3'LIFE의 분석을 사용하여 높은 처리량 miRNA의 표적의 탐지

Luminescent identification of functional elements in 3’ untranslated regions (3’UTRs) (3’LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3’UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

3'UTRs의 기능 요소의 발광 식별 (3'LIFE는) 쿼리 3'UTRs 수백의 배열 내의 특정의 miRNAs의 목표의 신속한 식별 할 수 있습니다. 대상은 식별 된 miRNA 타겟팅의 판독 기능을 제공 병진 출력을 측정함으로써 mRNA의 수준에서 결합 검출 듀얼 루시퍼 라제 분석에 기초한다. 3'LIFE은 게놈 와이드 화면을 비 독점 버퍼 및 시약, 그리고 공개적으로 사용할 수 기자 라이브러리를 사용 가능하고 비용 효율적인. 3'LIFE 표준 실험실 환경에서 수행 중 또는 액체 처리 로봇 및 기타 높은 처리량 장비를 사용하여 확장 할 수 있습니다. 우리는 인간의 96 웰 플레이트에 복제 3'UTRs, 2 개의 시험의 miRNAs의 데이터 집합을 사용하는 방법을 설명, 렛 7C 미르-10B. 우리는 96 웰 형식 DNA 준비, 형질 전환, 세포 배양 및 루시퍼 라제 분석을 수행하고, 데이터를 툴을 제공하는 방법을 보여분석. 결론적으로 3'LIFE 매우 재현 신속하고 체계적이며, 높은 신뢰성 목표를 식별합니다.

이 방법의 전체 목표는 정확히 감지하고 높은 처리량에서 마이크로 RNA (miRNA의) 대상을 매핑하는 것이다. 의 miRNAs는 ~ 길이 22 뉴클레오티드 내인성 비 코딩 RNA를합니다. 전사 처리에 따라, 성숙의 miRNAs는 단백질 복합체에 포함되는 복잡한 (RISC)를 침묵 유도 된 RNA를했다. 각각의 miRNA는 번역 억압 또는 mRNA의 절단 ¹ 중 하나의 결과로, 주로 메신저 RNA를의 '비 번역 영역 (3'UTRs) (의 mRNA를)에있는 요소를 대상으로 RISC를 안내합니다. U는 염기쌍을 동요하고있다 퇴화를 자연에서 여러 일치하지 않는 염기 쌍을 포함하는 지역을 불룩 : miRNA의 표준 왓슨 - 크릭 및 G에 기초하여 대상 사이트를 인식하고 있습니다. 대부분의 miRNAs는 크게 그들이 생물학적 역할의 다양한 범위를 재생할 인간 ^2,3에 식물에서 보존된다. 후생 동물에서의 miRNA는 세포의 운명 결정 ^4, 발달시기 ⁽⁵⁾ 등 다양한 생물학적 과정에 영향을 미칠 수있다 자주 조직 특이 적 발현 양상 ^6,7을 나타낸다. 의 miRNA misexpression 또한 표적 유전자의 기능만을 기준 셀의 동작에 상당한 영향을 미칠 수있는 비정상적인 유전자 조절, 발생할 수있다. 이와 같이, 신경 퇴행의 miRNAs는 ^8,9, 당뇨병, 암 ^{(10) (11)을} 포함하여 다양한 질환에 연결되어있다. 생물 정보학 및 습식 벤치 방법은 각각의 miRNA는 높은 처리량 또는 게놈 넓은 접근 방식이 잠재적 인 상호 작용이 큰 풀을 조사하는 데 필요한 것을 나타내는 별개의 mRNA ^12-14 수천 수백을 대상으로 할 수 있음을 시사한다.

표적 유전자를 확인하는 것은 기계적으로 정의 miRNA의 기능의 중요한 요소이며, 그렇게 연구자 대규모 타겟을 계시 할 수 있어야한다. 몇몇 접근법은 생물 정보학적인 예측 알고리즘을 포함하여 miRNA의 타겟을 식별하기 위해 개발 된, 높은 처리량 시퀀싱의 mRNA를 표적으로하고, 기자가 분석을 기반으로. 이러한 접근 방식은 각각 고유의 강점과 약점을 가지고있다. miRNA의 타겟팅이 순서 특이성에 의해 인도되는 것을 감안할 때, 특히 뉴클레오티드의 miRNA의 2-6의 여러 알고리즘은 많은 생물의 게놈을 통해 miRNA의 목표를 예측하기 위해 개발되었다 (시드 지역을 지칭). 이 알고리즘은 검증의 miRNA 대상의 관찰베이스 페어링 모티브를 사용하여 훈련, 자주 등의 엄격한 씨 페어링, 현장 보존 및 / 또는 열역학적 안정성 ¹⁵ 매개 변수를 사용하고 있습니다. 이러한 필터는 단지 높은 신뢰 대상에 충분한 상보성을 가진 추정 대상의 다수를 구체화 반면, 최근 증거는 ^16-24 만연 시사 종 특이적이고 비정규의 miRNA 표적 부위를 제외 할 수있다. 더욱이,이 예측은 이러한 대안 폴리아 데 닐화와 같은 miRNA의 표적 부위를 제외 mRNA의 계정 처리 메커니즘을 고려하지 않는다25, RNA 편집 ^(26), RNA 메틸화 ^(27), 협력 바인딩. 따라서, 높은 위양성과 위음성 율은 많은 알고리즘 ^{22,24,28보고되고있다.} 이러한 알고리즘은 후속 실험 검증을 위해 후보 miRNA의 타겟을 식별하는 데 유용하지만, 이러한 높은 에러율 체계적인 miRNA의 타겟 검출을위한 생물 정보학적인 방법의 유효성을 제한한다.

