Isolation des fibroblastes normales et cancéreuses associées à partir de tissus frais par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)

Cancer fibroblastes associés (CAF) de faciliter l'initiation des tumeurs, la croissance et la progression à travers signalisation qui favorise la prolifération, l'angiogenèse et l'inflammation. Nous décrivons ici une méthode pour isoler des populations pures de fibroblastes normaux et de souris CAF frais et tissus humains par tri cellulaire, en utilisant PDGFRα comme un marqueur de surface.

Fibroblastes associés au cancer (CAF) sont le type cellulaire le plus important au sein du stroma tumoral de nombreux cancers, notamment dans les cancers du sein, et leur présence importante est souvent associée à un mauvais pronostic ^1,2. CAF sont une sous-population de fibroblastes du stroma activé, dont beaucoup expriment le marqueur de myofibroblastes α-SMA ^3. CAF proviennent de fibroblastes tissulaires locales ainsi que de la moelle osseuse des cellules dérivées recrutés dans la tumeur en développement et adopter un phénotype CAF sous l'influence du microenvironnement tumoral ^4. CAF a montré une tumeur afin de faciliter l'initiation, la croissance et la progression à travers de signalisation qui favorise la prolifération cellulaire tumorale, l'angiogenèse et l'invasion ^5-8. Nous avons démontré que les CAF améliorer la croissance tumorale par la médiation de l'inflammation tumorale-promotion, en commençant au plus tôt le pré-néoplasiques étapes ^9. En dépit des preuves croissantes des CAF rôle clé que jouent dans la facilitation de la croissance tumorale,CAF étudiant a été un défi permanent en raison de l'absence de marqueurs spécifiques à la CAF et de l'hétérogénéité majorité de ces cellules, avec de nombreux sous-types de co-existantes dans le microenvironnement de la tumeur ^10. Par ailleurs, l'étude de fibroblastes in vitro est entravée par le fait que leur profil d'expression génique est souvent altérée dans ^11,12 culture de tissus. Pour résoudre ce problème et permettre impartiale profil d'expression génique de fibroblastes de souris frais et tissus humains, nous avons développé une méthode basée sur des protocoles antérieurs pour le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) ^13,14. Notre approche repose sur l'utilisation de PDGFRα comme un marqueur de surface à isoler les fibroblastes de souris frais et les tissus humains. PDGFRα est abondamment exprimé par les deux fibroblastes normaux et CAF ^9,15. Cette méthode permet d'isoler des populations pures de fibroblastes normaux et les EFC, y compris, mais sans s'y limiter α-SMA + activé myofibroblastes. Fibroblastes isolés peuvent ensuite êtreutilisé pour la caractérisation et la comparaison de l'évolution de l'expression des gènes qui se produit en cours de tumorigénèse CAF. En effet, nous et d'autres ont rapporté profilage de l'expression des fibroblastes isolés par tri cellulaire ^16. Ce protocole a été réalisé avec succès pour isoler et caractériser les populations hautement enrichies de fibroblastes de la peau des tissus, mammaires, le pancréas et les poumons. De plus, notre méthode permet également de cultiver des cellules triées, afin de réaliser des expériences fonctionnelles et pour éviter toute contamination par des cellules tumorales, ce qui est souvent un obstacle important lorsque vous essayez de CAF culture.

1. Dissection du tissu mammaire ou de la peau de souris

1. Avant de disséquer le tissu désiré de souris, préparer les fournitures et réactifs suivants:

   Fournitures:

   • Outils de chirurgie (lavés avec du détergent, puis trempé dans l'éthanol à 70%).
   • Surface de styromousse pour reposer la souris sur lors de la dissection.
   • Épingles ou des aiguilles de tenir des souris lors de la dissection.
   • Bocal en verre avec couvercle pour la digestion, contenant un barreau d'agitation magnétique (autoclave).
   • Bain d'eau à 37 ° C, contenant un agitateur magnétique submersible et suffisamment d'eau pour immerger le pot digestion, tout en reposant sur la plaque d'agitation.

