Isolamento de fibroblastos normais e associados ao câncer de tecidos frescos, classificando células activadas por fluorescência (FACS)

Os fibroblastos de câncer associados (FAC) facilitar tumor iniciação, crescimento e progressão através de sinalização que promove a proliferação, angiogênese e inflamação. Descrevemos aqui um método para isolar populações puras de fibroblastos normais e cafés de rato fresca e tecidos humanos por selecção de células, utilizando PDGFRα como um marcador de superfície.

Associadas câncer fibroblastos (FAC), são o tipo de célula mais proeminente dentro do estroma tumoral de muitos cancros, em particular, carcinoma da mama, e a sua presença é muitas vezes associada proeminente com ^1,2 prognóstico pobre. FAC são uma subpopulação de fibroblastos estromais activadas, muitos dos quais expressam o marcador de miofibroblastos α ^SMA-3. FAC originam a partir de fibroblastos dos tecidos locais, bem como a partir de medula óssea derivadas de células recrutadas para o tumor em desenvolvimento e adoptar um fenótipo CAF, sob a influência do microambiente do tumor ^4. FAC foram mostrados para facilitar a iniciação do tumor, crescimento e a progressão através de sinalização que promove a proliferação de células de tumor, angiogénese e invasão ^5-8. Nós demonstramos que a FAC aumentar o crescimento do tumor através da mediação de tumor promover a inflamação, a partir das primeiras fases de pré-neoplásicas ^9. Apesar das evidências cada vez maior das FAC papel crucial na facilitação do crescimento tumoral,FAC estudam tem sido um desafio em curso, devido à falta de marcadores específicos do CAF ea heterogeneidade vasta destas células, com muitos subtipos co-existentes no microambiente do tumor ^10. Além disso, estudos de fibroblastos in vitro é dificultado pelo facto de o seu perfil de expressão do gene é muitas vezes alterados em cultura de tecido ^11,12. Para resolver este problema e permitir que o perfil de expressão gênica de imparcial fibroblastos de rato fresco e tecidos humanos, foi desenvolvido um método baseado em protocolos anteriores de fluorescência Ativado separação celular (FACS) ^13,14. A nossa abordagem baseia-se na utilização PDGFRα como um marcador de superfície para isolar fibroblastos de rato fresca e tecidos humanos. PDGFRα é abundantemente expresso por ambos os fibroblastos normais e cafs ^9,15. Este método permite o isolamento de populações puras de fibroblastos normais e cafés, incluindo, mas não limitado a α-SMA + activado miofibroblastos. Fibroblastos isolados podem então serutilizados para a caracterização e comparação da evolução da expressão do gene que ocorre no FAC durante a tumorigénese. Na verdade, nós e outros relataram perfil de expressão de fibroblastos isolados pela classificação celular ^16. Este protocolo foi realizado com sucesso em isolar e perfil populações altamente enriquecido de fibroblastos dos tecidos da pele, pâncreas, mama e pulmão. Além disso, o nosso método também permite que a cultura de células seleccionadas, a fim de realizar experiências funcionais e para evitar a contaminação por células tumorais, o que é muitas vezes um grande obstáculo ao tentar FAC cultura.

1. Dissecando tecido mamário ou pele de camundongos

1. Antes de dissecação do tecido a partir de ratinhos desejado, preparar os seguintes materiais e reagentes:

   Suprimentos:

   • Ferramentas de operação (lavado com detergente e, em seguida mergulhados em etanol a 70%).
   • Superfície de isopor para descansar o mouse sobre durante a dissecção.
   • Pinos ou agulhas para manter ratos durante a dissecção.
   • Frasco de vidro com tampa para a digestão, contendo uma barra magnética (autoclavado).
   • Banho de água a 37 ° C, contendo um agitador magnético submersível e água suficiente para submergir o frasco de digestão, enquanto repousa sobre a placa de agitação.

   Reagentes:

   • Tampão FACS I: (4 ° C): Fosfato de Dulbecco Buffered Saline CMF (Cálcio Magnésio livre) + BSA a 0,5%
   • Colagenase solução (feita imediatamente antes da utilização):
     0,05 g de colagenase II
     0,05 g de colagenase IV
     0,01 g desoxirribonuclease
     20ml de tampão de FACS I. Manter solução de colagenase em gelo até à utilização.
   • PharmLyse (amônio Cloreto de Lise).
   • Tampão FACS II: Fosfato de Dulbecco Buffered Saline CMF + FCS a 1%.
2. Dissecção das glândulas mamárias (ver também ^17).
   • Eutanásia ratos fêmeas usando inalação de dióxido de carbono (CO _2).
   • Em uma superfície de isopor, coloque o mouse sobre a sua volta e fixar firmemente todos os quatro membros, usando agulhas de calibre 25 (Figura 1A). Pulverizar o mouse generosamente com etanol 70%.
   • Utilizando uma pinça, puxe a pele abdominal na linha média e fazer uma pequena incisão com tesoura afiada.
   • A partir da incisão, cortar a pele até ao pescoço do animal, evitando a punção da cavidade abdominal ou torácica.
   • Cortar a pele das patas traseiras a partir da incisão na linha média para a perna, o que resulta numa "forma de Y".
   • Puxe a pele longe do corpo do mouse e definir, expondoas glândulas mamárias acoplada à parte inferior da pele (Figura 1B).
   • Use Q-dicas para gentilmente separar glândulas mamárias da pele durante o corte do tecido conjuntivo com pequenas tesouras afiadas para separar a glândula mamária para a coluna do mouse.
   • As glândulas abdominais (# 4, 5) são os melhores para este protocolo. Também é possível utilizar a glândula mamaria ² º, mas ter em mente que estas glândulas são anatomicamente localizado na proximidade do músculo peitoral que podem ser difíceis de separar, o que resulta em células de origem mista do tecido.
   • Nota: Quando dissecar tecido tumoral, recomenda-se para remover as regiões necróticas.
3. A dissecção do tecido da pele: A maneira mais fácil de obter tecido da pele, sem ter que lidar com a depilação é usar orelhas de rato. Se uma quantidade maior de tecido é necessário, você pode cortar o cabelo de torso mouse e dissecar pele.
   • Euthanize ratos usando _inalação de CO2.
   • Utilizando uma tesoura afiada e cortar ambas as orelhas e colocar imediatamente no frasco de digestão contendo um pequeno volume (~ 0,5 ml) de PBS em gelo.

2. Preparação de suspensão de células da glândula mamária / pele Único

• Coloque glândulas mamárias / pele no frasco de digestão contendo um pequeno volume de PBS em gelo. Se o tecido é sangrenta x2 lavagem com PBS e, em seguida, descartar excesso de PBS.
• Picar cuidadosamente com tesoura curva.
• Adicionar (nota: esta quantidade de solução de colagenase será eficiente dissociar aproximadamente 5 g de tecido mamário ou tumor e orelhas de até 15 ratos) 20 ml de solução de colagenase.
• Colocar imediatamente na placa de agitar a 37 ° C banho-maria, e incubar durante 15 min, sob agitação a uma velocidade média.

Nota: Os tempos de incubação ideais podem variar se digerir outros tecidos.

• Para parar a reacção, adicionar 30 ml de DMEM frio + 10% FCS.
• Coe o throug mistura de tecido / mídiaha 70 uM coador célula colocado no topo de um tubo cónico de 50 ml.
• Centrifugar o tubo cónico de 5 min a 450 xg a 4 ° C.

3. Red Blood Cells Lise

Nota: este passo não é necessário se os ratos estavam de coração perfundidos com PBS antes de serem sacrificadas.

• Aspirar o sobrenadante com uma pipeta de vidro ligado a vácuo, sem perturbar o sedimento celular.
• Para lisar RBC, ressuspender o pellet em 10 células solução PharmLyse ml e incubar durante 5 min à temperatura ambiente.
• Neutraliza-se a solução PharmLyse por adição de cerca de 40 ml de tampão FACS I.
• Girar o tubo cónico com as células durante 5 min a 450 xg a 4 ° C.
• Aspirar o sobrenadante.

4. Bloqueio de Fc Endógeno

• Opcional: células de contagem para determinar o volume apropriado para os passos seguintes.
• Ressuspender as células em 1-3 ml de tampão de FACS (dependendo o In número de células e quantidade de anticorpos que deseja usar).
• Adicionar FcBlock (anti-rato de CD16/CD32) para chegar a diluição 1:50 (10 ug / ml), e incubar em gelo durante 10-20 '.
  Não há necessidade de lavar FcBlock.

5. Coloração

• Tirar alíquotas de 100 ul a tubos eppendorf para ser utilizado como um controlo não-coradas e os controlos de cor individuais (de acordo com o número de anticorpos fluorescentes utilizadas).
• Para fibroblastos etiqueta: adicionar anti-PDGFRα (directamente conjugado com fluoróforo) para uma diluição de 1:50 (10 ug / ml).
• Para etiquetar outras populações de células (por exemplo células do sistema imune, macrófagos, células endoteliais, etc): adicionar apropriadas anticorpos conjugados com fluorescência para marcadores de superfície, para uma diluição de 1:50.

Nota: embora PDGFRα é um marcador robusto para fibroblastos, recomenda-se a incluir anticorpos para as células do sistema imunológico e para as células epiteliais, a fim de excluir qualquer positivo duplopopulações e, assim, melhorar a pureza de fibroblastos isolados.

• Adicionam-se 2 jil de cada um dos anticorpos para cada uma das cores individuais tubos eppendorf de controlo.
• Incubar as células com anticorpos para 1 hora em gelo, no escuro.
• Para lavar: encher os tubos com tampão FACS I e girar durante 5 minutos a 450 xg a 4 ° C.
• Aspirar o sobrenadante, Ressuspender as células em tampão de SCAF I a uma concentração de aproximadamente 2 x 10 ⁶ células / ml, ou qualquer que seja a concentração mais adequada para a sua classificação com classificador FACS disponível.

Opcional: As células podem ser ressuspendidas em tampão FACS II durante a triagem. Isto pode melhorar a viabilidade celular. No entanto, a exposição a factores de soro podem ter um efeito de expressão do gene, o que deve ser testado, e tomados em consideração.

• Transferir células marcadas em tubos de FACS com células: filtro de topo do filtro no tubo para evitar grumos celulares.
• Para excluir as células mortas, adicionar 7AAD (0,5 ug / ml) ou Propidium Iodeto (PI) para amostras (exceto para o controle de não-coradas).

Nota: Para evitar o desperdício de células, você pode adicionar 7AAD/PI à amostra não-manchado após a gravação nos FACS, e usar de novo como 7AAD somente controle.

• Manter as amostras em gelo ao analisar.

6. Isolamento de células por FACS

(Nota: esta parte do protocolo requer conhecimento prévio em funcionamento de um separador de FACS, por exemplo, BD FACS AriaII, ou a assistência de um técnico especializado).

• Usando o software classificador FACS (BD FACSDiva), preparar lotes de análise adequados para analisar dispersão frontal (FSC), dispersão lateral (SSC), 7AAD, FITC, PE e qualquer outro fluoróforo usado para células de etiquetas (Figura 2).
• Antes de carregar cada amostra para o classificador de celular, brevemente vortex para ressuspender as células.
• Comece analisando a amostra sem mácula, a fim de definir a propagação para a população total de células, para deixar de fora celdetritos l, e para determinar a autofluorescência ou coloração de fundo.
• Analisar amostras não coradas + 7AAD para determinar e porta a população de células vivas a partir da população total de células.
• Analise cada controle de cor única para determinar e calibrar parâmetros, tais como a compensação.
• Analisar a amostra corada para definir a posição das portas para classificação.
• Uma vez que os parâmetros e as portas para as populações de células pretendidas tenham sido definidos, começam classificando as populações de células marcadas em tubos de Eppendorf ou tubos cónicos de 15 ml contendo meio de cultura ou de ARN de tampão de lise (como RLT tampão ou Trizol).

Nota: Se a classificação de um grande número de células, isso não é recomendado para ordenar directamente em tampão de lise de ARN, tal como o grande volume de fluido de revestimento que acompanha as células irão diluir o tampão de lise e reduz o rendimento.

• Girar células-se imediatamente após a classificação está terminado, e transferência para meio fresco ou tampão de lise RNA, dependente sobre o propósito da sua experiência.
• Se a classificação, a fim de células de cultura isoladas, executar tipo estéril. Para uma melhor recuperação de células, use vermelho de fenol livre DMEM + FCS a 5%, em vez de tampão FACS II e recolher as células em meio de cultura com FCS 20%.
• Se cultura ordenadas fibroblastos, alwaysplate em placas de colágeno revestidos e nunca diretamente no plástico como isso resulta em ativação de fibroblastos levando a mudanças em sua expressão gênica.

Usando PDGFRα como um marcador para fibroblastos resulta em isolamento de populações altamente enriquecidas de fibroblastos de tecido. O nível de pureza após separação foi de 99%, tal como quantificado por tipo pós-análise (Figura 2A). Calculando a percentagem de contaminação de fibroblastos células não pela expressão relativa de genes específicos de células de controlo (Figura 2B) mostra tipicamente contaminação 0,1-0,6%. Este nível de pureza permite profiling transcriptoma de alta qualidade de fibroblastos isolados ^9.

Em glândulas mamarias, a percentagem de fibroblastos no tecido varia entre 5-20%, em tecido mamário normal, e 1-5% em MMTV-PyMT tumores. A percentagem relativa de fibroblastos no tecido do tumor é menor que a pré-neoplásicas do tecido, apesar do aumento do número total de fibroblastos, em virtude da expansão em massa do compartimento epitelial. A% de redução de fibroblastos isolados a partir de tecido tumoral é também um resultado doo adicionado dificuldade técnica e diminuição da eficiência de separação de células a partir de um tecido altamente necrótico.

Fibroblastos isolados podem ser cultivadas directamente, após separação, mas pode requerer alguns dias para recuperar (Figura 2D). É essencial para realizar todas as experiências adicionais com células de passagem baixa, como fibroblastos primários sofrem senescência durante a propagação em cultura.

Figura 1. Purificação de fibroblastos de fresco glândulas mamárias. A-FVB / n / PyMT mouse. B-Exposed glândulas mamárias. C-Fresh glândulas mamarias foram dissecados a partir de FVB / n / mice PyMT e digerida com colagenase para uma suspensão de células simples. As células foram imuno-marcadas com anticorpos para o marcador de superfície de fibroblastos (PDGFRα) e macrophages marcador de superfície (F4/80) seguida por separação por FACS. Fibroblastos foram ordenados ou cultivadas ou lisadas para purificação de RNA. Clique aqui para ver maior figura .

Figura 2. Profiling de fibroblastos classificados. Um único suspensões de células das glândulas mamárias do mouse foram coradas com PDGFRαand F4/80 anticorpos. FACS trama de classificação é apresentada (painel esquerdo). P2 é a porta fibroblastos (PDGFRα + células) e P4 é a porta macrófagos (F4/80 + células). Uma análise tipo de pós foi realizada para determinar a pureza de fibroblastos e macrófagos classificados (painéis do meio e direita). B-Análise de pureza a classificação por qRT-PCR de genes específicos de células de controlo para fibroblast (PDGFRα, Col-1α), células do sistema imune (CD45, CSF-1R) e células epiteliais (E-caderina). Os resultados foram normalizados para os dois genes arrumação (GAPDH e MGUS). A expressão relativa a GAPDH é mostrado. C Quantificação da expressão PDGFRα na população total de fibroblastos indiferenciados mamárias. D Tissue-cultura de fibroblastos classificados. Clique aqui para ver maior figura .

Embora experiências efectuadas em cultura de tecidos podem ser informativas e sugerem princípios funcionais que podem ser verificadas in vivo, que se sabe que ocorrem grandes mudanças na expressão de genes de células em cultura ^11,12. A fim de evitar uma etapa de cultura de tecido, quando o perfil de expressão de genes em fibroblastos, foi desenvolvido um protocolo que permite o isolamento dos normais, bem como as associadas câncer fibroblastos de rato fresco ou de tecido humano. Este protocolo foi aplicado com sucesso com o pâncreas, pele e mama a partir de tecidos de rato e humana a partir de ^9. Isolamento de fibroblastos por triagem FACS requer um marcador de superfície de fibroblastos que etiquetas. Nós estabelecemos que PDGFRα é um marcador de superfície robusta que permite o isolamento de populações altamente enriquecidas de fibroblastos ^9. Além disso, é expressa PDGFRα em ambos os fibroblastos dos tecidos normais e em FAC, permitindo assim o isolamento e caracterização imparcial dos fibroblastos do tecido em vez de focusing de uma subpopulação específica.

Os fibroblastos são uma população de células heterogéneas no que diz respeito à expressão das moléculas de marcador, bem como na sua origem e propriedades de sinalização ^8,10,18. Enquanto PDGFRα é um marcador de superfície robusta para os fibroblastos, que não rotular 100% dos fibroblastos em todos os tecidos, resultando em uma subpopulação de células não marcado, dependendo do tipo de tecido. Na pele, aproximadamente 90% dos fibroblastos são PDGFRα + (não apresentado), enquanto que nas glândulas mamárias de aproximadamente 85% dos fibroblastos dos tecidos totais são PDGFRα + (Figura 2C). A percentagem de fibroblastos que expressam PDGFRα podem variar em outros tipos de tecidos, e tem de ser definidas para cada tecido. No entanto, na pele e nas glândulas mamárias, utilizando PDGFRα como um marcador de superfície celular irá resultar em populações altamente enriquecidas de a maioria dos fibroblastos do tecido, permitindo que o perfil de expressão ou de cultura de células seleccionadas.

Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecemos ao Dr. Yitzchak Oschry e Dr. Orit Sagi-Asif por sua ajuda com a classificação FACS. Esta pesquisa foi suportada por concessões para a NE do Sétimo Programa-Quadro da União Europeia (FP7/2007-2013) sob subvenção n ° [276890], a partir da Israel Cancer Association (# 20110078), e da Israel Cancer Research Fund (Investigação Prémio Carreira de Desenvolvimento).