체계적으로 특정 miRNA의 사이의 상호 작용 및 잠재적 대상 3'UTRs에 대해 조사하기 위해 우리는 3'UTRs (3'LIFE) ²⁴ 기능 요소의 발광 식별라는 높은 처리량 분석을 개발했습니다. 상기 분석 수단의 상호 작용과 직접 이중 루시페라아제 리포터 시스템을 이용하여 miRNA의 쿼리 테스트 3'UTR의 병진 억압. 이 시스템에서, 관심의 유전자의 3'UTR은 개똥 벌레 루시퍼 라제 (fluc) 리포터 판독 프레임의 하류에 클로닝된다. 기자의 단점truct는 HEK293T 세포에서 쿼리의 miRNA에 동시 형질 감염된된다. miRNA의 타겟팅 테스트 fluc :: 3'UTR 기자와 제 비특이적 레 닐라 루시퍼 라제 리포터의 상대적인 변화를 측정함으로써 결정된다. 중요한 것은, 루시 페라 제 분석은 기자의 병진 출력에 영향을 미치는 기능의 miRNA / mRNA의 상호 작용을 검출한다. 이는이 3'UTR 기반 규제의 독립적 인 단백질 풍부 mRNA의 분해와 번역 억압의 차이뿐만 아니라, 변화를 무시, 이러한 RT-qPCR에 서양 말과 같은 miRNA의 규제를 감지하는 기존의 방법에 비해 큰 장점이다.

루시페라아제 분석법 널리 소모성 시약과 관련된 높은 비용에 의해 제한되기 때문에 상대적 단순성과 감도이면서 높은 처리량 스크린에서 그 사용 직접적인 miRNA의 대상을 확인하는 데에 이용되는, 공개 출처 3'UTR 라이브러리의 부족, 부재 표준화 된 루시 페라 제 제자의ocols, 여러 데이터 세트에 걸쳐 기능 억압 비교에 어려움을 선도. 3'LIFE 분석의 사용을 용이하게하기 위해, 우리는 정기적으로 업데이트 팽창 3'UTR 라이브러리를 만들어 실험 설계 비상업적 형질 ²⁴ 루시퍼 라제 시약 ^(29)의 이용의 간소화에 중점을 넣고,를 통해 사용할 수있다 공개 플라스미드 저장소 ^(30).

3'LIFE 분석의 확장 성 bioinformatically 확인 된 유전자으로 화면을 바이어스없이 특정 miRNA의 타겟팅에 대한 큰 3'UTR 라이브러리의 검사를 할 수 있습니다. 정규 예측과 상호 작용을 시험 이외에, 체계적인 접근법 비정규 및 / 또는 종 특이 적 상호 작용을 통해 구동되는 신규 대상의 식별을 허용한다. 중요한 단백질 생산에 타겟팅 된 miRNA의 효과는 일반적으로 적당한 병진 억압 ^{15,31 <발생하는} 것으로 이해된다/ SUP>, miRNA의 규제의 주요 역할, 단백질 출력 미세 조정 유전자 발현의 비정상적인 수준을 방지하고, 특정 프로그램 ^{(32, 33)를} 셀에 견고 함을 제공하는 것을 제안. 3'LIFE 화면에 음의 miRNA / mRNA의 상호 작용의 본질적으로 다수의 결합 루시페라아제 분석의 민감도의 miRNA 유전자의 다수의 타겟팅의 미묘한 효과를 검출하고, 유전자 네트워크의 여러 구성 요소들의 식별을 허용하는 특정 miRNA의 ^(24)에 의해 조절된다.

여기에서 우리는 3'LIFE 프로토콜을 설명하고 275 인간 3'UTRs (그림 1)의 패널에 대해이 잘 특성화의 miRNAs 미르-10B 및하자-7C를 선별하여이 가능성의 보여줍니다.

1. 세포 배양 (24 ~ 48 시간 형질 전환 이전)

1. 종래 형질 전환 종자에 24-48 시간은 96 웰 플레이트의 수에 기초 HEK293T 세포, 충분한 양의 형질 감염된다.
   참고 : 일관성있는 형질의 경우, 충분한 밀도 판 세포는 빠르게 분열을 선호하는, 아직 형질의 번에 두 개 이상의 70-90%의 포화 상태에있을 수 없습니다.
2. 각 96 웰 플레이트 (저장 및 멀티 채널 피펫의 사용을 설명하기 위해 잘 당 75,000 세포 및 플레이트 당 120 우물) 9 × 10 ⁶ 세포를 필요로한다. HEK293 세포 (일반적으로 ~ 20 시간)의 배가 시간을 계산하고, 세포의 적절한 수는 트랜시 적어도 9 × ¹⁰⁶ 세포를 수득 시드. 새로운 플레이트를 다시 시드 나머지 세포 ~ 10 %, ~ 90 % 컨 플루 언시로 성장 145mm 원형 배양 플레이트는 통상적으로 3 96- 웰 형질에 충분하다.

