蛍光活性化細胞選別（FACS）によって新鮮な組織からの正常および癌関連線維芽細胞の分離

癌関連線維芽細胞（CAFS）は増殖、血管新生、炎症を促進し、そのシグナル伝達を介して腫瘍の開始、成長と進行を容易にします。ここでは、表面マーカーとしてPDGFRαを使用して、細胞選別により新鮮なマウスおよびヒト組織由来正常線維芽細胞とCAFSの純粋な集団を単離するための方法を説明します。

癌関連線維芽細胞（CAFS）は、特定の乳癌では、多くの癌の腫瘍間質内で最も顕著な細胞型であり、その卓越した存在は、しばしば予後不良の^1,2に関連付けられています。 CAFSは、間質の線維芽細胞の活性化亜集団であり、それらの多くは筋線維芽細胞マーカーのα-SMA ^3を発現^している 。 CAFSは、地元組織の線維芽細胞からだけでなく、骨髄由来細胞から由来する腫瘍の開発に採用され、腫瘍微小環境⁴の影響下にCAFの表現型を採用しています。 CAFSは、腫瘍細胞増殖、血管新生、および浸潤^5-8を促進し、そのシグナル伝達を介して腫瘍の開始、成長と進行を促進することが示された。我々は、CAFSは早く前腫瘍段階⁹時から、腫瘍促進炎症を介在することによって腫瘍の成長を高めることが実証された。腫瘍の成長を促進する上で重要な役割をCAFSプレイの増加する証拠にもかかわらず、勉強CAFSは、CAF-特異的なマーカーと腫瘍微小環境¹⁰に共存する多くのサブタイプを持つこれらの細胞の広大な異質性の欠如のために継続的な課題となっている。また、in vitroで線維芽細胞を研究し、それらの遺伝子発現プロファイルはしばしば組織培養^11,12で変更されているという事実によって妨げられる。この問題に対処するために、新鮮なマウスおよびヒト組織からの線維芽細胞の公平な遺伝子発現プロファイリングを可能にするために、我々は、蛍光活性化細胞ソーティング^{（FACS）13,14}は、前のプロトコルに基づいた方法を開発した。我々のアプローチは新鮮なマウスおよびヒト組織から線維芽細胞を単離するための表面マーカーとしてPDGFRαを利用に依存しています。 PDGFRαは豊富正常線維芽細胞およびCAFS ^9,15両方で表される。このメソッドは、正常線維芽細胞およびCAFSの純粋な集団の単離を可能に含むが、α-SMA +活性化筋線維芽細胞に限定されません。隔離された線維芽細胞は、その後することができます特性評価および腫瘍形成時にCAFSで発生し遺伝子発現の進化の比較のために使用される。実際、我々と他の人は^16を細胞選別によって単離された線維芽細胞の発現プロファイリングを報告した。このプロトコルは正常皮膚、乳腺、膵臓、肺組織からの線維芽細胞の高度に濃縮された集団を分離し、プロファイリングを行った。また、我々の手法は、機能の実験を行うため、しばしば文化CAFSしようと、大きな障害となっている腫瘍細胞による汚染を避けるために、選別された細胞を培養することができます。

1。マウスから乳腺や皮膚組織を解剖する

1. マウスから所望の組織を切開する前に、次の消耗品と試薬を準備します。

   備品：

   • 手術ツール（洗剤で洗浄した後、70％エタノールに浸漬）。
   • 発泡スチロールの表面には、解剖時にマウスを休ませる。
   • 解剖時にマウスを保持するためにピンや針。
   • 磁気攪拌棒（オートクレーブ）を含む消化のために蓋付きのガラスの瓶、。
   • 37℃水浴℃、撹拌プレート上で休んでいる間、潜水マグネチックスターラーと水没消化jarをするのに十分な水を含む。

