Aislamiento de fibroblastos normales y el cáncer asociado-de los tejidos frescos por Clasificación células activadas por fluorescencia (FACS)

Cáncer de fibroblastos asociados (CAF) facilitar la iniciación del crecimiento del tumor y la progresión a través de señalización que promueve la proliferación, la angiogénesis y la inflamación. Aquí se describe un método para aislar poblaciones puras de los fibroblastos normales y CAFS de ratón fresco y tejidos humanos por clasificación de células, usando PDGFR como un marcador de superficie.

Asociados con el cáncer fibroblastos (CAF) son el tipo celular más importante en el estroma tumoral de muchos tipos de cáncer, en particular, carcinoma de mama, y su presencia prominente menudo está asociada con mal pronóstico ^1,2. CAFs son una subpoblación de fibroblastos estromales activados, muchas de las cuales expresan el marcador de miofibroblastos α-SMA ^3. CAF se originan a partir de los fibroblastos del tejido local, así como de derivados de médula ósea células reclutadas en el tumor en desarrollo y adoptar un fenotipo CAF bajo la influencia del microambiente del tumor ^4. CAF se muestra para facilitar la iniciación del crecimiento del tumor y la progresión a través de señalización que promueve la proliferación de células tumorales, angiogénesis, invasión y ^5-8. Hemos demostrado que la CAF estimular el crecimiento tumoral mediante la mediación de tumor que promueven la inflamación, a partir de las primeras etapas de pre-neoplásicas ^9. A pesar de la creciente evidencia de las CAF papel clave que desempeñar para facilitar el crecimiento del tumor,CAF estudian ha sido un reto en curso debido a la falta de marcadores específicos de CAF y la gran heterogeneidad de estas células, con muchos subtipos co-existentes en el microambiente tumoral ^10. Además, el estudio de fibroblastos in vitro se ve obstaculizada por el hecho de que su perfil de expresión de genes a menudo se altera en cultivo de tejidos ^11,12. Para abordar este problema y para permitir la expresión de genes de perfiles imparcial de fibroblastos de ratón fresco y tejidos humanos, hemos desarrollado un método basado en los protocolos anteriores para la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) ^13,14. Nuestro enfoque se basa en la utilización de PDGFR como un marcador de superficie para aislar fibroblastos de ratón fresco y el tejido humano. PDGFR se expresa abundantemente por ambos fibroblastos normales y cafés ^9,15. Este método permite el aislamiento de poblaciones puras de fibroblastos normales y cafés, incluyendo, pero no limitado a α-SMA + activado miofibroblastos. Fibroblastos aislados pueden entonces serutilizado para la caracterización y la comparación de la evolución de la expresión génica que se produce en los CAF durante la tumorigénesis. De hecho, nosotros y otros informaron de perfiles de expresión de los fibroblastos aislados por clasificación celular ^16. Este protocolo se realizó con éxito para aislar y crear un perfil poblaciones altamente enriquecidas de fibroblastos de tejidos de piel, páncreas mamaria, y pulmón. Además, este método también permite el cultivo de células clasificadas, con el fin de realizar los experimentos funcionales y para evitar la contaminación por las células tumorales, lo cual es a menudo un gran obstáculo cuando se trata de los CAF de cultivo.

1. La disección del tejido mamario o la piel de ratones

1. Antes de diseccionar el tejido deseado de los ratones, preparar los siguientes materiales y reactivos:

   Suministros:

   • Herramientas de cirugía (lavado con detergente y después se sumergieron en 70% de etanol).
   • Superficie de espuma de poliestireno para descansar el ratón durante la disección.
   • Alfileres o agujas para sujetar ratones durante la disección.
   • Tarro de cristal con tapa para la digestión, que contiene una barra de agitación magnética (autoclave).
   • Baño de agua a 37 ° C, que contiene un agitador magnético sumergible y agua suficiente para sumergir el frasco de digestión, mientras descansa sobre la placa de agitación.

   Reactivos:

   • Tampón FACS I: (4 ° C): Fosfato de Dulbecco salina tamponada con CMF (magnesio calcio libre) + 0,5% de BSA
   • Solución de colagenasa (hecha inmediatamente antes de su uso):
     0,05 g de colagenasa II
     0,05 g de colagenasa IV
     0,01 g Deoxyribonucarrendar
     20 ml tampón FACS I. Mantener la solución de colagenasa en hielo hasta su uso.
   • PharmLyse (Cloruro de Amonio Reactivo de Lisis).
   • Tampón FACS II: Fosfato de Dulbecco salina tamponada con CMF + 1% de FCS.
2. La disección de las glándulas mamarias (véase también ^17).
   • Eutanasiar ratones hembras que utilizan dióxido de carbono (CO ₂₎ inhalación.
   • En una superficie de espuma de poliestireno, coloque el ratón sobre la espalda y el pin con firmeza los cuatro miembros que utilizan agujas de calibre 25 (Figura 1A). Pulverizar el ratón generosamente con 70% de etanol.
   • Con unas pinzas, tire hacia arriba de la piel abdominal en la línea media y hacer una pequeña incisión con tijeras afiladas.
   • A partir de la incisión, corte la piel hasta el cuello del animal mientras que evita la perforación de las cavidades abdominales o torácicas.
   • Cortar la piel de las patas traseras de la incisión de línea media hacia la pierna, lo que resulta en una "forma de Y".
   • Tire de la piel lejos del mouse cuerpo y fijar abajo, exponiendo las glándulas mamarias unidos a la parte inferior de la piel (Figura 1B).
   • Utilizar Q-consejos para separar suavemente las glándulas mamarias de la piel durante el corte del tejido conjuntivo, con pequeñas tijeras afiladas para separar la glándula mamaria hacia la espina dorsal del ratón.
   • Las glándulas abdominales (# 4, 5) son los mejores para este protocolo. También puede utilizar la glándula mamaria 2 ^º, pero hay que tener en cuenta que estas glándulas están anatómicamente situado en las proximidades del músculo pectoral que pueden ser difíciles de separar, lo que resulta en células de origen del tejido mixto.
   • Nota: Cuando la disección de tejido tumoral, se recomienda eliminar regiones necróticas.
3. La disección de tejido de la piel: La forma más fácil de obtener tejido de la piel, sin tener que lidiar con la eliminación del vello es usar orejas de ratón. Si una mayor cantidad de tejido es necesario, puede afeitarse el pelo de ratón torso y diseccionar la piel.
   • Eutanasiar ratones ucantar inhalación de CO _2.
   • Usando unas tijeras afiladas, corte ambos oídos y el lugar inmediatamente en el tarro de digestión que contiene un volumen pequeño (~ 0,5 ml) de PBS en hielo.

2. Preparación de la glándula mamaria / piel suspensión de células individuales

• Coloque glándulas mamarias / piel en el tarro de digestión que contiene un pequeño volumen de PBS en hielo. Si el tejido es lavado con sangre x2 con PBS, y luego descartar el exceso de PBS.
• Pique a fondo con tijeras curvas.
• Añadir (nota: esta cantidad de solución de colagenasa de manera eficiente se disocian aproximadamente 5 g de tejido mamario o del tumor y las orejas de un máximo de 15 ratones) 20 ml de solución de colagenasa.
• Coloque inmediatamente en una placa de agitación a 37 ° C baño de agua, y se incuba durante 15 minutos mientras se agitaba a velocidad media.

Nota: Los tiempos óptimos de incubación puede variar si la digestión de otros tejidos.

• Para detener la reacción, agregar 30 ml de DMEM frío + 10% FCS.
• Filtrar la mezcla de tejido / medios de comunicación a través de un filtro de 70 micras celda colocada en la parte superior de un tubo cónico de 50 ml.
• Centrifugar el tubo cónico durante 5 min a 450 xg, a 4 ° C.

3. Lisis de los glóbulos rojos

Nota: este paso no es necesario si los ratones eran de corazón perfundido con PBS antes de ser sacrificado.

• Aspirar el sobrenadante utilizando una pipeta de vidrio unido a vacío, sin alterar el sedimento celular.
• Para lisar RBC, se resuspende el sedimento celular en 10 ml de solución PharmLyse e incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
• Neutralizar la solución PharmLyse añadiendo aproximadamente 40 ml de tampón FACS I.
• Girar el tubo cónico con las células durante 5 min a 450 xg, a 4 ° C.
• Aspirar el sobrenadante

4. El bloqueo de Fc Endógeno

• Opcional: contar las células para determinar el volumen adecuado para la siguiente steps.
• Resuspender las células en 1.3 ml de tampón FACS I (según el número de células y la cantidad de anticuerpos que desea utilizar).
• Añadir FcBlock (anti-ratón CD16/CD32) para alcanzar una dilución 1:50 (10 mg / ml), e incubar en hielo durante 10-20 '.
  No hay necesidad de lavar FcBlock.

5. La tinción

• Sacar 100 ml de alícuotas a tubos eppendorf que se utilizó como control un-manchado y controles individuales de color (de acuerdo con el número de anticuerpos fluorescentes utilizados).
• Para fibroblastos etiqueta: añadir anti-PDGFR (directamente conjugado con fluoróforo) a una dilución de 1:50 (10 mg / ml).
• Para etiquetar las otras poblaciones de células (por ejemplo células del sistema inmune, macrófagos, células endoteliales, etc): añadir apropiados anticuerpos conjugados con fluorescencia para marcadores de superficie, a una dilución de 1:50.

Nota: aunque PDGFR es un marcador robusto para los fibroblastos, se recomienda incluir anticuerpos para icélulas mmune y de células epiteliales con el fin de excluir cualquier poblaciones positivas dobles y por lo tanto mejorar la pureza de los fibroblastos aislados.

• Añadir 2 l de cada anticuerpo para cada uno de los individuales de control de color tubos eppendorf.
• Se incuban las células con anticuerpos de 1 hora en hielo en la oscuridad.
• Para lavar: llenar los tubos con tampón FACS I y girar durante 5 minutos a 450 xga 4 ° C.
• Aspirar el sobrenadante, resuspender las células en tampón FACS I a una concentración de aproximadamente 2 x 10 ⁶ células / ml, o cualquier concentración más adecuada para la clasificación con su clasificador FACS disponible.

Opcional: Las células pueden ser resuspendidas en tampón FACS II para la duración de la clasificación. Esto puede mejorar la viabilidad celular. Sin embargo, la exposición a factores en suero pueden tener una expresión génica efecto, que debe ser probado, y tenerse en cuenta.

• Transfiera las células marcadas en tubos FACS con filtro superior: filtros de células en los tubos paraevitar los agregados celulares.
• Para excluir las células muertas, añadir 7AAD (0,5 g / ml) o yoduro de propidio (PI) para muestras (excepto para el control sin manchas).

Nota: Para evitar la pérdida de las células, usted puede agregar 7AAD/PI a la muestra sin manchas después de grabar en el FACS, y utilizar de nuevo como 7AAD de sólo control.

• Mantener las muestras en hielo durante el análisis.

6. Aislamiento de células por FACS

(Nota: esta parte del protocolo requiere conocimientos previos en el funcionamiento de un clasificador FACS, por ejemplo, BD FACS AriaII, o la ayuda de un técnico especializado).

• Utilizando el software clasificador FACS (BD FACSDiva), preparar parcelas de análisis adecuados para analizar dispersión frontal (FSC), dispersión lateral (SSC), 7AAD, FITC, PE y cualquier otro fluoróforo utilizado para marcar células (Figura 2).
• Antes de cargar cada muestra para el clasificador de células, vórtice brevemente para resuspender las células.
• Comience por analiING la muestra sin manchar con el fin de establecer la activación periódica de la población total de células, a la puerta de salida restos de células, y para determinar la autofluorescencia o la tinción de fondo.
• Analizar la muestra sin teñir + 7AAD para determinar y puerta de la población de células vivas de la población celular total.
• Analizar cada control de un solo color para determinar y calibrar los parámetros tales como la compensación.
• Analizar la muestra teñida para definir la posición de las puertas para la clasificación.
• Una vez que los parámetros y las puertas para las poblaciones de células deseadas se han establecido, empezar a clasificar las poblaciones celulares marcadas en tubos eppendorf o tubos de 15 ml cónicos que contienen medio de cultivo o tampón de lisis de ARN (por ejemplo, tampón RLT o Trizol).

Nota: Si la clasificación de un gran número de células, no se recomienda para ordenar directamente en tampón de lisis de ARN, como el gran volumen de fluido de vaina que acompaña a las células, se diluirá el tampón de lisis y reducen el rendimiento.

• Spin celdas hacia abajo inmediatamente después de su clasificación ha terminado, y la transferencia a un medio fresco o tampón de lisis de ARN, dependiendo del propósito de su experimento.
• Si la clasificación con el fin de cultivar células aisladas, realice clase estéril. Para una mejor recuperación de las células, el uso de rojo fenol libre de DMEM + 5% de FCS en lugar de tampón FACS II y recoger las células en medio de cultivo con FCS al 20%.
• Si el cultivo de fibroblastos ordenados, alwaysplate en placas recubiertas de colágeno y nunca directamente sobre plástico, ya que resulta en la activación de fibroblastos que producen cambios en su expresión génica.

Uso de PDGFR como un marcador para los resultados de fibroblastos en el aislamiento de poblaciones altamente enriquecidas de los fibroblastos del tejido. El nivel de pureza después de la clasificación fue del 99%, cuantificada por análisis post-especie (Figura 2A). Estimando el porcentaje de contaminación de las células de fibroblastos no por la expresión relativa de los genes de control específicos de la célula (Figura 2B) muestra típicamente 0.1-0.6% de contaminación. Este nivel de pureza permite perfiles de alta calidad transcriptoma de fibroblastos aislados ^9.

En las glándulas mamarias, el porcentaje de fibroblastos en el tejido varía entre 5-20% en tejido mamario normal, y 1-5% en MMTV-PYMT tumores. El porcentaje relativo de los fibroblastos en el tejido tumoral es menor que en pre-neoplásicas tejido, a pesar del incremento en el número total de fibroblastos, debido a la expansión masiva de el compartimiento epitelial. El% reducido de fibroblastos aislados de tejido tumoral también es el resultado deañadido la dificultad técnica y la disminución de la eficiencia de clasificación de células de un tejido altamente necrótico.

Fibroblastos aislados pueden ser cultivados directamente después de la clasificación, pero puede requerir varios días de recuperación (Figura 2D). Es esencial para llevar a cabo todos los experimentos con células de paso bajo, como fibroblastos primarios experimentan senescencia durante la propagación en cultivo.

Figura 1. La purificación de los fibroblastos de frescas glándulas mamarias. A-FVB / n / PYMT ratón. B-Expuesto glándulas mamarias. C-Fresh glándulas mamarias fueron disecados de FVB / n / PYMT ratones y se digirieron con colagenasa a una suspensión de células individuales. Las células fueron inmuno-marcadas con anticuerpos para marcadores de fibroblastos superficie (PDGFR) y mamarcador crophages superficie (F4/80) seguido de la separación por FACS. Ordenado fibroblastos se cultivaron o zadas para la purificación del RNA. Haga clic aquí para ampliar la cifra .

Figura 2. Perfilado de fibroblastos ordenados. A-simples suspensiones de células de glándulas mamarias de ratón se tiñeron con anticuerpos F4/80 PDGFRαand. Parcela FACS clasificación se muestra (panel izquierdo). P2 es la puerta de fibroblastos (PDGFR + células) y P4 es la puerta de macrófagos (F4/80 + células). Un análisis tipo poste se realizó para determinar la pureza de los fibroblastos y macrófagos (según paneles central y derecho). B-Análisis de la pureza de clasificación de QRT-PCR de genes de control específicos de la célula para fibroblast (PDGFR, Col-1α), células inmunes (CD45, CSF-1R) y células epiteliales (E-cadherina). Los resultados se normalizaron a dos genes (GAPDH mantenimiento de la casa y GMSI). En relación con la expresión de GAPDH se muestra. C-Cuantificación de la expresión PDGFR en la población total de los fibroblastos sin clasificar mamarias. D-cultivo de fibroblastos del tejido ordenados. Haga clic aquí para ampliar la cifra .

Mientras que los experimentos realizados en cultivo de tejidos puede ser informativo y sugieren principios funcionales que se pueden verificar in vivo, se sabe que ocurren grandes cambios en la expresión génica de las células en cultivo ^11,12. Con el fin de evitar una etapa de cultivo de tejidos cuando el perfil de expresión de genes en fibroblastos, hemos desarrollado un protocolo que permite el aislamiento de normales, así como los asociados al cáncer de fibroblastos de ratón fresco o tejido humano. Este protocolo se aplicó con éxito con los tejidos de piel, páncreas y mama de ratón y de humano ^9. Aislamiento de fibroblastos por clasificación FACS requiere un marcador de superficie que los fibroblastos etiquetas. Hemos establecido que PDGFR es un marcador de superficie sólida que permite el aislamiento de poblaciones altamente enriquecidas de fibroblastos ^9. Además, PDGFR se expresa en ambos fibroblastos de tejido normal y en los CAF, permitiendo así el aislamiento imparcial y perfiles de los fibroblastos del tejido en lugar de focusing en una subpoblación específica.

Los fibroblastos son una población celular heterogénea en cuanto a la expresión de moléculas marcadoras así como en su origen y las propiedades de señalización ^8,10,18. Mientras PDGFR es un marcador de superficie robusta para los fibroblastos, que no etiqueta 100% de los fibroblastos en todos los tejidos resultantes en una subpoblación de células sin marcar, en función del tipo de tejido. En la piel, aproximadamente el 90% de los fibroblastos son PDGFR + (no se muestra), mientras que en las glándulas mamarias aproximadamente 85% de los fibroblastos del tejido totales son PDGFR + (Figura 2C). El porcentaje de fibroblastos que expresan PDGFR puede variar en otros tipos de tejidos, y necesita ser definida para cada tejido. Sin embargo, en la piel y en las glándulas mamarias, utilizando PDGFR como un marcador de superficie celular se traducirá en poblaciones altamente enriquecidas de la mayoría de los fibroblastos del tejido, lo que permite la expresión de perfiles o el cultivo de células clasificadas.

No hay conflictos de interés declarado.

Agradecemos al Dr. Itzjak Oschry y el Dr. Orit Sagi-Asif, por su ayuda con la clasificación de FACS. Esta investigación fue apoyada por las subvenciones a NE del Programa Europeo sobre el Séptimo Programa Marco de la Unión (FP7/2007-2013) en el marco del acuerdo de subvención n º [276890], de la Asociación de Cáncer de Israel (# 20110078), y de la Israel Cancer Research Fund (Investigación Career Development Award).