형질 2. 준비 이전

1. 3'LIFE 분석과 호환되는 인간의 3'UTR 클론 공개 플라스미드 저장소 ^(30)를 통해 사용할 수 있습니다. 수동 또는 액체 핸들링 로봇 DNA 플라스미드를 정제. 형질 등급 알칼리 용해 미니 준비 96 웰 키트를 사용하고 제조업체의 지침을 따릅니다. 잘에 ~ 100 NG / μL 당 정제 된 벡터를 재현 탁.
   참고 : 플라스미드 농도가 아래 40 NG / μL를 떨어지면 부족 루시 페라 제 신호가 발생합니다.
2. pLIFE-miRNA의 그림 1B ^(24)의 파이프 라인을 사용하여 ³⁰ 또는 복제를 벡터 얻습니다. 각각의 miRNA와 빈 제어 플라스미드 500 NG / μL의 농도로 재현 탁 벡터.
3. nucleofection 버퍼 조건의 민감성으로 인해, 다음을 확인(세포 플라스미드를 포함) 형질 물질의 총 부피는 96 웰 형질 플레이트의 각 웰에 전체 액체의 10 %를 초과하지 않는다. 이를 달성하기 위해, 적어도 500 NG / μL의 농도로 pLIFE-miRNA의 플라스미드 스톡을 농축시킨다.
4. 배 반딧불이 루시퍼 라제 시약 완충액 (표 1), 및 최대 6 개월 동안 저장 될 수 1X 레 닐라 루시퍼 라제 시약 완충액 (표 2)를 준비한다.
   참고 : 반딧불 루시 페라 제 버퍼에 DTT는 단일 사용 씩 -20 ^℃로 솔루션에 저장 될해야합니다.

3. 형질 직전에 다음 항목을 준비합니다

1. PBS를 포함하는 형질 전환 버퍼, 1.5 % HEPES, pH가 7.0을 준비합니다. 이 형질 전환 효율이 눈에 띄게 감소없이 4 ° C에서 최대 1 달 동안 저장 될 수 있지만,이 신선한 준비합니다. 버퍼와 플라스미드 DNA 볼륨을 공식화에서, SU 각 96 웰 플레이트 (120) 반응을 가정fficiently 피펫 및 액체 저수지 및 멀티 채널 피펫을 사용하여 손실 된 볼륨의 오류를 차지한다. 나누어지는 잘 형질 버퍼 당 18 μL (/ 96 웰 플레이트 (120) 우물 = 플레이트 당 2.16 ㎖), 따로 설정합니다.
   주 : 세포 - 전기 장치가 세포를 형질하는 데 사용되는 버퍼 조건에 매우 민감하다. 준비 버퍼가 장비의 일관된 성능을 보장 정확도. 구체적으로는 그 버퍼가 마이크로 원심 튜브, 96 웰 플레이트, 저수지와 전극 판에 폭로 방치 시간을 최소화함으로써, 버퍼의 증발을 방지하기 위해 분석을 수행 할 때 여분의주의를 기울여야한다.
2. 예약 다음과 같은 컨트롤을위한 네 개의 우물, 아니 pLIFE-3'UTR (루시 페라 제 분석의 배경을 측정하기), pLIFE-SV40 3'UTR (음의 목표 제어), miRNA의 # 1에 대한 긍정적 인 제어, miRNA의 번호에 대한 양성 대조군 2.
   참고 :이 벡터는 ³⁰ 공개적으로 사용할 수 있습니다. 또한, 이전에 검증 대상양성 대조군으로 사용할 수있다.
3. 따뜻한 미디어, 37 ° C의 트립신 (0.25 %).
4. DMEM은 10 % FBS, 1 % 펜 / 스트렙토 보충 된 96 웰 세포 배양 플레이트의 각 웰에 200 μL를 추가 한 다음 형질 사용할 37 ° C의 배양기에 두었다.
5. 지원 소프트웨어 다음 모든 세포의 전기 장치의 전원을 켭니다. HEK293T 세포와 PBS / HEPES 완충 용 펄스 코드 FF120를 사용합니다.

플라스미드 DNA와 세포 혼합물 4. ​​준비

참고 : 다음 프로토콜은 두 가지의 miRNAs (miRNA- # 1 miRNA- # 2)가 화면에 대해 하나의 실험에서 세 96 웰 플레이트를 형질 가정합니다. 각 플레이트는 pLIFE-3'UTR 플라스미드 동일한 96- 웰 플레이트에 대응되며, pLIFE-miRNA의 공백 pLIFE-miRNA- # 1 또는 pLIFE-miRNA- # 2로 3 회 처리한다.

