'UTR, y ser tratado tres veces con pLIFE-miRNA-blanco, pLIFE-miRNA- # 1, o pLIFE-miRNA- # 2.
5. La transfección
6. Preparación de lisado de la célula para ensayo de luciferasa
7. Dual Luciferase Assay
NOTA: Si hay varias placas se están midiendo de forma secuencial en un luminómetro, crear mezclas de reacción de amortiguamiento con todo excepto ATP y sustratos, la adición de estos reactivos seguido de ajuste del pH inmediatamente antes de su uso con cada plato. ATP y sustratos pueden degradarse con el tiempo; coherencia en la cantidad de tiempo que estos reactivos están en el buffer mejorará la coherencia en varios platos.
Análisis 8. Datos
El archivo de salida luminómetro contiene mediciones primas para ambas proteínas luciérnaga y Renilla luciferasa. Este formato RAW es compatible con el "3'LIFE - Análisis de placa única" y "3'LIFE - Análisis multidisco" hojas de cálculo disponible en la página web del laboratorio Mangone ( www.mangonelab.com ). El único análisis placa de hoja de cálculo calcula automáticamente luciérnaga / relación de Renilla, normaliza cada miARN al control negativo apropiado, y normaliza los valores de la represión a través de cada plato. Esta hoja de cálculo identifica automáticamente los pozos con baja señal de luciferasa de Renilla, destaca pozos que muestran la represión en comparación con el control negativo, y proporciona medidas de represión a través de toda la placa (Figura 2). Ver 24 para una explicación detallada de los análisis estadísticos.
Múltiples réplicas se pueden analizard utilizando la hoja de cálculo "análisis multidisco". Cada réplica se compara lado a lado, y las medidas estadísticas de los datos se calculan automáticamente (Figura 3). Además de comparar las réplicas con las columnas "Represión normalizado", el usuario puede comparar la represión entre los dos miRNAs en el marco del "miARN # 1 / # 2 miARN" columnas. Esta medida divide el índice de represión para cada miARN para cada réplica. Esta medida puede indicar valores erróneos desde el ensayo de luciferasa (por ejemplo lecturas anormalmente altas o bajas con el control negativo, véase la figura 3, fila A9, Rep # 3), y pozos donde el índice de represión puede no indicar la represión sustancial, pero que sí lo hacen exhibir diferencias significativas entre los miRNAs. Aunque esta medida no puede ser utilizado directamente para indicar un objetivo miRNA, es útil para la identificación de los valores atípicos, pozos problemáticos, o patrones en los datos que no se asignen exclusivamente para dirigir los genes miARN regulation.
La represión Index (RI) se usa para llamar a un objetivo putativo miARN, con valores más bajos correspondientes a una mayor represión relativa. El umbral para llamar supuestos objetivos se basa en el nivel de rigor requerido por el investigador, pero la combinación de la RI con 3'UTRs que muestran los valores de p estadísticamente significativas (p <0,05) indicará objetivos de alta confianza (ver Figura 2 Filas B8 y B12).
Figura 1: 3'LIFE de ensayo (A). Los vectores compatibles-Puerta de enlace utilizados en el ensayo 3'LIFE. Top: El gen de la luciferasa (Fluc) se fusiona a la 3'UTR de prueba, mientras que el gen de la luciferasa de Renilla (Rluc) se fusiona con el inespecífica SV40 pA 3'UTR como control. Conclusión: El miARN-intrón vector RFP- - La sonda pre-miARN, además de ~ 400nucleótidos dentro de su locus genómico (recapitular procesamiento de miRNA endógeno), se clona dentro de un intrón para permitir su co-expresión con DsRed2 fluorocromo. Ambos vectores son públicamente disponibles (Seiler et al., 2013). (B) Diagrama de flujo del ensayo 3'LIFE. (C) 3'LIFE Pipeline: El vector de doble luciferasa que contiene el 3'UTR de prueba con o sin los vectores de genes miARN son co-transfectaron en células HEK293 en placas de 96 pocillos. La interacción entre el miARN y un objetivo 3'UTR bona fide bajará la luminiscencia relativa en pozos específicos (ejemplificado por la mancha de color naranja en la placa experimental).