   試薬：

   • FACS緩衝液I：（4℃）：ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水、CMF（カルシウムマグネシウム無料）+0.5％BSAをバッファ
   • コラゲナーゼ溶液（使用直前に作られる）：
     0.05グラムコラゲナーゼII
     0.05グラムコラゲナーゼIV
     0.01グラムのデオキシリボヌクレアーゼ
     20ミリリットルFACS緩衝液Iを使用するまで氷上でコラゲナーゼ溶液を保管してください。
   • PharmLyse（塩化アンモニウムの溶解試薬）。
   • FACS緩衝液II：ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水、CMF + 1％FCSをバッファ。
2. 乳腺の解剖 （また^、17を参照）。
   • 二酸化炭素（CO _2）の吸入を使ってメスのマウスを安楽死させる。
   • 発泡スチロールの表面に、その背中の上にマウスを置き、しっかりと25ゲージ針（ 図1A）を使用して、すべての四肢をピン。 70％エタノールで寛大にマウスを吹き付けます。
   • ピンセットを用いて、正中線で腹部の皮膚を引き上げて、鋭いハサミで小さな切開を加える。
   • 腹部または胸部の空洞に穴をあけることを回避しながら切開から始まり、動物の首に皮膚をカット。
   • "Y字"で、その結果、足に向かって正中切開から後脚の皮膚を切り取ります。
   • マウス本体から離れて皮を引き、突き止める、露光乳腺は皮膚の下側（ 図1B）に接続されている。
   • マウスの背に向かって乳腺を区切るには小さな鋭いハサミで結合組織を切断するときに優しく、皮膚から乳腺を区切るには綿棒を使用しています。
   • 腹部腺（＃4、5）はこのプロトコルのために最適です。また、第2 ^回乳腺を使用していますが、これらの腺は、解剖学的に混合した組織由来の細胞で、その結果、分離するのは難しいかもしれません胸筋に近接して配置されていることを念頭に置くことができます。
   • 注：腫瘍組織を切開する際には、壊死領域を削除することを推奨します。
3. 皮膚組織の解剖：脱毛に対処することなく、皮膚組織を取得する最も簡単な方法は、マウスの耳を使用することです。組織の大規模な量が必要な場合は、マウスの胴体から毛を剃ると肌を分析することができます。
   • CO ₂吸入を使用してマウスを安楽死させる。
   • 鋭いはさみを使用して、氷の上でのPBS少量（〜0.5ミリリットル）を含む消化瓶に直ちに耳と場所の両方を遮断する。

2。乳腺/肌単一細胞懸濁液の調製

• 氷の上でPBSの小さなボリュームを含む消化瓶に乳腺/肌を置きます。組織はその後、PBSで洗浄血まみれX2れている場合、そして過剰のPBSを捨ててください。
• 湾曲したハサミで徹底的にミンチ。
• 20mlのコラゲナーゼ溶液（注​​：コラゲナーゼ溶液のこの量は、効率的に15匹までから乳腺または腫瘍組織と耳の約5グラムを解離する）を追加します。
• 37にプレートをかき混ぜる時にすぐ℃の水浴を置き、中間速度で攪拌しながら15分間インキュベートする。

注：他の組織を消化し ​​た場合、最適なインキュベーション時間は変わる場合があります。

• 反応を停止し、30 mlの冷DMEM + 10％FCSを追加します。
• 組織/メディア混合througを痛める50 mlコニカルチューブの上に置かれヘクタール70μmのセルストレーナー。
• 4℃で450×gで5分間コニカルチューブを遠心

3。赤血球の溶解

注：それらを屠殺する前にマウスをPBSで心臓潅流した場合は、この手順は必要ありません。

• 細胞ペレットを乱すことなく、真空に取り付けられたガラスピペットを用いて、上清を吸引します。
• 室温で5分間、10mlのPharmLyse液とインキュベートでRBC、再懸濁した細胞ペレットを溶解する。
• FACS緩衝液Iの約40ミリリットルを添加して溶液を中和PharmLyse
• 4℃、450×gで5分間細胞でコニカルチューブをスピン
• 上清を吸引します。

4。内因FCのブロッキング

• オプション：次のステップのために適切なボリュームを確認するには、Count細胞。
• 1〜3ミリリットルFACS緩衝液Iに細胞を再懸濁します（o応じn個の細胞数、および使用する抗体の量）。
• 1:50希釈液（10μg/ ml）で到達し、10月20日 '、氷上でインキュベートしFcBlock（抗マウスCD16/CD32）を追加します。
  いいえFcBlockを洗い流しする必要はありません。

5。染色

• 非ステンド制御と単一色コントロール（使用する蛍光抗体の数に応じて）として使用するエッペンドルフチュー​​ブに100μlのアリコートを取り出します。
• ラベルの線維芽細胞に：1:50（10μg/ ml）を希釈に（フルオロフォアに直接結合）抗PDGFRα追加します。
• 他の細胞集団（ 例えば、免疫細胞、マクロファージ、内皮細胞など）を標識するために：1:50希釈し、表面マーカーに適切な蛍光標識抗体を加える。

注：PDGFRαは、線維芽細胞のための堅牢なマーカーであるが、それは任意の二重陽性を排除するために免疫細胞や上皮細胞の抗体を含むことが推奨され集団およびこうして孤立した線維芽細胞の純度を高める。

• 単色コントロールエッペンドルフチュー​​ブのそれぞれに各抗体の2μlを添加する。
• 暗闇の中で氷上で1時間抗体で細胞をインキュベートします。
• 洗浄するには、次のようにFACS緩衝液Iでチューブを記入し、4℃で450×gで5分間スピン
• 約2×10 ⁶細胞/ ml、またはいずれかの利用可能なFACS選別機で選別するための最も適切な濃度の濃度になるように私をバッファリングし、FACSで上清を、再懸濁した細胞を吸引します。

オプション：細胞をソーティングの持続時間のために、FACS緩衝液IIに再懸濁させてもよい。これは、細胞の生存率を向上させることができる。しかしながら、血清中の因子への曝露は、テストされ、考慮されるべき効果の遺伝子発現を有することができる。

• 細胞塊を防止するためのチューブにフィルター細胞：フィルタートップとFACSチューブに標識された細胞を転送します。
• 死細胞を除外するには、7AAD（0.5μg/ ml）を追加したり、プロップサンプルにidiumヨウ化物（PI）（非ステンドコントロールを除く）。

注：セルを無駄にしないように、あなたは、FACSで録音した後、未染色試料に7AAD/PIを追加し、7AAD専用コントロールとして再び使用することができます。

• 分析しながら、サンプルを氷上で保管してください。

6。 FACSによる細胞の分離

（注：プロトコルのこの部分は、以前のFACSソーターを動作させるの知識、 例えば BD FACS AriaII、または熟練した技術者の支援が必要です）。

• FACSソーターソフトウェア（BD FACSDiva）を使用して、前方散乱（FSC）、側方散乱光（SSC）、7AAD、FITC、PEおよびラベル細胞（ 図2）に使用される任意の他の蛍光色素分子を分析するために、適切な解析プロットを準備します。
• セルソーターに各サンプルをロードする前に、渦は簡単に細胞を再懸濁する。
• CELからゲートに、全細胞集団のためのゲーティングを設定するために、無染​​色試料を分析することから始めリットルの破片、および自家蛍光やバックグラウンド染色を決定する。
• 全細胞集団からの生細胞の集団を決定し、ゲートに染色されていないサンプル+ 7AADを分析します。
• このような補償などのパラメータを決定して、キャリブレーションする各単一カラーコントロールを分析します。
• 並べ替えのためにゲートの位置を定義するために染色されたサンプルを分析します。
• いったん所望の細胞集団のパラメータとゲートが設定されている、エッペンドルフチュー​​ブまたは培養培地またはRNA溶解緩衝液（例えば、RLTバッファーまたはトリゾールなど）を含む15mlのコニカルチューブにラベルされた細胞集団を選別開始。

注：多数のセルをソートする場合、それは細胞が溶解緩衝液を希釈し、収量を減少させるでしょうに伴うシース液の大きなボリュームとしては、RNA溶解用緩衝液に直接ソートすることは推奨されません。

• デ、新鮮な培地またはRNA溶解用緩衝液にソートが終了した直後に、転送ダウン細胞をスピンあなたの実験の目的で保留中。
• 文化単離された細胞への順序でソートする場合は、無菌のソートを実行します。細胞のよりよい回復のために、代わりにFACS緩衝液IIのフェノールレッド不含DMEM +5％FCSを使用し、20％FCSを含む培地に細胞を回収します。
• 培養は、線維芽細胞をソートしたときは、それらの遺伝子発現の変化につながる線維芽細胞の活性化では、この結果として、プラスチックの上にコラーゲンコートしたプレート上alwaysplate、決して直接。

組織の線維芽細胞の高度に濃縮された集団の分離における線維芽細胞の結果のためのマーカーとしてPDGFRαを使用。ポスト·ソート解析（ 図2A）によって定量化と並べ替えの後に純度のレベルは、99％であった。細胞特異的な制御遺伝子の相対的発現（ 図2B）によって、非線維芽細胞を汚染の割合を推定することは、一般的に0.1から0.6パーセントの汚染を示しています。純度のこのレベルでは、孤立した線維芽細胞の⁹の高品質のトランスクリプトームプロファイリングを可能にします。

乳腺では、組織における線維芽細胞の割合は、正常乳腺組織に5から20パーセント、およびMMTV-PyMT腫瘍の1〜5％の間で変化します。腫瘍組織における線維芽細胞の相対的な割合は上皮区画の大規模な拡大に起因する線維芽細胞の総数は増加したものの、前腫瘍組織の場合よりも低くなります。腫瘍組織から単離された線維芽細胞の減少％もの結果である技術的な難しさを加え、非常に壊死組織から細胞選別の効率を低下させた。

隔離された線維芽細胞を選別した後直接培養することができるが、（ 図2D）を回復するために数日を必要とするかもしれません。一次線維芽細胞は、培養中の伝播中に老化を受けるようにそれは、低継細胞とそれ以降のすべての実験を行うことが不可欠である。

図1。新鮮な乳腺線維芽細胞からの精製。 -FVB / N / PyMTマウスB-露出乳腺C-新鮮な乳腺をFVB / N / PyMTマウスから解剖し、単一細胞懸濁液にコラゲナーゼで消化し ​​た。細胞は線維芽細胞表面マーカー（PDGFRα）とミリアンペア用抗体で免疫標識したcrophages表面マーカー（F4/80）は、FACSによって分離した。ソートされた線維芽細胞を培養いずれかまたはRNA精製の ​​ために溶解した。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。

図2。ソートされた線維芽細胞のプロファイリング。マウス乳腺のシングル細胞懸濁液をPDGFRαandF4/80抗体で染色した。プロットをFACSソーティングは（左のパネル）が表示されます。 P2は、線維芽細胞ゲート（PDGFRα+細胞）で、P4はマクロファージゲート（F4/80 +細胞）です。ソート後の分析は、ソートされた線維芽細胞やマクロファージ（真ん中と右のパネル）の純度を決定するために行われました。fibroblaための細胞特異的な制御遺伝子の定量RT-PCRによる選別純度のB分析ST（PDGFRα、COL-1α）、免疫細胞（CD45、CSF-1R）と上皮細胞（E-カドヘリン）。結果は、2つのハウスキーピング遺伝子（GAPDHおよびMGUS）に正規化した。 GAPDHに対する相対的な発現が示されている。乳腺線維芽細胞の合計ソートされていない集団では、PDGFRα表現のC定量。ソート線維芽細胞のD-組織培養。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。

組織培養で行われた実験は、有益であるとin vivoで検証することができる機能的な原則を提案することができますが、それは文化^11,12中の細胞の遺伝子発現に大きな変化が起こることが知られている。線維芽細胞における遺伝子発現プロファイルの作成時手順組織培養を避けるために、私たちは新鮮なマウスやヒト組織から通常の分離、ならびに癌関連線維芽細胞を可能にするプロトコルを開発しました。このプロトコルは正常マウスとヒトから^9時から皮膚、膵臓、乳房組織に適用した。 FACSソーティングにより線維芽細胞の分離は、表面マーカー、ラベルの線維芽細胞を必要とします。我々は、PDGFRαは、線維芽細胞⁹の高度に濃縮された集団の単離を可能にする堅牢な表面マーカーであることを確立した。また、PDGFRαは、このように公平な分離とプロファイリング組織の線維芽細胞ではなくfocusiを許し、正常組織の線維芽細胞の両方でとCAFSに発現しています特定の亜集団でNG。

線維芽細胞は、マーカー分子の発現に関してだけでなく、その起源とシグナル伝達特性^8,10,18における不均一な細胞集団である。 PDGFRαは、線維芽細胞のための堅牢な表面マーカーであるが、それは組織の種類に応じて、セルのラベルが付いていない集団において生じるすべての組織において線維芽細胞の100％を付けることはありません。総組織の線維芽細胞の約85％が、PDGFRα+（ 図2C）は乳腺中に皮膚では、線維芽細胞の約90％は、PDGFRα+（図示せず）である。 PDGFRαを発現する線維芽細胞の割合は、他の組織型に変化し、それぞれの組織のために定義される必要があります。それにもかかわらず、皮膚や乳腺に、細胞表面マーカーとしてPDGFRαを利用することが選別された細胞の発現プロファイリングまたは培養を可能にする、組織の線維芽細胞の大多数の高度に濃縮された集団になります。

特別な利害関係は宣言されません。

我々は、FACSソーティングと彼らの助けのために博士Yitzchak Oschry博士と点の他鷺-アシフに感謝します。この研究は、助成合意nの下欧州連合第7次フレームワーク計画（FP7/2007-2013）から°[276890]、イスラエル癌学会（＃20110078）から、イスラエルがん研究基金（ 研究からNEへの補助金によって支えられてキャリア開発賞 ）。