1. 각각의 miRNA에 대한 pLIFE-miRNA의 + 형질 버퍼의 3 주식을 준비합니다. 이 주식은 각각의 전체 부피의 50 % (10 μL)를 차지한다물론, 120 우물을 곱한. 따라서, 각각의 주가는 1.08 ml의 버퍼 + 120 μL 플라스미드 DNA (pLIFE-miRNA의)를 포함해야합니다.
2. 미디어를 용출 PBS로 부드럽게 세척하고, 37 ℃에서 5 분 ~ 5 ml의 0.25 % 트립신으로 처리하여 145mm 배양 접시에서 세포를 제거합니다. 5 분 동안 300 XG에 동일한 미디어 부피, 펠렛 세포를 트립신 중화.
3. 5 ~ 10 ml의 미디어 (셀 밀도와 세포 카운터의 정확한 범위에 따라) ~에 트립신 / 미디어, 그리고에 resuspend 펠렛을 제거합니다.
4. 세포 계수기를 사용하여 세포를 카운트. 95 % 가능한 기계의 정확한 범위 내에서> 세포가 있는지 확인합니다.
   참고 : 부정확 한 세포 수는 매우 높은 세포 농도 (> 6.0 배 (10) ⁶ / ㎖)에서 발생할 수 있습니다. 세포의 비율 및 / 또는 형질 전환 효율을 감소 : 형질 너무 많은 세포 플라스미드를 대폭 줄임으로써 타겟팅 된 miRNA의 효율을 감소시킬 수있다.
5. 세 나누어 각 튜브 함유 9 × ¹⁰⁶ 세포, 세포 r에 대응한 96 웰 플레이트의 형질 전환을위한 equired. 3 분 동안 300 XG에 세포를 스핀.
6. 용지를 제거합니다. 초과 용지는 형질 전환 효율에 영향을 미칠 수있는 펠릿의 최소한의 방해와 가능한 한 많은 매체를 제거해야합니다.
7. 1.2 ml의 형질 전환 버퍼 / miRNA의 플라스미드 혼합물, 따로 설정에 재현 탁 세포.
8. 다음은 형질 버퍼에 pLIFE-3'UTR 플라스미드의 세부 부유 단계를 반복합니다. 이 96 웰 플레이트에서 발생하는 것처럼, 항상 판을 덮어 버퍼의 증발을 방지하기 위해주의를 기울입니다.
   1. 멀티 채널 피펫을 사용하여 96 웰 PCR 플레이트의 각 웰에 형질 버퍼 μL 32.4 이동 ([형질 전환 당] 9 μl를 * 3 판] * 1.2 [피펫 오류를 설명합니다).
   2. 각 웰에 3.6 μL 미니 수험 공부를 pLIFE-3'UTR 플라스미드 (~ 100 NG / μL)를 추가하고 철저하게 섞는다.
   3. 피펫 96- 웰 플레이트와 형질 커버의 각 웰에이 혼합물을 10 μL.

5. 형질

1. 저수지에 첫 번째 셀 / 버퍼 / pLIFE-miRNA의 플라스미드 혼합물의 1.2 mL로 이동합니다. 잘 섞는다.
2. 이미 10 μL 형질 버퍼 / pLIFE-3'UTR을 포함하는 제 96 웰 접시에 트랜 스펙 션 혼합물의 10 μL를 추가한다. 최대 피펫 팅에 의해 여러 번 아래로 잘 섞는다.
   참고 : 버퍼에있는 세포의 평등 서스펜션도 확인하고 큐벳을 통해 전류의 철저한 통로 형질 전환 효율을 극대화합니다.
3. 셀 전기 천공 장치에서 96- 웰 플레이트 형질 놓고 형질을 개시.
4. 형질 전환이 완료되면, 96 웰 형질 플레이트의 각 웰에 96 웰 배양 플레이트에서 예열 매체의 100 μl를 넣고 잘 섞는다. 96 웰 배양 플레이트에 각 우물에서 100 μl를 이동합니다.
5. 세포는 w의 양측에 응집하는 경향이있는 바와 같이, 웰의 중앙에 수직으로 위치 된 피펫 배양 접시에 세포를 섞는다엘 적절하게 혼합되지 않는.
6. 나머지 두 판에 대한 5.1-5.5를 반복합니다.
7. 청소 96- 웰 플레이트 형질
   1. 96- 웰 플레이트를 형질 전환 실험 간의 핵산 위에 캐리 없도록 70 % EtOH로 세척하여 재활용 할 수있다. 완전히 전극 부재에 과량의 EtOH를 닦고 (하부 측)와 배양 후드에서 완전히 건조시킨 형질 전환 플레이트를 허용함으로써 각 웰을 채우기 위해 분 무병을 사용하여 두 개의 70 % EtOH로 세척을 수행한다.
      참고 : 우리가 더 플라스미드 DNA와 70 % EtOH로 하나의 세척, 및 제 형질 다음, HEK293T 세포로 각각의 플라스미드 pmaxGFP 2 μg의와 12 우물을 형질로 이월 DNA 오염에 대한 테스트했습니다. 이 극히 높은 플라스미드 농도, 매우 밝은 리포터 및 단일 워시, 복제 형질 12 중 어느 하나의 관측 형광이 없었다.
8. 이중 lucif 다음 37 ℃에서 48 ~ 72 시간 동안 배양 세포,분석을 지 웁니다.

