Выделение нормальных и раковых связанных Фибробласты из свежих тканей флуоресценции Активированный сортировки клеток (FACS)

Рак Associated фибробластов (CAFS) содействие раковых клеток, рост и прогрессию через понять, что способствует пролиферации, ангиогенеза и воспаления. Здесь мы опишем метод, чтобы изолировать чистые популяции нормальных фибробластов и CAFS из свежих мышиных и человеческих тканей сортировки клеток, используя PDGFRα как поверхность маркером.

Рак связанных фибробластов (CAFS) являются наиболее видных типа клеток в опухоли стромы многих видов рака, в частности рака молочной железы, и их заметное присутствие часто ассоциируется с плохим прогнозом ^1,2. CAFS являются активированный субпопуляции стромальных фибробластов, многие из которых выражают миофибробластов маркера α-SMA ^3. CAFS происходят из местных фибробластов ткани, а также из костного мозга клеток, полученных работу в развивающиеся опухоли и принять фенотип CAF под влиянием микроокружения опухоли ^4. CAFS были показаны для облегчения раковых клеток, рост и прогрессию через сигнализацию, которая способствует пролиферации опухолевых клеток, ангиогенез, и вторжение ^5-8. Мы показали, что CAFS повышения роста опухоли посреднические опухоли, способствующих образованию воспалений, начиная с самой ранней предварительной стадии опухолевого ^9. Несмотря на растущие доказательства из ключевых CAFS роль играет в обеспечении роста опухоли,изучение CAFS была текущие проблемы в связи с отсутствием CAF-специфических маркеров и подавляющее неоднородность этих клеток, при этом многие подтипы сосуществующих в опухоли микроокружения ^10. Кроме того, изучение фибробластов в пробирке затруднено тем, что их профиль экспрессии генов часто изменен в культуре ткани ^11,12. Чтобы решить эту проблему и обеспечить беспристрастный профилирования экспрессии генов фибробластов из свежей мыши и тканей человека, мы разработали метод, основанный на предыдущих протоколов для флуоресценции клеток, активированных сортировки (FACS) ^13,14. Наш подход основан на использовании PDGFRα как поверхностный маркер, чтобы изолировать фибробласты из свежих мышиных и человеческих тканей. PDGFRα обильно выражается как нормальные фибробласты и CAFS ^9,15. Этот метод позволяет выделения чистых популяций нормальные фибробласты и CAFS, в том числе, но не ограничиваясь α-SMA + активированный миофибробласты. Изолированные фибробласты могут бытьиспользуется для описания и сравнения эволюции экспрессии генов, которая происходит в течение CAFS опухолей. В самом деле, мы и другие сообщили профиля экспрессии фибробластов выделяют сортировки клеток ^16. Этот протокол был успешно проведен, чтобы изолировать и профилю высоко обогащенного популяции фибробластов из кожи, молочной железы, поджелудочной железы и легких тканей. Кроме того, наш метод позволяет также культивирование отсортированных клеток, в целях выполнения функциональных экспериментов и, чтобы избежать загрязнения опухолевыми клетками, которые часто большим препятствием при попытках культуры CAFS.

1. Пройдя молочной или ткани кожи у мышей

1. До рассечения тканей желаемое от мышей, подготовить следующие материалы и реактивы:

   Поставки:

   • Хирургия инструментов (промыть моющим средством, а затем погружают в 70% этанола).
   • Пенополистирол поверхность, чтобы отдохнуть мыши во время вскрытия.
   • Пальцы или иглы провести мышей во время вскрытия.
   • Стеклянная банка с крышкой для переваривания пищи, содержащей магнитной мешалкой (автоклавного).
   • Водяной бане при 37 ° C, содержащие погружные магнитной мешалкой и достаточно воды, чтобы затопить пищеварения банку, во время отдыха на мешалки.

   Реагенты:

   • FACS буфера I: (4 ° C): фосфат Дульбекко буферный раствор CMF (Кальций Магний бесплатно) + 0,5% BSA
   • Коллагеназы решение (сделанные непосредственно перед употреблением):
     0,05 г коллагеназы II
     0,05 г коллагеназы IV
     0,01 г дезоксирибонуклеазы
     20FACS мл буфера I. Держите раствором коллагеназы на льду до использования.
   • PharmLyse (хлористого аммония Лизирующий реагентов).
   • FACS буфера II: фосфат Дульбекко буферный раствор CMF + 1% FCS.
2. Препарирование молочных желез (см. также ^17).
   • Усыпить самок мышей с использованием диоксида углерода (CO ₂₎ ингаляции.
   • На поверхности пенополистирола, поместите курсор на спине и пин-код твердо всех четырех конечностей с использованием 25 калибровочных иглы (рис. 1А). Спрей мыши щедро с 70% этанола.
   • Используя щипцы, подтянуть кожу с живота по срединной линии и сделать небольшой разрез с острыми ножницами.
   • Начиная с разрезом, разрезать кожу до шеи животного, избегая проколов брюшной или грудной полости.
   • Разрежьте кожу на задних ногах от средней линии разреза на ноге, в результате чего "Y формы".
   • Снимите кожу от корпуса мыши и придавить, подвергаямолочной железы прикреплены к нижней кожи (рис. 1б).
   • Использование Q-Tips, чтобы аккуратно отделить молочных желез с кожи во время резки соединительной ткани с небольшими острыми ножницами, чтобы отделить молочной железы по направлению к позвоночнику мыши.
   • Брюшной железы (# 4, 5) являются лучшими для этого протокола. Вы также можете использовать ^2-й молочной железы, но имейте в виду, что эти железы анатомически расположен в непосредственной близости к грудной мышцы, которая может быть трудно отделить, в результате чего клетки смешанного происхождения ткани.
   • Примечание: При рассекает ткани опухоли, рекомендуется для удаления некротической регионов.
3. Препарирование тканей кожи: Самый простой способ получить ткани кожи, без необходимости иметь дело с удаления волос заключается в использовании мыши уши. Если большее количество ткани требуется, можно сбрить волосы от мыши туловища и рассекают кожу.
   • Усыпить мышей с использованием CO ₂ ингаляции.
   • Используя острые ножницы, отрезал оба уха и место сразу в пищеварении сосуд небольшого объема (~ 0,5 мл) PBS на льду.

2. Подготовка молочных желез / кожа суспензии отдельных клеток

• Поместите молочных желез / кожи в пищеварении сосуд небольшого объема PBS на льду. Если ткань кровавый мытья x2 с PBS, а затем удалите избыток PBS.
• Фарш тщательно с изогнутыми ножницами.
• Добавить 20 мл раствором коллагеназы (примечание: это количество коллагеназы решение будет эффективно диссоциирует около 5 г молочных или опухолевой ткани и уши от до 15 мышей).
• Поместите сразу на перемешайте пластины в 37 ° С водяной бане, и инкубировать в течение 15 мин при перемешивании при средней скорости.

Примечание: оптимальное время инкубации может меняться, если переваривания других тканей.

• Чтобы остановить реакцию, добавить 30 мл холодной DMEM + 10% FCS.
• Процедить ткани / СМИ смеси Througга 70 мкм ячейки фильтра размещены на верхней части 50 мл коническую трубку.
• Центрифуга коническую трубку в течение 5 мин при 450 мкг при 4 ° C.

3. Эритроцитов Лизис

Примечание: этот шаг не является необходимым, если мышей сердце перфузию PBS, прежде чем они были принесены в жертву.

• Аспирируйте супернатанта с помощью стеклянной пипетки прикреплены к вакуум, не нарушая осадок клеток.
• Для лизиса эритроцитов, ресуспендируют осадок клеток в 10 мл раствора PharmLyse и инкубировать 5 мин при комнатной температуре.
• Нейтрализовать PharmLyse решение, добавив примерно 40 мл FACS буфера I.
• Побочные коническую трубку с клетками в течение 5 мин при 450 мкг при 4 ° C.
• Аспирируйте супернатант.

4. Блокировка Эндогенные Fc

• Дополнительно: количество клеток, чтобы определить соответствующий объем для следующего шага.
• Ресуспендируют клеток в 1-3 мл FACS буфера I (в зависимости оп число клеток, а количество антител вы хотите использовать).
• Добавить FcBlock (анти-мышь CD16/CD32), чтобы достичь разведение 1:50 (10 мкг / мл) и инкубировали на льду в течение 10-20 ".
  Не нужно смывать FcBlock.

5. Окрашивание

• Возьмите 100 мкл аликвоты в Эппендорфа для использования в качестве не-окрашенных контроля и управления одного цвета (в зависимости от количества флуоресцентных антител используется).
• Для этикетке фибробластов: добавить анти-PDGFRα (непосредственно сопряженных с флуорофором) в разведении 1:50 (10 мкг / мл).
• Для обозначения других клеточных популяций (например, клетки иммунной системы, макрофаги, эндотелиальные клетки и т.д.): добавить соответствующие флуоресцентно антителами на поверхности маркеров, чтобы разведение 1:50.

Примечание: хотя PDGFRα является надежным маркером для фибробластов, рекомендуется включить антител для иммунных клеток, и для эпителиальных клеток, с тем чтобы исключить любое двойное положительноенаселение и тем самым повысить чистоту изолированных фибробластов.

• Добавить 2 мкл каждого антитела к каждому из одного цвета контроля труб Эппендорф.
• Инкубируйте клеток с антителами в течение 1 часа на льду в темноте.
• Для мытья: заполнить трубы с FACS буфера я и спина в течение 5 мин при 450 мкг при 4 ° C.
• Супернатант, ресуспендируют клеток в буфере FACS я до концентрации примерно 2 х 10 ⁶ клеток / мл, или любой концентрации наиболее подходящий для сортировки с доступной сортировщик FACS.

Дополнительно: Ячейки могут быть ресуспендировали в FACS буфера II на время сортировки. Это может улучшить жизнеспособность клеток. Тем не менее, воздействие факторов в сыворотке крови может быть выражением эффекта гена, которые должны быть проверены и приняты во внимание.

• Передача меченых клеток в FACS трубы с фильтром сверху: фильтр клеток в трубы, чтобы предотвратить клетки сгустки.
• Чтобы исключить мертвые клетки, добавьте 7AAD (0,5 мкг / мл) или Propidium йодида (PI) для образцов (за исключением ООН окрашенных управления).

Примечание: Чтобы избежать ненужной траты клеток, вы можете добавить 7AAD/PI в ООН окрашенных образцов после записи в FACS, и использовать снова, как 7AAD только для контроля.

• Храните образцы на льду при анализе.

6. Выделение клеток путем FACS

(Примечание: эта часть протокола требуется знание операционных сортировщик FACS, например, BD FACS AriaII, или помощь квалифицированного специалиста).

• Используя FACS сортировщик программного обеспечения (BD FACSDiva), подготовить соответствующие участки анализа для анализа рассеяния вперед (FSC), боковые рассеяния (SSC), 7AAD, FITC, PE и любого другого флуорофора использованы для маркировки клеток (рис. 2).
• Перед загрузкой каждого образца в ячейку сортировщик, вихрь кратко ресуспендирования клеток.
• Начните с анализа неокрашенных образцов для того, чтобы установить строб для всего населения клетке, из ворот челл мусора, а также для определения автофлуоресценции или фонового окрашивания.
• Анализ неокрашенных образцов + 7AAD, чтобы определить и ворота население живых клеток от общей популяции клеток.
• Анализ каждого отдельного управления цветом для определения и калибровки параметров, таких как компенсация.
• Анализ окрашенных образцов для определения положения ворот для сортировки.
• Как только параметры и ворота для желаемого популяции клеток были установлены, начинается сортировка меченых клеточных популяций в пробирки Эппендорф или 15 мл конические пробирки, содержащие культуральной среды или РНК буфера для лизиса (например, RLT буфера или Trizol).

Примечание: Если сортировки большого количества клеток, не рекомендуется для сортировки непосредственно в буфере для лизиса РНК, так как большой объем жидкости оболочка сопровождающие клетки разбавить буфером для лизиса и снижения урожайности.

• Побочные клетки вниз сразу же после сортировки закончен, и передача в свежую среду или РНК буфера для лизиса, де-в зависимости от цели вашего эксперимента.
• Если сортировка для того, чтобы культура изолированных клеток, выполняют стерильные рода. Для лучшего восстановления клеток, использование фенола красного бесплатно DMEM + 5% FCS, а FACS буфера II и сбор клеток в культуральной среде с 20% FCS.
• Если культивирование отсортированы фибробласты, коллаген alwaysplate на пластинках, покрытых и не непосредственно на пластик, так как это приводит к активации фибробластов, что приводит к изменениям в их экспрессии генов.

Использование PDGFRα в качестве маркера для фибробластов приводит к изоляции высоко обогащенного популяции ткани фибробласты. Уровень чистоты после сортировки составила 99%, а количественно после сортировки анализа (рис. 2A). Оценивая процент загрязнения не-фибробластов в относительном выражении клеточных генов, специфичных для контроля (рис. 2В) обычно показывает 0.1-0.6% загрязнений. Этот уровень обеспечивает высокую чистоту профилирования транскриптом качество изолированной фибробластов ^9.

В молочных железах, доля фибробластов в тканях колеблется в пределах 5-20% в нормальной ткани молочной железы, и 1-5% в MMTV-PyMT опухолей. Относительная доля фибробластов в опухолевой ткани ниже, чем в пре-опухолевой ткани, несмотря на увеличение общего числа фибробластов, в связи с массовым расширением эпителиальных отсека. Сокращенное% фибробластов, изолированных из опухолевой ткани является также результатомДобавлен технические трудности и снижение эффективности сортировки клеток с высокой некротических тканей.

Изолированные фибробласты могут быть выращены непосредственно после сортировки, но может потребоваться несколько дней, чтобы восстановиться (рис. 2D). Важно, чтобы выполнить все дальнейшие эксперименты с низким клетки проход, как первичные фибробласты подвергаются старению при распространении в культуре.

Рисунок 1. Очистка фибробласты из свежих молочных желез. A-FVB / п / PyMT мыши. B-Exposed молочных желез. C-Свежие молочные железы были вскрыты от FVB / п / PyMT мышей и переваривают коллагеназы к одной клеточной суспензии. Клетки иммунной меченные антитела для фибробластов поверхности маркер (PDGFRα) и маcrophages поверхности маркер (F4/80) с последующим разделением на FACS. Упорядочить фибробласты были либо культивировать или лизируются для очистки РНК. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

Рисунок 2. Профилирование отсортированы фибробластов. -Single клеточные суспензии мыши молочных желез окрашивали PDGFRαand F4/80 антител. FACS сортировки сюжет показали (левая панель). Р2 фибробластов ворот (PDGFRα + клеток) и P4 является макрофаги ворот (F4/80 + клеток). Сообщение рода анализ был проведен для определения чистоты отсортированы фибробласты и макрофаги (средней и правой панелей). B-анализ сортировки чистоты QRT-PCR клеточных генов, специфичных для управления fibroblaST (PDGFRα, Col-1α), иммунных клетках (CD45, CSF-1R) и эпителиальные клетки (E-кадгерин). Результаты были нормированы на два дома учета генов (GAPDH и МГУС). Относительное выражение GAPDH показано. C-Количественное выражение PDGFRα в общей несортированные населения молочной фибробластов. D-культуры ткани отсортированных фибробластов. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

В то время как эксперименты, проведенные в культуре тканей может быть информативным и функциональным предложить принципы, которые могут быть проверены в живом организме, как известно, большие изменения происходят в экспрессии генов клеток в культуре ^11,12. Для того чтобы избежать шаг культуре тканей при профилировании экспрессии генов в фибробласты, мы разработали протокол, который позволяет изоляции нормальных, а также рака связанного фибробласты из свежей мыши или тканей человека. Этот протокол был успешно применен кожи, поджелудочной железы и ткани молочной железы от мыши и человека ^9. Выделение фибробластов сортировки FACS требуется поверхностный маркер, что этикетки фибробластов. Мы установили, что PDGFRα является надежным маркером поверхности, что позволяет изоляции высоко обогащенного популяции фибробластов ^9. Кроме того, PDGFRα выражается как на нормальные фибробласты ткани и на CAFS, что позволяет беспристрастные изоляции и профилей из ткани фибробласты, а не focusiнг на конкретную субпопуляции.

Фибробласты являются гетерогенной популяции клеток по отношению к экспрессии маркеров молекул, а также в их происхождении и свойствах сигнализации ^8,10,18. В то время как PDGFRα является надежным маркером поверхности фибробластов, он не маркировать 100% фибробластов во всех тканях в результате немеченого субпопуляции клеток, в зависимости от типа ткани. В коже, примерно 90% фибробласты PDGFRα + (не показано), в то время как в молочных железах примерно 85% от общего числа фибробластов тканей PDGFRα + (рис. 2С). Процент PDGFRα выражения фибробласты могут отличаться в других типах тканей, и должна быть определена для каждой ткани. Тем не менее, в коже и в молочных железах, используя PDGFRα в качестве маркера клеточной поверхности может привести к высоко обогащенного популяции большинства тканей фибробластов, что позволяет профилирования экспрессии или культивирование отсортированных клеток.

Нет конфликта интересов объявлены.

Мы благодарим д-р Ицхак Oschry и доктора Орит Sagi-Асиф за помощь в сортировке FACS. Это исследование было поддержано грантами на северо-восток от Европейского Союза Седьмой Рамочной Программы (FP7/2007-2013) в рамках грантового соглашения N ° [276890], из Израиля Cancer Association (# 20110078), а из Израиля Cancer Research Fund (исследований Развитие карьеры Award).