Figura 2: Ejemplo de los datos producidos con el ensayo 3'LIFE. Cada sonda miRNA se prueba en cuatro ejemplares (replica 1-4). Los colores representan los niveles de represión, con rojocolores que indican fuerte miARN / interacciones 3'UTR. Todas las réplicas se promedian para producir supuestos objetivos de alta calidad que se muestran en la placa de resumen debajo de la flecha amarilla. Caja blanca representan los controles, no transfecciones o pozos con baja eficiencia de transfección.
Figura 3:. Tabla que representa los datos de resumen de un subconjunto de las interacciones producidas utilizando la hoja de cálculo 3'LIFE Los valores de represión son como en la figura 2. El software calcula la desviación estándar, error estándar y el z-score para cada interacción. Estadísticamente interacciones significativas están marcados en rojo. Los últimos cuatro filas muestran la represión relativa de uno de los genes miARN a la otra, y se utiliza como indicador secundario para comparar la represión entre dos miRNAs diferentes. La hoja de cálculo se puede descargar desde www.mangonelab.com
Firefly reactivos tampón luciferasa | La concentración final (1x) |
Glicilglicina | 25 mM |
K x PO 4 (pH 7,8) | 15 mM |
MgSO 4 | 15 mM |
TDT (almacenar a 4º) | 1 mM |
EGTA | 4 mM |
ATP * | 2 mM |
Escarabajo luciferina * | 250 M |
Tabla 1: Stock reactivos de luciferasa de luciérnaga: 10x soluciones madre de Glicilglicina, K x PO 4, MgSO4, TDT y EGTA se pueden preparar por separado y se almacenan antes de amortiguar la reconstitución. 100x Escarabajo luciferina (sustrato de luciferasa de luciérnaga) puede ser tiendad disolviendo 50 mg luciferina en 7.134 ml H 2 0 (25 mM). Alícuota 105 l / plato de disuelto luciferina Escarabajo en tubos y almacenar a -80 ºC. Por el apoyo técnico Promega, esto debe ser estable durante> 6 meses, pero puede ser sensible a la luz. NOTA: EGTA no voy a entrar en solución a pH neutro. Se añade lentamente NaOH a EGTA hasta que se disuelva completamente. * Reactivos añadidos a tampón final inmediatamente antes de el ensayo de luciferasa
Renilla luciferasa reactivos tampón | La concentración final (1x) |
NaCl | 1,1 M |
Na 2 EDTA | 2,2 mM |
KH 2 PO 4 | 0,22 M |
NaN 3 | 1,3 mM |
BSA * | 0,44 mg / ml |
Coelenterazina * | 2.5 & #956; M |
Tabla 2: Stock Renilla luciferasa reactivos tampón Todos los reactivos excepto BSA y coelenterazina se pueden mezclar a una concentración de 1x y se almacenaron a temperatura ambiente. Coelenterazina se puede disolver en metanol acidificado y se dividió en alícuotas por placa. Acidificar metanol mediante la adición de HCl a una concentración final de 5 mM (<3 pH). Disolver 250 g coelenterazina en 2,36 ml de metanol acidificado (250 M) alícuotas de 105 ul / placa. La mezcla es estable durante al menos 6 meses, pero puede ser sensible a la luz. * Reactivos añadió al tampón inmediatamente antes del ensayo de luciferasa.
El ensayo 3'LIFE identifica los genes miARN objetivos funcionales en 3'UTRs en alto rendimiento. Este ensayo es útil para los investigadores que desean identificar experimentalmente un gran número de supuestos objetivos para su miARN de interés. El ensayo 3'LIFE es un enfoque poderoso para consultar para la regulación impulsado 3'UTR, en que el ensayo proporciona una medida funcional de los genes miARN focalización, y la prueba binario de un solo reportero :: 3'UTR contra un solo miARN puede abordar con confianza el estado de la orientación de los genes individuales. Para validar este enfoque, que exhibió un panel de 275 3'UTRs y en contra de dos miRNAs, vamos-7c y miR-10b, y se incluyeron 10 genes diana previamente validados en esta biblioteca. Ocho de estos diez genes mostraron represión 24. También se observó un significativo enriquecimiento de objetivos bioinformatically predichos no validados y 3'UTRs imprevistos que contienen elementos de semillas canónicas entre nuestros grandes éxitos, suggesting que 3'LIFE es capaz de identificar los genes miARN objetivos de buena fe.