6. 세포 루시 페라 제 분석을위한 해물 준비

1. 4 부 물, 저수지 패시브 용해 완충액 1 배 부분 용해 완충액을 희석. 26 μL가 / 잘 ~ 20 여분의 볼륨을 추가하는 저수지의 손실을 고려하여 계산한다.
   주 : -20 ºC 버퍼에 저장되며, 피펫의 정확도를 향상시킬 실온 접근하는 배 버퍼를 허용하는 종래 따라서, 매우 점성 일 수있다.
2. 형광 현미경을 사용하여 트랜 스펙 션 효율을 각 웰을 분석한다. 효율적으로 형질하지 않은 우물에 불일치 (> 90 %의 형질 전환 효율을) 참고 또는 혼잡 또는 미디어 고갈을 나타내는 RFP의 낮은 수준을 표현하고 있습니다. 분석에서이 우물을 제거합니다.
3. 완전 세포 분리의 원인이되는 너무 빨리 용출 않도록 조심하면서 세포에서 용지를 제거합니다.
   참고 : 남은 용지가 experime에서 값에 해물과 원인 변동을 희석한다국세청.
4. 20 ~ 30 분 ~에 대한 낮은 / 중간 속도로 판 쉐이커 / 로커에 각 웰, 장소에 용해 버퍼의 26 μl를 추가합니다. , 루시 페라 제 버퍼를 준비 루미 (들)을 씻어 총리, 불투명 측정 판에 해물을 전송하려면이 시간을 사용합니다.

7. 듀얼 루시 페라 제 분석

참고 : 여러 개의 판이 한 루미에 순차적으로 측정되는 경우, 즉시 각 판을 사용하기 전에 pH를 조절 한 다음이 시약을 추가, ATP와 기판을 제외한 모든 것을 버퍼 마스터 믹스를 만들 수 있습니다. ATP 및 기질은 시간이 지남에 따라 저하 될 수있다; 이들 시약은 상기 버퍼에있는 시간의 양에 일관성이 여러 플레이트의 일관성을 개선한다.

1. 루시퍼 1X 버퍼 준비 (표 1) :
   1. 기판 민감한 빛을 수있는 바와 같이, 알루미늄 호일로 개똥 벌레와 레 닐라 버퍼를 포함하는 두 개의 튜브 (일반적으로 50분의 15 ml의 원심 분리기 튜브)를 감싸.
   2. 1X 반딧불 루시 페라 제 버퍼를 준비합니다. 최종 1 배 농도로 5 ML의 H ₂ 0, EGTA 마지막으로 추가, 각각의 다섯 배 반딧불 루시 페라 제 시약의 1 ML을 추가합니다.
      1. 반딧불 버퍼 1X 10 ml의 0.025 g의 ATP를 추가합니다. 수회 반전 섞는다. 항상 얼음에 ATP를 유지합니다. ATP이 저하되므로, 하나 이상의 플레이트를 순차적으로 측정하는 경우, 버퍼는 각 추가 플레이트에 대해이 단계에서 새로운 시작을해야합니다.
      2. 버퍼의 pH를 기반으로 노란 색으로 변경해야합니다 (100) 딱정벌레 루시페린 (기판) (표 1)의 100 μl를 추가합니다.
   3. 1X 레 닐라 루시퍼 버퍼 재구성 : 96 웰 플레이트, 나누어지는 1 10 ㎖ 당 "레 닐라는 버퍼".
      1. BSA 100 ㎕ (44 ㎎ / ㎖ 주식을)를 추가합니다.
      2. 하나 이상의 판, 10 mL의 분액에 별도의 마스터 믹스를 선별합니다.
      3. 버퍼링 코 엘렌 테라의 100 μl를 추가합니다 (이전에 분주하고 100 배의 진한에 저장됩니다.)
   <리> 수산화 나트륨과 염산을 사용하여 5.0 1X 레 닐라 버퍼 다음, 반딧불 8.0 버퍼 1X의 산도를 조정합니다.
   주 : 각 버퍼의 활동 및 반딧불 루시퍼 라제 활성을 종결 레 닐라 버퍼의 능력은 산도에 크게 의존한다. 일관성있는 결과에 대해이 단계에서 매우 정확.
   4. 루미 프라이밍를 수용 10.5 mL를 (1 96- 웰 플레이트에 대응) 각각의 버퍼의 양을 준비한다.
2. 불투명 한 흰색 번호판에 해물을 전송 :이 시점에서 세포가 20 분 ~에 대한 용해 버퍼에 있​​어야합니다. 각이 잘 멀티 채널 피펫을 사용하여 25 μl를 타고, 세포의 덩어리를 분쇄하고 해물을 균질화 아래 철저까지 피펫해야 할.
3. 루미를 준비합니다. 루미의 전원을 켜고 "이 주사와 DLR"라는 DLR 폴더에있는 프로토콜을 선택합니다. 다른 포맷은 데이터 분석 파이프 라인 (아래)와 호환되지 않습니다.
   1. T로 우물을 선택ested (모든 우물이 기본값입니다).
   2. (설명을 ^{29 참조)} 10 초 측정 시간 5 초 설정을 '측정하기 전에 지연'을 확장합니다.
   3. 모세관 세척 단계 : 물 3 배, EtOH로 배, 물 배, 마른 배. 백 버퍼 튜브에 한 번 폐기물로 국무 버퍼, 다음 주요 두 번째 혼합 보장합니다. 오른쪽 모세관에 레 닐라 다음 왼쪽 모세관에 처음과 주요 반딧불 버퍼를 주입한다.
4. 루시퍼 라제 분석을 시작합니다. 각각의 판을 읽을 ~ 48 분 소요됩니다. 완료 후 먼저 파일을 저장 한 다음 세척 단계를 반복하고 루미을 차단.
   참고 : 루미 프로그램이 충돌 할 경우 여러 판 읽고 동일한에 저장된 데이터는 파일을 능가 할 수는 문제가 여러 개의 판으로 발생할 수 있습니다 그러나 읽습니다. 측정 사이의 모든 데이터를 저장하고 저장이 가능하기 전에 프로그램이 충돌하는 경우 스크린 샷을해야합니다.
   1. 이전 버퍼를 교체새와 새 판을 시작하기 전에 최소한 두 번 새로운 버퍼와 주요해야되고.

8. 데이터 분석

1. 에서 사용할 수 - 그리고 "다판 분석 3'LIFE"- 엑셀 테이블 "하나의 플레이트 분석 3'LIFE"활용 www.mangonelab.com을 . 스프레드 시트 - "하나의 플레이트 분석 3'LIFE"에 부정적인 조건, miRNA의 # 1, 및 miRNA의 # 2에 해당하는 위치에 루미 출력 파일에서 반딧불과 레 닐라 루시퍼 라제 측정을위한 원시 데이터를 복사합니다.
2. 스프레드 시트가 자동으로 반딧불 / 레 닐라 비율을 계산하고 적절한 음성 대조군에 각각의 miRNA의 정상화, 각각의 접시에 걸쳐 억압 값을 정상화됩니다.
   참고 :이 스프레드 시트가 자동으로 크게 억압 우물을​​ 강조, 낮은 루시 페라 제 신호에 우물을 식별하고 repressi의 조치를 제공 할 것입니다전체 판에서에. 통계 분석의 자세한 설명은 ^(24)을 참조하십시오.
   1. 각 시험의 miRNA에 대한 # 1을 복제에 대응하는 위치에 - "다판 분석 3'LIFE"스프레드 시트에 해당하는 세포로, "정상화 RI 색인"상자에서 값을 복사합니다. 다른 일에 수행 한 모든 생물 복제에 대해 반복합니다.
3. 원하는 경우, 각각 열 B와 D의 유전자 이름과 대상 예측 상태를 삽입합니다.
   1. 스프레드 시트가 자동으로 모든 판의 평균을 계산하도록 허용합니다. 열지도로 96 웰 형식 (그림 2)의 데이터를 관찰한다. 파일은 또한리스트 형식의 데이터 (도 2)를 배치한다.
      주 : 억압 지수 추정 miRNA의 타겟을 식별하는 데 사용되는 계수이다. 다른 파라미터는 엄격 개인 선호도에 기초하여, 사용할 수있다. 평균적으로 우리는 0의 억압 지수 아래의 가능성이 안타를 고려한다.8 T 테스트 (P - 값 <0.05)로 통계적으로 유의. 그림에 나타낸 바와 같이 이러한 기준에 따라 3 잠재적 인 목표는 빨간색으로 강조 표시됩니다.

루미 출력 파일은 모두 개똥 벌레와 레 닐라 루시퍼 라제 단백질 원료 측정이 포함되어 있습니다. 와 - Mangone 랩 웹 사이트 (에서 사용 가능한 "3'LIFE 다판 분석"스프레드 시트 -이 원시 형식은 "단판 분석 3'LIFE"와 호환 www.mangonelab.com ). 단판 분석 스프레드 자동 반딧불이 / 레 닐라 비율을 계산 적절한 음성 대조군 miRNA를 각각 정규화하고, 각각의 플레이트에 걸쳐 억압 값을 정규화한다. 스프레드 시트를 자동 낮은 레 닐라 루시퍼 신호 웰을 식별 음성 대조군에 비해 억제를 나타내는 웰을 강조하고, 전체 판에 걸쳐 억압 수단 (도 2)을 제공한다. 통계 분석의 자세한 설명은 ^(24)을 참조하십시오.