   Réactifs:

   • Tampon FACS I: (4 ° C): phosphate de Dulbecco saline tamponnée CMF (Calcium Magnésium gratuit) + 0,5% de BSA
   • Solution de collagénase (faite immédiatement avant utilisation):
     0,05 g collagénase II
     0,05 g collagénase IV
     0,01 g Deoxyribonucbail
     20 ml de tampon FACS I. Conserver la solution de collagénase sur la glace jusqu'à utilisation.
   • PharmLyse (Réactif de Lyse chlorure d'ammonium).
   • Tampon FACS II: phosphate de Dulbecco saline tamponnée CMF + 1% de SVF.
2. Dissection des glandes mammaires (voir aussi ^17).
   • Euthanasier les souris femelles à l'aide d'inhalation de dioxyde de carbone (CO _2).
   • Sur une surface de polystyrène, placez la souris sur son dos et la broche fermement les quatre membres avec 25 aiguilles de calibre (figure 1A). Vaporisez généreusement la souris avec de l'éthanol à 70%.
   • En utilisant des pinces, tirer vers le haut la peau de l'abdomen sur la ligne médiane et faire une petite incision avec des ciseaux pointus.
   • A partir de l'incision, couper la peau jusqu'au cou de l'animal tout en évitant la perforation des cavités abdominale ou thoracique.
   • Coupez la peau sur les pattes arrière de l'incision médiane vers la jambe, ce qui entraîne une "forme de Y".
   • Tirez la peau loin de mouse corps et la broche vers le bas, exposant les glandes mammaires rattachées à la face inférieure de la peau (figure 1B).
   • Utilisez Q-tips séparer doucement les glandes mammaires de la peau tout en réduisant tissu conjonctif avec de petits ciseaux bien aiguisés pour séparer la glande mammaire vers la colonne vertébrale de la souris.
   • Les glandes abdominales (# 4, 5) sont les meilleurs pour ce protocole. Vous pouvez également utiliser la glande mammaire 2 ^ème, mais gardez à l'esprit que ces glandes sont anatomiquement situé à proximité du muscle pectoral qui peuvent être difficiles à séparer, résultant en des cellules d'origine mixte du tissu.
   • Remarque: Lors de la dissection du tissu tumoral, il est recommandé de supprimer des régions nécrotiques.
3. La dissection des tissus de la peau: La meilleure façon d'obtenir des tissus de la peau, sans avoir à traiter avec l'épilation est d'utiliser oreilles de souris. Si une plus grande quantité de tissu est nécessaire, vous pouvez vous raser les poils du torse de la souris et de disséquer la peau.
   • Euthanasier les souris uchanter inhalation de CO _2.
   • Avec des ciseaux pointus, couper les deux oreilles et les placer immédiatement dans un pot de digestion contenant un volume faible (~ 0,5 ml) de PBS sur la glace.

2. Préparation de la glande mammaire de la peau / Suspension Single Cell

• Placez les glandes mammaires / peau dans un bocal contenant la digestion d'un petit volume de PBS sur la glace. Si le tissu est sanglante lavage avec du PBS x2, puis jetez excès de PBS.
• Hacher soigneusement avec des ciseaux courbes.
• Ajouter (note: cette quantité de solution de collagénase se dissocier efficacement environ 5 g de tissu mammaire ou une tumeur et les oreilles d'un maximum de 15 souris) 20 ml solution de collagénase.
• Placez immédiatement sur plaque d'agitation à 37 ° C bain d'eau, et incuber pendant 15 min en remuant au taux moyen.

Remarque: Les durées optimales d'incubation peut varier si la digestion d'autres tissus.

• Pour arrêter la réaction, on ajoute 30 ml de DMEM froid + F 10%CS.
• Filtrer le mélange tissu / support à travers un tamis 70 um cellule placée au-dessus d'un tube conique de 50 ml.
• Centrifuger le tube conique pendant 5 min à 450 xg à 4 ° C.

3. Lyse des globules rouges

Remarque: cette étape n'est pas nécessaire si les souris étaient de cœur perfusé avec du PBS avant leur sacrifice.

• Aspirer le surnageant à l'aide d'une pipette en verre attaché à vide, sans perturber le culot cellulaire.
• Pour lyser RBC, remettre en suspension culot cellulaire dans une solution à 10 PharmLyse ml et incuber pendant 5 min à température ambiante.
• Neutraliser la solution PharmLyse par addition d'environ 40 ml de tampon FACS I.
• Faites tourner le tube conique avec des cellules pendant 5 min à 450 xg à 4 ° C.
• Aspirer le surnageant

4. Blocage de Fc endogène

• En option: compter les cellules pour déterminer le volume approprié pour la ste suivanteps.
• Resuspendre les cellules dans 1-3 ml de tampon FACS I (selon le nombre de cellules, et la quantité d'anticorps que vous souhaitez utiliser).
• Ajouter FcBlock (anti-souris CD16/CD32) pour atteindre dilution 1:50 (10 pg / ml) et incuber sur de la glace pendant 10-20 '.
  Pas besoin de rincer FcBlock.

5. Tachant

• Sortez aliquotes de 100 pi dans des tubes eppendorf être utilisées comme contrôle non teinté et des couleurs simples (selon le nombre d'anticorps fluorescents utilisés).
• Pour fibroblastes étiquettes: ajoutez anti-PDGFRα (directement conjugué à un fluorophore) à une dilution de 1:50 (10 pg / ml).
• Pour marquer d'autres populations cellulaires (par exemple, des cellules immunitaires, les macrophages, les cellules endothéliales, etc): ajouter appropriées anticorps par fluorescence conjugués à des marqueurs de surface, à une dilution de 1:50.

Remarque: bien que PDGFRα est un marqueur robuste pour les fibroblastes, il est recommandé d'inclure des anticorps pour immune cellules et de cellules épithéliales afin d'exclure toutes les populations doubles positifs et renforcer ainsi la pureté de fibroblastes isolés.

• Ajouter 2 l de chaque anticorps de chacun des tubes eppendorf de contrôle de couleur uniques.
• Incuber les cellules avec des anticorps pendant 1 heure sur la glace dans l'obscurité.
• Pour laver: remplir les tubes avec du tampon FACS I et tourner pendant 5 min à 450 xg à 4 ° C.
• Aspirer le surnageant, remettre les cellules en FACS Je tampon à une concentration d'environ 2 x 10 ⁶ cellules / ml, ou n'importe quel concentration la plus appropriée pour le tri avec votre trieur FACS disponibles.

En option: Les cellules peuvent être remises en suspension dans du tampon FACS II pour la durée de tri. Cela peut améliorer la viabilité des cellules. Toutefois, l'exposition à des facteurs présents dans le sérum peut avoir un effet l'expression des gènes, qui doivent être testés, et pris en compte.

• Transfert cellules marquées dans des tubes FACS avec filtre haut: filtre les cellules dans les tubes àempêcher amas cellulaires.
• Pour exclure les cellules mortes, ajouter 7AAD (0,5 pg / ml) ou l'iodure de propidium (PI) à des échantillons (sauf pour le contrôle non teinté).

Remarque: Pour éviter de perdre des cellules, vous pouvez ajouter 7AAD/PI à l'échantillon non taché après l'enregistrement dans les FACS, et utiliser à nouveau comme 7AAD seule commande.

• Conserver les échantillons sur la glace lors de l'analyse.

6. Isolement de cellules par FACS

(Remarque: cette partie du protocole nécessite la connaissance de l'exploitation d'un trieur FACS, par exemple BD FACS AriaII, ou l'assistance d'un technicien qualifié).

• Utilisation du logiciel trieur FACS (BD FACSDiva), préparer des parcelles d'analyse appropriés pour analyser diffusion vers l'avant (FSC), la diffusion latérale (SSC), 7AAD, FITC, PE et tout autre fluorophore utilisé pour marquer les cellules (figure 2).
• Avant de charger chaque échantillon au trieur de cellules, vortex brièvement pour remettre en suspension les cellules.
• Commencez par analytion de l'échantillon sans tache, afin de régler le déclenchement de la population cellulaire totale, à la porte des débris cellulaires, et de déterminer autofluorescence ou coloration de fond.
• Analyser l'échantillon non coloré + 7AAD de déterminer et porte la population de cellules vivantes de la population cellulaire totale.
• Analyser chaque contrôle seule couleur de déterminer et de calibrer les paramètres tels que la rémunération.
• Analyser l'échantillon coloré pour définir la position des portes pour le tri.
• Une fois les paramètres et portails pour les populations de cellules aient été définies, commencer à trier les populations cellulaires marqués dans des tubes Eppendorf ou 15 ml tubes coniques contenant un milieu de culture ou de tampon de lyse ARN (comme RLT tampon ou Trizol).

Remarque: Si le tri d'un grand nombre de cellules, il n'est pas recommandé de trier directement dans un tampon de lyse ARN, comme le volume de liquide de gainage qui accompagne les cellules se diluer le tampon de lyse et de réduire le rendement.

• Spin cellules vers le bas immédiatement après le tri est terminé, et le transfert dans un milieu frais ou tampon de lyse ARN, selon le but de votre expérience.
• Si le tri afin de cultiver des cellules isolées, effectuez sorte stérile. Pour une meilleure récupération des cellules, utilisez le rouge de phénol libre DMEM + 5% SVF au lieu de tampon FACS II et recueillir des cellules dans un milieu de culture avec 20% de FCS.
• Si la culture de fibroblastes triés, alwaysplate sur des plaques recouvertes de collagène et jamais directement sur le plastique car cela conduit à l'activation des fibroblastes entraînant des changements dans leur expression génique.

PDGFRα utilisant comme marqueur de résultats de fibroblastes dans l'isolement de populations de fibroblastes hautement enrichi tissus. Le niveau de pureté après le tri a été de 99%, telle que quantifiée par l'analyse post-tri (figure 2A). Estimer le pourcentage de contamination des cellules non fibroblastiques par l'expression relative de gènes spécifiques des cellules de contrôle (figure 2B) montre généralement une contamination 0,1-0,6%. Ce niveau de pureté élevé permet profilage transcriptome qualité des fibroblastes isolés ^9.

Dans les glandes mammaires, le pourcentage de fibroblastes dans le tissu varie entre 5-20% dans le tissu mammaire normal, et 1-5% en MMTV-PyMT tumeurs. Le pourcentage relatif de fibroblastes dans le tissu tumoral est plus faible que dans le tissu pré-néoplasique, malgré l'augmentation du nombre total de fibroblastes, en raison de l'expansion massive du compartiment épithélial. L'% réduit de fibroblastes isolés à partir de tissus tumoraux est aussi le résultat dela valeur ajoutée des difficultés techniques et une diminution de l'efficacité du tri de cellules à partir d'un tissu très nécrotique.

Fibroblastes isolés peuvent être cultivées directement après le tri, mais peut nécessiter quelques jours pour récupérer (figure 2D). Il est essentiel de procéder à toutes les autres expériences avec des cellules faible nombre de passages, comme la sénescence des fibroblastes primaires subissent lors de la propagation de la culture.

Figure 1. Purification des fibroblastes de frais glandes mammaires. A-FVB / N / PyMT souris. B-exposée glandes mammaires. C-douce glandes mammaires ont été disséqués à partir FVB / N / souris PyMT et digéré par la collagénase à une suspension de cellules isolées. Les cellules ont été immuno-marquées avec des anticorps de marqueur de surface des fibroblastes (PDGFRα) et mamarqueur de surface crophages (F4/80) suivie d'une séparation par FACS. Fibroblastes ont été triés soit cultivé ou lysées pour la purification d'ARN. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 2. Le profilage des fibroblastes triés. A-simples suspensions de cellules de glandes mammaires de souris ont été colorées avec des anticorps PDGFRαand F4/80. Parcelle de tri FACS est indiqué (panneau de gauche). P2 est la porte fibroblastes (cellules PDGFRα +) et P4 est la porte macrophages (F4/80 + cellules). Une analyse genre après a été effectuée pour déterminer la pureté des fibroblastes et des macrophages (triés panneaux milieu et de droite). B-Analyse de la pureté de tri par qRT-PCR des gènes spécifiques aux cellules de contrôle pour fibroblast (PDGFRα, Col-1α), les cellules immunitaires (CD45, CSF-1R) et les cellules épithéliales (E-cadhérine). Les résultats ont été normalisés à deux gènes Keeping House (GAPDH et MGUS). Expression par rapport à la GAPDH est affiché. C-Quantification de l'expression PDGFRα de la population non triés total de fibroblastes mammaires. D Tissue-culture de fibroblastes triés. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Bien que les expériences réalisées en culture de tissus peut être informatif et proposer des principes fonctionnels qui peuvent être vérifiées in vivo, il est connu que des changements importants se produisent dans l'expression des gènes des cellules en culture ^11,12. Afin d'éviter une étape de culture de tissus lors du profilage d'expression génique dans les fibroblastes, nous avons développé un protocole qui permet l'isolement de la normale, ainsi que des fibroblastes associés au cancer de la souris frais ou tissus humains. Ce protocole a été appliqué avec succès avec des tissus peau, du pancréas et du sein chez la souris et de ⁹ humaine. Isolation des fibroblastes par tri FACS nécessite un marqueur de surface que les fibroblastes étiquettes. Nous avons établi que PDGFRα est un marqueur de surface robuste qui permet l'isolement des populations hautement enrichies de fibroblastes ^9. En outre, PDGFRα est exprimé sur les deux fibroblastes des tissus normaux et sur les CAF, permettant ainsi à l'isolement impartiale et profilage des fibroblastes du tissu plutôt que focusing sur une sous-population spécifique.

Les fibroblastes sont une population cellulaire hétérogène en ce qui concerne l'expression des molécules de marquage ainsi que dans leur origine et les propriétés de signalisation ^8,10,18. Alors que PDGFRα est un marqueur de surface robuste pour les fibroblastes, il ne marque pas 100% des fibroblastes dans tous les tissus résultant en une sous-population de cellules non marquées, en fonction du type de tissu. Dans la peau, environ 90% de fibroblastes sont PDGFRα + (non représenté) tandis que les glandes mammaires à environ 85% de fibroblastes tissulaires totales sont PDGFRα + (figure 2C). Le pourcentage de PDGFRα fibroblastes exprimant peut varier dans d'autres types de tissus, et doit être défini pour chaque tissu. Néanmoins, dans la peau et dans les glandes mammaires, PDGFRα utilisant comme marqueur de surface cellulaire se traduira par des populations très enrichies de la majorité des fibroblastes du tissu, ce qui permet profilage de l'expression ou de la culture de cellules triées.

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Nous remercions le Dr Yitzhak Oschry et le Dr Orit Sagi-Asif pour leur aide avec le tri par FACS. Cette recherche a été financée par des subventions à NE du Programme de l'Union européenne septième programme-cadre (FP7/2007-2013) en vertu de l'accord de subvention n ° [276890], de l'Association israélienne contre le cancer (# 20110078) et du Fonds de recherche sur le cancer Israël (Recherche Prix ​​du développement de carrière).