형광 활성 세포 정렬 (FACS)에 의해 신선한 조직으로부터 정상 및 암 관련 섬유 아세포의 분리

암 관련의 섬유 아세포 (CAFs)는 확산, 혈관 신생 및 염증을 조장하는 신호를 통해 종양 개시, 성장과 진행을 촉진한다. 여기 우리는 표면 마커로 PDGFRα를 사용하여 셀 정렬에 의해 신선한 마우스와 인간의 조직에서 정상 섬유 아세포와 CAFs의 순수한 인구를 분리하는 방법을 설명합니다.

암 관련 섬유 아세포은 (CAFs) 특히 유방 암에, 많은 암의 종양 기질 내에서 가장 눈에 띄는 세포 유형으로, 그들의 눈에 잘 띄는 존재는 종종 가난한 예후 (豫后)의 ^1,2와 연결되어 있습니다. CAFs는 stromal 섬유 아세포의 활성화 subpopulation 있으며, 그 중 많은 myofibroblast 표시 α-SMA ³ 표현한다. CAFs 지역 조직 섬유 아세포에서뿐만 아니라 골수 유래 세포 개발 종양으로 모집하고 종양 microenvironment ^(4)의 영향 아래 CAF의 표현형을 채택에서 유래. CAFs는 종양 세포 증식, 혈관 신생, 그리고 침략 ^5-8을 조장하는 신호를 통해 ​​종양 개시, 성장과 진행을 촉진하기 게재되었습니다. 우리는 CAFs는 초기 사전 neoplastic 단계 ^9시 시작, 종양 - 홍보 염증을 중재하여 종양 성장을 향상 것을 보여 주었다. 키 역할 CAFs의 증가에도 불구하고 증거가 종양 성장을 촉진에서 재생공부 CAFs은 종양 microenvironment ¹⁰ 공동 기존의 여러 하위 유형이있는 CAF 특정 마커 및 이들 세포의 광대 한 이질성의 부족으로 인해 지속적 도전했다. 또한, 체외에서 섬유 아세포를 공부하는 것은 자신의 유전자 발현 프로파일은 종종 조직 배양 ^11,12에서 변경 있다는 사실에 의해 방해된다. 이 문제를 해결하기 위해 신선한 마우스와 인간의 조직에서 섬유 아세포의 편견 유전자 발현 프로파일을 허용하기 위해 형광 활성화 셀 정렬 (FACS) ^13,14의 이전 프로토콜을 기반으로하는 방법을 개발했습니다. 우리 접근 방식은 신선한 마우스와 인간의 조직에서 섬유 아세포를 분리 할 수​​있는 표면 마커로 PDGFRα을 사용에 의존하고 있습니다. PDGFRα이 넘치게 일반적인 섬유 아세포와 CAFs ^9,15 모두에 의해 표시됩니다. 이 방법은 등의 일반적인 섬유 아세포와 CAFs의 순수한 인구,의 고립하지만이 α-SMA으로 제한 할 수 있습니다 + myofibroblasts을 활성화. 절연 섬유 아세포는 할 수 있습니다특성화 및 tumorigenesis 동안 CAFs에서 발생하는 유전자 발현의 진화 비교에 사용됩니다. 사실, 우리와 다른 사람들은 ¹⁶ 정렬 세포에 의해 고립 된 섬유 아세포의 표현 프로파일을 발표했다. 이 프로토콜이 성공적으로 피부, 유방, 췌장과 폐 조직에서 섬유 아세포의 매우 풍부한 인구를 분리 및 프로필하기 위해 수행되었다. 또한, 우리의 방법은 작동 실험을 수행하는 문화 CAFs하려고 할 때 종종 큰 장애물입니다 종양 세포에 의한 오염을 방지하기 위해, 정렬 세포의 배양 할 수 있습니다.

1. 마우스에서 유방이나 피부 조직을 박리

1. 마우스에서 원하는 조직을 해부하기 전에 다음과 같은 용품 및 시약을 준비 :

   공급 :

   • 수술 도구 (세제로 세척 한 후 70 % 에탄올에 담근).
   • 스티로폼 표면은 절개 중에에 마우스를 말이다.
   • 핀이나 바늘은 절개 중에 쥐를 개최합니다.
   • 자기 저어 바 (autoclaved)를 포함하는 소화 뚜껑 유리 항아리.
   • 37 번 물을 욕조 ° C, 저어 판에 쉬고있는 동안, 잠수함 자기 교반기와 잠수함 소화 병을 할 수있을만큼 물을 포함.

   시약 :

   • FACS 버퍼 I : (4 ° C) : Dulbecco의 인산이 (칼슘 마그네슘 무료) 식염 CMF 버퍼 + 0.5 % BSA
   • Collagenase 솔루션 (바로 사용하기 전에 한) :
     0.05 g Collagenase II
     0.05 g Collagenase IV
     0.01 g의 Deoxyribonuclease
     20ML FACS 버퍼 I.는 사용까지 얼음에 collagenase 솔루션을하세요.
   • PharmLyse (염화 암모늄의 Lysing 시약).
   • FACS 버퍼 II : Dulbecco의 인산이 식염 CMF 버퍼 + 1% FCS합니다.
2. 유방 땀샘의 해부 (또한 ^{17 참조).}
   • 이산화탄소 (CO ₂₎ 흡입을 사용하여 여성의 쥐를 안락사시켜야.
   • 스티로폼 표면에서의 뒷면에 마우스를 놓고 단단히 25 게이지 바늘 (그림 1A)를 사용하여 사지를 핀. 70 %의 에탄올과 넉넉한 마우스를 스프레이.
   • 집게를 사용하여 중간 선에서 복부 피부를 당겨와 날카로운 가위로 작은 절개를합니다.
   • 복부 나 가슴 충치를 펑 쳐링 피하는 동안 절개부터, 동물의 목에 피부를 잘라.
   • "Y 모양"의 ​​결과로, 다리에 대한 중간 선 절개의 후면 다리에 피부를 잘라.
   • 마우스 몸에서 떨어진 피부를 당겨 아래로 핀, 노출유방 땀샘은 피부의 아래쪽 (그림 1B)에 부착.
   • 마우스의 척추를 향해 유선을 분리하는 작은 날카로운 가위로 결합하는 조직을 절단하면서 부드럽게 피부의 유방 땀샘을 분리하는 Q-팁을 사용하십시오.
   • 복부 분비 (# 4, 5)이 프로토콜에 가장입니다. 당신은 또한 2 ^차 유선을 사용하지만, 이러한 분비는 해부학 적 혼합 조직 출신 세포의 결과로, 별도의하기 어려운 경우도 있습니다 pectoralis 근육 가까이에있는 것을 명심 수 있습니다.
   • 참고 : 종양 조직을 해부 할 때,이 괴사 영역을 제거하는 것이 좋습니다.
3. 피부 조직의 해부 : 머리 제거 처리 할 필요없이, 피부 조직을 취득하는 가장 쉬운 방법은 마우스 귀를 사용하는 것입니다. 조직의 큰 금액이 필요한 경우, 당신은 마우스 몸에서 머리를 면도하고 피부를 해부 할 수 있습니다.
   • CO ₂ 흡입을 사용하여 쥐를 안락사시켜야.
   • 날카로운 가위를 사용하여 얼음에 PBS의 작은 볼륨 (~ 0.5 ML)를 포함하는 소화 병에 즉시 귀 및 장소를 모두 잘라.

2. 유선 / 피부 단일 세포 현탁액의 준비

• 유방 땀샘 / 얼음 PBS의 작은 볼륨을 포함하는 소화 병의 피부를 놓습니다. 조직 한 다음 PBS로 세척을 피 X2이며, 경우 초과 PBS를 폐기하십시오.
• 곡선 가위로 철저하게 이기다.
• 20 ML의 collagenase 솔루션 (참고 : collagenase 솔루션의 양이 효율적으로 15 쥐 최대의 유방이나 종양 조직과 귀를 약 5g을 떼어 놓다 것)을 추가합니다.
• 37 판을 저어에 즉시 배치 ° 15 분에 C 물 욕조 및 품다 중간 속도로 교반하면서.

참고 : 다른 조직을 소화하는 경우 최적의 배양 시간이 다를 수 있습니다.

• 반응을 중지하려면, 30 ML 차가운 DMEM + 10% FCS를 추가합니다.
• 조직 / 미디어 혼합을 통해서 스트레인헥타르 70 μm 전지 스트레이너는 50 ML 원뿔 튜브의 상단에 위치.
• 4에 450 XG에서 5 분의 원추형 튜브를 원심 분리기 ° C.

3. 적혈구의 용해

참고 :이 희생되기 전에 쥐가 PBS로 마음 perfused 있다면이 단계가 필요하지 않습니다.

• 세포 펠렛을 방해하지 않으면 서, 진공에 부착 된 유리 피펫을 사용하여 표면에 뜨는을 대기음.
• 상온에서 5 분 10 ML의 PharmLyse 솔루션과 배양에 RBC, resuspend 세포 펠렛을 lyse합니다.
• FACS 버퍼 I.의 약 40 ML을 추가하여 PharmLyse 솔루션을 중화
• 4 ° C.에서 450 XG에서 5 분을위한 세포와​​ 원뿔 튜브를 스핀
• 표면에 뜨는을 대기음.

4. 내생 FC의 차단

• 선택 사항 : 다음 단계에 해당하는 양을 결정하는 셀 수.
• 1-3 ML FACS 버퍼 I에 Resuspend 세포 (O를 따라사용하려는 N 셀 번호 및 항체의 양).
• 1시 50분 희석 (10 μg / ML)에 도달하고, 10-20 '을 얼음에 품다 할 FcBlock (안티 - 마우스 CD16/CD32)를 추가합니다.
  아니오 FcBlock 씻어 필요가 없습니다.

5. 더럽히는 것

• 해제 - 스테인드 제어 및 단일 색상 컨트롤 (사용 형광 항체의 수에 따라)으로 사용할 eppendorf 튜브에 100 μl aliquots을보십시오.
• 라벨 섬유 아세포로 : 1시 50분의 희석 (10 μg / ML)에 (형광에 직접 복합) 방지 PDGFRα를 추가합니다.
• 다른 세포 집단 (예를 들면 면역 세포, 대 식세포, 내피 세포 등) 라벨 : 1시 50분 희석에, 표면 마커에 적절한 휘황 복합 항체를 추가합니다.

참고 : PDGFRα는 섬유 아세포에 대한 강력한 마커이지만, 그것은 어떤 이중 긍정적를 제외하기 위해 면역 세포와 상피 세포에 대한 항체를 포함하는 것이 좋습니다인구 및 따라서는 고립 된 섬유 아세포의 순도를 향상시킬 수 있습니다.

• 단일 색상 제어 eppendorf 튜브의 각 각 항체의 2 μl를 추가합니다.
• 어둠 속에서 얼음에 1 시간에 대한 항체와 세포를 배양.
• 세탁 방법은 다음과 같습니다 FACS 버퍼 I와 튜브를 작성하여 4 ° C.에서 450 XG에서 5 분에 스핀
• 약 2 X 10 ⁶ 세포 / ML, 또는 중 사용 가능한 FACS의 정렬과 정렬을위한 가장 적합한 농도의 농도에 I를 버퍼링 FACS에 표면에 뜨는, resuspend 세포를 대기음.

선택 사항 : 셀이 분류의 기간 동안 FACS 버퍼 II에 resuspended 될 수 있습니다. 이 세포 생존 능력을 향상시킬 수 있습니다. 그러나, 혈청의 요인에 노출, 테스트 및 고려해야 효과 유전자 발현을 할 수 있습니다.

• 셀 clumps을 방지하기 위해 튜브에 필터 셀 : 필터 상단으로 FACS 튜브에 표시된 셀을 전송합니다.
• 죽은 세포를 제외하려면 7AAD을 (0.5 μg / ML) 추가 또는 형샘플에 idium의 요오드화물 (PI) (을 취소 스테인드 제어 제외).

참고 : 셀을 낭비하지 않도록하려면 FACS에 기록 후 해제 - 스테인드 샘플에 7AAD/PI을 추가하고 7AAD 전용 컨트롤로 다시 사용할 수 있습니다.

• 분석하는 동안 얼음에 샘플을 보관.

6. FACS에 의한 세포의 분리

(참고 : 프로토콜의이 부분은 ​​FACS의 정렬, 예를 들어 BD FACS AriaII, 또는 숙련 된 기술자의 도움을 운영에 이전 지식을 필요).

• FACS 정렬 소프트웨어 (BD ​​FACSDiva)를 사용, 앞으로 분산 (FSC), 측면 분산 (SSC), 7AAD, FITC, PE 및 레이블 셀 (그림 2)에 사용되는 다른 형광을 분석하기 위해 적절한 분석 음모를 준비합니다.
• 셀 정렬 각 샘플을로드하기 전에 소용돌이가 간단히 세포를 resuspend합니다.
• cel에서 게이트로, 총 세포 인구의 게이팅을 설정하기 위해 흠없는 샘플을 분석하여 시작난 파편, 그리고 autofluorescence이나 배경 착색을 결정합니다.
• 전체 세포 인구에서 라이브 세포의 인구를 결정하고 게이트 흠없는 샘플 + 7AAD를 분석합니다.
• 이러한 보상 등의 매개 변수를 결정하고 보정 각 단일 색상 제어를 분석합니다.
• 정렬 게이트의 위치를​​ 정의하기 위해 스테인드 샘플을 분석합니다.
• 일단 원하는 세포 인구에 대한 매개 변수 및 문이 설정되었으며, eppendorf 튜브 나 문화 매체 또는 RNA의 용해 버퍼를 (예 : RLT 버퍼 또는 Trizol 등)가 포함 된 15 ML 원뿔 튜브에 표시된 셀 인구 정렬 시작합니다.

참고 : 셀의 많은 정렬하는 경우가 세포 용해 버퍼를 희석하고 수율을 줄일 수 있습니다 동반 피복 유체의 큰 볼륨으로, RNA의 용해 버퍼에 직접 정렬하는 것은 권장하지 않습니다.

• 신선한 중간이나 RNA의 용해 버퍼 드에 정렬이 완료 된 후 다운 즉시 세포를 회전 및 이동실험의 목적에 대기 중입니다.
• 문화 절연 셀에 순서대로 정렬하면 멸균 정렬을 수행합니다. 세포의 더 나은 복구를 들어, 페놀 레드 무료 DMEM + 5퍼센트 FCS 대신 FACS 버퍼 II를 사용하여 20 % FCS와 문화 매체에 세포를 수집합니다.
• 배양은 섬유 아세포를 정렬하면 자신의 유전자 표현의 변화로 이어지는 섬유 아세포의 활성화에이 결과로 플라스틱 콜라겐 코팅 접시에 alwaysplate 결코 직접적으로.

조직 섬유 아세포의 높은 풍부한 인구의 고립 된 섬유 아세포 결과의 표시로 PDGFRα을 사용합니다. 정렬 후 순도의 수준은 후 정렬 분석 (그림 2A)에 의해 정량 99 %이다. 셀 - 특정 제어 유전자의 상대적 표현 (그림 2B)에 의해 비 섬유 아세포 세포를 오염 수의 비율을 추정하는 것은 일반적으로 0.1-0.6 %의 오염을 보여줍니다. 순도 수준은 절연 섬유 아세포 ⁹ 고품질의 transcriptome 프로파일 할 수 있습니다.

유방 땀샘에서 조직의 섬유 아세포의 비율은 정상 유방 조직에서 5-20%, 그리고 MMTV-PyMT 종양의 1-5% 사이에 다릅니다. 종양 조직에서 섬유 아세포의 상대적 비율은 상피 구획의 대규모 확장으로 인해 섬유 아세포의 총 수 증가에도 불구하고, 사전 neoplastic 조직에 비해 낮습니다. 종양 조직에서 분리 섬유 아세포의 감소 %도의 결과입니다기술적 어려움을 추가하고 매우 괴사 조직에서 세포 정렬의 효율성을 감소.

절연 섬유 아세포는 정렬 후 직접 배양 할 수 있지만, 며칠 (그림 2D) 복구해야 할 수 있습니다. 주요 섬유 아세포는 문화의 전파하는 동안 노화를 받아야로 낮은 통로 세포, 모든 추가 실험을 수행 할 필수적입니다.

1 그림. 신선한 유방 땀샘에서 섬유 아세포의 정화. A-FVB / N / PyMT 마우스. 유방 땀샘을 B-이라. C-신선한 유방 땀샘이 FVB / N / PyMT 마우스에서 해부하고 단일 세포 현탁액에 collagenase를 소화했다. 셀 섬유 아세포 표면 마커 (PDGFRα) 및 mA에 대한 항체와 면역 - 라벨이 붙지 만crophages 표면 마커 (F4/80)는 FACS로 분리 한 다음. 정렬 섬유 아세포는 어느 배양 또는 RNA 정화에 lysed되었습니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 2. 정렬 섬유 아세포의 프로파일. 마우스 유방 땀샘의 A-싱글 셀 중지는 PDGFRαand F4/80 항체 물들했다. FACS 정렬 음모가 (왼쪽 패널) 표시됩니다. P2는 섬유 아세포 게이트 (PDGFRα + 세포)이며, P4는 대 식세포 게이트 (F4/80 + 세포)입니다. 게시물 정렬 분석 정렬 섬유 아세포와 대 식세포 (가운데 및 오른쪽 패널)의 순도를 결정하기 위해 수행되었다. fibrobla에 대한 세포 특정 제어 유전자의 qRT-PCR에 의한 분류 순도 B-분석성 (PDGFRα, 콜-1α), 면역 세포 (CD45, CSF-1R)과 상피 세포 (E-cadherin). 결과는 두 집 보관 유전자 (GAPDH와 mGUS)로 표준화되었다. GAPDH에 상대적으로 표현이 표시됩니다. 유방 섬유 아세포의 총 정렬되지 않은 인구 PDGFRα 표현의 C-정량화. 정렬 섬유 아세포의 D-조직 문화. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

조직 문화에 실험을 유익하게 생체에서 확인 할 수 있습니다 기능 원리를 제안 할 수 있지만, 그것은 문화 ^11,12의 세포의 유전자 발현에 큰 변화가 발생하는 것으로 알려져 있습니다. 섬유 아세포의 유전자 발현 프로파일 링 할 때 조직 문화 단계를 피하기 위해, 우리는 할 수 있습니다 신선한 마우스 또는 인체 조직의 정상뿐만 아니라 암 관련 섬유 아세포의 분리.에게 프로토콜을 개발 이 프로토콜이 성공적으로 마우스와 인간 ^{9 일부터} 피부, 췌장 및 유방 조직에 적용되었습니다. FACS 정렬에 의한 섬유 아세포의 절연은 표면 마커 라벨의 섬유 아세포가 필요합니다. 우리는 PDGFRα는 섬유 아세포 ⁹ 매우 풍부한 인구의 절연을 수있는 강력한 표면 마커입니다 설립했다. 또한, PDGFRα 따라서 편견 절연 및 프로파일 조직 섬유 아세포의보다 focusi을 허용, 일반 조직 섬유 아세포 모두와 CAFs에 표시됩니다특정 subpopulation에 NG.

섬유 아세포는 마커 분자의 표현에 관해서는뿐만 아니라 자신의 출발지와 신호 특성 ^8,10,18의 이기종 셀 인구입니다. PDGFRα는 섬유 아세포에 대한 강력한 표면 마커이지만, 그것은 조직 유형에 따라 세포의 라벨이없는 subpopulation의 결과로 모든 조직에서 섬유 아세포의 100 %에 라벨을하지 않습니다. 유방 땀샘에서 총 조직 섬유 아세포의 약 85 %가 PDGFRα + (그림 2C)하는 동안 피부에 섬유 아세포의 약 90 % (미도시)에 PDGFRα +입니다. PDGFRα 표현 섬유 아세포의 비율은 다른 조직 유형에 따라 다양하며 각 조직에 대해 정의해야 할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 피부와 유방 땀샘에서 세포 표면 마커로 PDGFRα을 활용하면 정렬 세포의 표현 프로파일 또는 배양을 허용, 조직 섬유 아세포의 대부분의 매우 풍부한 인구가 발생합니다.

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

우리는 FACS 정렬과의 도움을 박사 Yitzchak Oschry 박사 Orit Sagi - Asif 감사드립니다. 이 연구는 보조금 협정 N 아래에있는 유럽 연합 (EU) 세븐 프레임 워크 프로그램 (FP7/2007-2013)에서 NE에 대한 교부금에 의해 지원되었다 ° [276890] 이스라엘 암 협회 (# 20110078)에서와 이스라엘 암 연구 기금 (연구에서 경력 개발 상).