여러 복제 분석 할 수있다D "다판 분석"스프레드 시트를 사용. 각 복제에 나란히 비교되어, 데이터의 통계적 측정이 자동으로 (도 3)을 산출한다. "정규화 억압"열과 복제를 비교하는 것 외에도, 사용자는 "miRNA의 # 1 / # 2의 miRNA"열 아래 두개의 miRNAs 사이 억압을 비교할 수있다. 이 법안은 각 복제에 대 한 각각의 miRNA에 대한 억압 인덱스를 분할한다. 이 법안은 루시퍼 라제 분석에서 잘못된 값을 표시 할 수 있습니다 (A9를 행, 그림 3 참조, 음성 대조군과 비정상적으로 높거나 낮은 수치 예를 들어, 의원은 # 3), 그리고 억압 지수가 상당한 억압을 표시하지 않을 수 있습니다 우물,하지만 할 miRNAs의 사이에 상당한 차이를 나타낸다. 이 법안은 miRNA의 대상을 나타 내기 위해 직접 사용되지 않을 수 있지만, 그것은 전적으로 miRNA의 재를 직접 귀속되지 않은 데이터에 아웃 라이어, 문제 우물, 또는 패턴을 식별하는 데 유용합니다gulation.

억압 지수 (RI)는 낮은 값이 상대적으로 높은 억압에 대응, 추정 miRNA의 대상을 호출하는 데 사용됩니다. 추정의 타겟을 호출하기위한 임계 값은 연구원에 의해 요구되는 엄격한 레벨에 근거하지만 통계적으로 유의, P 값 (p <0.05)를 표시 3'UTRs와 RI를 결합하는 높은 신뢰도 타겟 (도 2 행 B8 참조 표시되며 B12).

그림 1 : 3'LIFE 분석 (A). 3'LIFE 분석에 사용되는 게이트웨이 호환 벡터. 위쪽 : 레 닐라 루시퍼 라제 유전자 (RLuc)을 대조군으로 불특정 SV40 pA를 3'UTR 융합하면서 루시퍼 라제 유전자 (FLuc)는, 테스트 3'UTR에 융합된다. 아래 : RFP-의 miRNA-인트론 벡터 --miRNA의 사전 조사, 플러스 ~ 400그 게놈 궤적 내 뉴클레오티드 (내생​​ miRNA의 처리를 요점을 되풀이하는), DSRed2의 형광 색소와의 공동 발현을 허용하는 인트론 내에서 복제됩니다. 두 벡터는 공개적으로 사용할 수있는 (세일러 등. 2013). (B) 3'LIFE 분석의 흐름도. (C) 3'LIFE 파이프 라인 : 또는 miRNA의 벡터없이 테스트 3'UTR을 포함하는 듀얼 - 루시퍼 라제 벡터는 동시 형질을 96- 웰 플레이트에 HEK293 세포에있다. miRNA의와 선의의 3'UTR 대상 사이의 상호 작용 (실험 판에 오렌지 자리 예시) 특정 우물에서 상대 발광을 낮출 것이다.

그림 2 : 3'LIFE 분석과 생산 데이터의 샘플. miRNA의가 4 번씩 시험 각 프로브 (1-4 복제). 색상은 빨간색, 억압 수준을 나타냅니다강한 miRNA의 / 3'UTR 상호 작용을 나타내는 색상. 모든 복제는 노란 화살표 아래 요약 판에 도시 고품질 추정 대상을 생성하기 위해 평균화된다. 흰색 상자, 컨트롤을 나타내는 낮은 형질 전환 효율과 형질 또는 우물을 실패했습니다.

그림 3 :. 3'LIFE 스프레드 시트를 사용하여 생산의 상호 작용의 부분 집합의 요약 데이터를 나타내는 표 억압 값은 그림 2. 소프트웨어 같다 각 상호 작용에 대한 표준 편차, 표준 오류 및 z 점수를 계산한다. 통계적으로 유의 한 상호 작용은 빨간색으로 표시됩니다. 마지막 4 개의 행은 다른 하나의 miRNA의 상대적인 억제를 보여 주며, 두 가지 사이의 miRNAs 억압을 비교하는 보조 지표로 사용된다. 스프레드 시트에서 다운로드 할 수 있습니다 www.mangonelab.com

표 1 : 주식 반딧불 루시 페라 제 시약 : 글 리실 글리신의 10 배 재고 솔루션, K는 PO _{4, 황산 X,} DTT 및 EGTA 별도로 준비하고 재구성 버퍼 이전에 저장 될 수있다. 100 배 비틀 루시페린 (반딧불 루시 페라 제 기판) 저장 될 수 있습니다7.134 ML의 H ₂ 0 (25 mM)을 50 mg을 루시페린을 용해하여 D. -80 ºC에서 용해 비틀 튜브에 루시페린과 저장소의 나누어지는 105 μL / 판. 프로 메가 기술 지원 당이> 6 개월 안정해야하지만, 민감한 빛이 될 수있다. 참고 : EGTA는 중성 pH에서 솔루션으로 가지 않을 것이다. 완전히 용해 될 때까지 천천히 EGTA에 수산화 나트륨을 추가 할 수 있습니다. * 최종 버퍼에 추가 시약을 직전 루시 페라 제 분석에

표 2 : BSA 및 코 엘렌 테라 제외한 스톡 레 닐라 루시퍼 라제 완충액 시약 모든 시약은 1 배 농도로 혼합하고, 실온에서 저장 될 수있다. 코 엘렌 테라 산성화 메탄올에 용해시키고, 플레이트 당 분취 할 수있다. 5 mM의 (<3 산도)의 최종 농도 염산을 추가하여 메탄올을 산성화. 2.36 ㎖의 산성화 메탄올 (250 μM) 나누어지는 105 UL / 플레이트에 250 μg의의 코 엘렌 테라를 녹인다. 혼합은 6 개월 이상 안정하지만 민감한 빛 할 수있다. * 시약은 루시 페라 제 분석 직전에 버퍼에 추가.

3'LIFE 분석은 높은 처리량에 3'UTRs에 기능 miRNA의 목표를 식별합니다. 이 분석은 실험적으로 관심에 대한 자신의 miRNA 추정 대상의 다수를 식별 할 목적으로 연구에 유용하다. 3'LIFE 분석은 분석이 miRNA의 타겟팅의 기능 측정, 자신있게 해결할 수있는 하나의 miRNA에 대한 3'UTR :: 단일 기자의 이진 테스트를 제공한다는 점에서 3'UTR 중심의 규제를 조회 할 수있는 강력한 방법이다 개별 유전자의 표적 상태. 이 방법을 확인하기 위해, 우리는 275 3'UTRs의 패널을 상영하고 두 miRNA에 대해, 렛 7C 미르-10B를하고,이 라이브러리에서 10 이전에 검증 대상 유전자를 포함. 이러한 열 유전자 중 8 억압 ^(24)을 나타내었다. 우리는 또한 검증되지 않은 bioinformatically 예측 대상의 중요한 농축, 그리고 우리의 최고 히트 곡 중 정규 씨의 요소를 포함 예상치 못한 3'UTRs을 관찰, 설탕 없그 3'LIFE를 gesting 것은 선의 miRNA의 대상을 식별 할 수있다.

높은 처리량 스크린의 감도의 주요 지표는 위양성과 위음성 율이다. 이 분석의 위양성률이 안타를 검증하기 위해 추가로 다른 방법을 사용하여 평가 될 필요가 있지만, 열 양성 대조군의 팔은 20 %의 위음성 율을 제안, 우리의 원리 증명 화면 전시 억압에 포함되어 있습니다. 그러나, 다수의 셀룰러 기술은 상이한 상황에서 miRNA의 타겟을 식별하는 데 사용되며, 트랜스 - 작용 인자에 의한 3'UTR 처리 및 조절은 매우 조직 특이 적으로 알려져있다. 예를 들어, 3'UTRs의 대부분의 성숙한 mRNA의 3'UTR의 길이를 제어하는​​ 복수의 폴리아 데 닐화 부위를 포함하고있다. 많은 경우 인접 폴리아 데 닐화 부위의 이용은 조직 특이 적이며, miRNA의 표적 부위를 제외 할 수있다. 또한, 협력 miRNA의 타겟팅, 경쟁 위스콘신제 RNA 결합 단백질 및 mRNA의 이차 구조는 모든 충격 3'LIFE의 능력은 특정 조직에서의 miRNA 대상을 검출 할 수있다. 이 때문에 3'LIFE 분석으로 타겟 검출은 절대 에러 레이트의 평가를 복잡하게 분석이 수행되는 셀룰러 문맥에 따라 달라질 수있다. 이 프로토콜은 HEK293T 세포에 최적화되어 있지만, 연구자가 특정한 생물학적 환경에서 분석을 수행하고자하는 경우 다른 세포주가 사용될 수있다. 그러나, 각각의 세포주를 가진 형질 전환 효율과 세포 생존의 최적화는 복수의 버퍼 상태, 펄스 코드, 및 세포의 수를 사용하여 최적화되어야 할 것이다. 최적화 기법들의 예는 볼터 외. ^(24)에서 찾을 수있다.

이 프로토콜은 96- 웰 포맷으로 최적화 된 특정 높은 처리량 기기의 사용을 지정하고있다. 경우에는 기관 (96)에 필요한 장비를 소유하지 않는 것을- 음 Nucleofection는 대안 형질 전환 시약은 한 형질 전환 효율이 높게 유지 같이 3'LIFE 분석을 수행하는 데 사용될 수있다. 또한, 분석은 루시퍼 라제 분석 3'LIFE 가장 시간 소모 측면이다. 따라서, 여러 luminometers의 사용은 높은 처리량 화면을 사용하는 것이 좋습니다.

This work is supported by funds from the College of Liberal Arts and Science and the Biodesign Institute at Arizona State University and NIH Exploratory/Developmental Research Grant 1R21CA179144-01A1.

We thank Stephen Blazie, Karen Anderson, Josh LaBaer for advice and discussion. Karen Anderson, John Chaput, and Josh LaBaer for sharing reagents and instrumentation, Michael Gaskin and Andrea Throop for technical advise and protocols. Justin Wolter is a Maher scholar and thanks the Maher family for their generous support.