Un indicador clave de la sensibilidad de las pantallas de alto rendimiento es la tasa de falsos negativos y falsos positivos. Mientras que la tasa de falsos positivos de este ensayo debe ser evaluado utilizando enfoques alternativos adicionales para validar hits, ocho de los diez controles positivos incluidos en nuestra pantalla de la represión exhibido prueba de principio, lo que sugiere una tasa de falsos negativos de 20%. Sin embargo, muchas de las técnicas se utilizan para identificar los genes miARN objetivos en diferentes contextos celulares, y el procesamiento 3'UTR y regulación por factores que actúan en trans es conocido por ser altamente tejido específico. Por ejemplo, la mayoría de 3'UTRs contiene múltiples sitios de poliadenilación, que controlan la longitud de la 3'UTR en el ARNm maduro. En muchos casos el uso de sitios de poliadenilación proximales es específica de tejido, y puede excluir sitios diana miARN. Además, la orientación miARN cooperativa, wi competenciaproteínas de unión de ARN-th y estructura secundaria de ARNm pueden todo el impacto de la capacidad de 3'LIFE para detectar los genes miARN objetivos en tejidos específicos. Debido a esto, la detección de blancos por el ensayo 3'LIFE puede variar en función del contexto celular en el que se realiza el ensayo, lo que complica la evaluación de las tasas de error absoluto. Este protocolo se ha optimizado para las células HEK293T, pero las líneas celulares alternativas se puede utilizar si el investigador desea realizar el ensayo en un contexto biológico específico. Sin embargo, la optimización de la eficiencia de transfección y la supervivencia celular con cada línea celular tendrá que ser optimizado utilizando múltiples condiciones de tampón, códigos de pulso, y el número de células. Un ejemplo de un esquema de optimización se puede encontrar en Wolter et. Al 24.
Este protocolo se ha optimizado en formato de 96 pocillos y se especifica el uso de cierta instrumentación de alto rendimiento. En el caso de que la institución no posee el equipo necesario para 96-bien Nucleofection, reactivos de transfección alternativa podría ser utilizado para realizar el ensayo 3'LIFE, siempre y cuando la eficacia de transfección sigue siendo alta. Además, el ensayo de luciferasa es el tiempo que consume aspecto más del ensayo 3'LIFE. Como tal, se recomienda el uso de múltiples luminómetros para pantallas de alto rendimiento.
This work is supported by funds from the College of Liberal Arts and Science and the Biodesign Institute at Arizona State University and NIH Exploratory/Developmental Research Grant 1R21CA179144-01A1.
We thank Stephen Blazie, Karen Anderson, Josh LaBaer for advice and discussion. Karen Anderson, John Chaput, and Josh LaBaer for sharing reagents and instrumentation, Michael Gaskin and Andrea Throop for technical advise and protocols. Justin Wolter is a Maher scholar and thanks the Maher family for their generous support.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents | |||
glycylglycine | Sigma | G1127-25G | |
Kx PO4 | Sigma | P2222 | |
EGTA | Sigma | E3889 | |
ATP | Sigma | FLAAS | |
DTT | Sigma | D0632 | |
MgSO4 | Sigma | M7506 | |
CoA | Sigma | C4282 | |
luciferin | Sigma | L9504 | |
NaCl | Sigma | S7653 | |
Na2EDTA | Sigma | E0399 | |
K H2 P O4 | Sigma | 1551139 | |
BSA | Sigma | A2153 | |
NaN3 | Sigma | S2002 | |
Coelenterazine | Sigma | C3230 | |
PBS/HEPES | Corning | 21-040-CV | |
DMEM | Sigma | D5546 | |
FBS | Sigma | F2442 | |
Pennicilin/Streptomicin | Sigma | P4333 | |
Trypsin | T2600000 | ||
Consumables | |||
MaxiPrep Kit | Promega | A2392 | |
96-well miniprep plate | Pall | 8032 | |
96-well shuttle plates | Lonza | V4SP-2096 | |
5x Lysis Buffer | Promega | E1941 | |
Instruments | |||
96-well GloMax Plate Reader | Promega | E9032 | |
Biomech FX Liquid Handler Robot | Beckmann | A31842 | |
4D-Nucleofector Core Unit | Lonza | AAF-1001 | |
96-well Shuttle System | Lonza | AAM-1001 | |
Cell Counter Countess | Invitrogen | C10227 |
Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este JoVE artículos
Solicitar permisoThis article has been published
Video Coming Soon
ACERCA DE JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados