Isolamento di fibroblasti normali e tumorali associata da tessuti freschi di fluorescenza activated cell sorting (FACS)

Cancro fibroblasti associati (CAF) facilitare l'iniziazione del tumore, la crescita e la progressione attraverso la segnalazione che promuove la proliferazione, l'angiogenesi, e l'infiammazione. Qui si descrive un metodo per isolare popolazioni pure di fibroblasti normali e CAF dal topo freschi e tessuti umani mediante selezione delle cellule, utilizzando PDGFRα come marcatore di superficie.

Cancro-associate fibroblasti (CAF) sono il tipo cellulare più prominente nello stroma del tumore di molti tumori, in particolare carcinoma mammario, e la loro presenza prominente è spesso associato con ^1,2 prognosi. CAF sono una sottopopolazione di fibroblasti attivati ​​stromali, molti dei quali esprimono il marcatore myofibroblast α-SMA ^3. CAF provengono da fibroblasti tissutali locali nonché da midollo osseo, cellule reclutati nel tumore sviluppare e adottare un fenotipo CAF sotto l'influenza del microambiente tumorale ^4. CAF sono stati dimostrato di facilitare l'iniziazione del tumore, la crescita e la progressione attraverso la segnalazione che promuove la proliferazione delle cellule tumorali, l'angiogenesi e l'invasione ^5-8. Abbiamo dimostrato che i CAF migliorare la crescita tumorale di mediazione che promuove l'infiammazione del tumore, a partire al più presto pre-neoplastiche stadi ^9. Nonostante la crescente evidenza dei CAF ruolo chiave svolgere nel facilitare la crescita tumorale,CAF studiano è una continua sfida a causa della mancanza di CAF-specifici marcatori e l'eterogeneità parte di queste cellule, con molti sottotipi coesistenti nel microambiente tumorale ^10. Inoltre, studiando fibroblasti in vitro è ostacolato dal fatto che il loro profilo di espressione genica è spesso alterato in coltura tissutale ^11,12. Per risolvere questo problema e per consentire imparziale profilo di espressione genica di fibroblasti di topo fresco e tessuti umani, abbiamo sviluppato un metodo basato sui protocolli precedenti per fluorescenza selezione delle cellule attivate (FACS) ^13,14. Il nostro approccio si basa su utilizzando PDGFRα come marcatore di superficie per isolare i fibroblasti di topo freschi e tessuti umani. PDGFRα è abbondantemente espresso da entrambi i fibroblasti normali e CAF ^9,15. Questo metodo permette di isolare popolazioni pure di fibroblasti normali e CAF, tra cui, ma non limitato a α-SMA + attivato miofibroblasti. Fibroblasti isolati possono quindi essereutilizzati per la caratterizzazione e confronto dell'evoluzione di espressione genica che si verifica nei CAFS durante la tumorigenesi. In effetti, noi e gli altri segnalati profilo di espressione di fibroblasti isolati da cellule ordinamento ^16. Questo protocollo è stato eseguito con successo per isolare e creare un profilo popolazioni altamente arricchito di fibroblasti dai tessuti della pelle, della mammella, del pancreas e del polmone. Inoltre, il nostro metodo permette anche di coltura delle cellule filtrate, per eseguire esperimenti funzionali e per evitare contaminazione da cellule tumorali, che spesso è un grosso ostacolo quando si cerca di CAF cultura.

1. Dissezione tessuto mammario o con la pelle di topi

1. Prima di sezionare il tessuto desiderato dai topi, preparare le seguenti forniture e dei reagenti:

   Materiali di consumo:

   • Strumenti chirurgici (lavato con detergente e poi immersi in 70% etanolo).
   • Superficie di polistirolo per appoggiare il mouse su durante la dissezione.
   • Pins o aghi per tenere i topi durante la dissezione.
   • Vaso di vetro con coperchio per la digestione, contenente barra di agitazione magnetica (autoclave).
   • Bagnomaria a 37 ° C, contenente un agitatore magnetico sommergibile e acqua sufficiente per immergere il vaso digestione, mentre appoggio alla piastra di agitazione.

   Reagenti:

   • FACS buffer di I: (4 ° C): fosfato Dulbecco Buffered Saline CMF (Calcio Magnesio gratuita) + 0,5% di BSA
   • Soluzione di collagenasi (immediatamente prima dell'uso):
     0,05 g Collagenasi II
     0,05 g Collagenasi IV
     0,01 g Deoxyribonuclease
     20ml FACS tampone I. Tenere soluzione di collagenasi in ghiaccio fino al momento dell'uso.
   • PharmLyse (cloruro di ammonio Reagente di lisi).
   • FACS tampone II: fosfato Dulbecco Buffered Saline CMF + 1% FCS.
2. Dissezione delle ghiandole mammarie (vedi anche ^17).
   • Eutanasia topi di sesso femminile con anidride carbonica (CO ₂₎ inalazione.
   • Su una superficie di polistirolo, posizionare il mouse sul dorso e pin saldamente tutti e quattro gli arti con aghi calibro 25 (Figura 1A). Spruzzare il mouse generosamente con il 70% di etanolo.
   • Utilizzando pinze, tirare la pelle addominale sulla linea mediana e fare una piccola incisione con le forbici affilate.
   • Partendo dall'incisione, tagliare la pelle fino al collo dell'animale evitando pungere cavità addominale o toracica.
   • Tagliare la pelle delle gambe posteriori della incisione mediana verso la gamba, risultanti in una "forma Y".
   • Tirare la pelle lontano dal corpo del mouse e definire, esponendole ghiandole mammarie fissato al lato inferiore della pelle (Figura 1B).
   • Utilizzare Q-tips per separare delicatamente ghiandole mammarie dalla pelle durante il taglio di tessuto connettivo, con piccole forbici affilate per separare la ghiandola mammaria verso la colonna vertebrale del mouse.
   • Le ghiandole addominali (# 4, 5) sono i migliori per questo protocollo. È inoltre possibile utilizzare la ghiandola mammaria 2 ^°, ma tenere a mente che queste ghiandole sono anatomicamente trova in prossimità del muscolo pettorale, che può essere difficile da separare, con conseguente cellule di origine del tessuto misto.
   • Nota: Quando la dissezione del tessuto tumorale, si consiglia di rimuovere le aree necrotiche.
3. La dissezione del tessuto cutaneo: Il modo più semplice per ottenere tessuto cutaneo, senza avere a che fare con la rimozione dei capelli è quello di utilizzare le orecchie del mouse. Se una maggiore quantità di tessuto è necessario, è possibile radersi i capelli dal tronco del mouse e sezionare la pelle.
   • Eutanasia topo, utilizzando CO ₂ inalazione.
   • Utilizzando forbici affilate, tagliare entrambe le orecchie e mettere subito in vaso di digestione contenente un piccolo volume (~ 0,5 ml) di PBS su ghiaccio.

2. Preparazione della ghiandola mammaria / pelle Sospensione singola cella

• Posizionare ghiandole mammarie / pelle in vaso di digestione contenente un piccolo volume di PBS sul ghiaccio. Se il tessuto è sanguinosa x2 lavaggio con PBS, e quindi eliminare l'eccesso di PBS.
• Tritare accuratamente con le forbici curve.
• Aggiungi (nota: questa quantità di soluzione di collagenasi in modo efficiente dissociare circa 5 g di tessuto mammario o tumore e le orecchie da fino a 15 topi) 20 ml di soluzione di collagenasi.
• Mettere immediatamente mescolare piastra a 37 ° C in bagno d'acqua, e incubare per 15 minuti sotto agitazione al tasso medio.

Nota: i tempi ottimali di incubazione può variare se digerire altri tessuti.

• Per arrestare la reazione, aggiungere 30 ml DMEM freddo + 10% FCS.
• Filtrare il tessuto / media throug miscela70 ha filtro cella um collocato su un tubo da 50 ml.
• Centrifugare la provetta conica per 5 min a 450 xg a 4 ° C.

3. Blood Red Cells Lysis

Nota: questo passaggio non è necessario se i topi sono stati il cuore perfusi con PBS prima di essere sacrificati.

• Aspirare il supernatante usando una pipetta di vetro collegato a vuoto, senza disturbare il pellet.
• Per lisare RBC, risospendere il pellet cellulare in 10 ml di soluzione di PharmLyse e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
• Neutralizzare la soluzione PharmLyse con l'aggiunta di circa 40 ml di FACS tampone I.
• Centrifugare la provetta conica con le cellule per 5 min a 450 xg a 4 ° C.
• Aspirare il surnatante.

4. Blocco di Fc endogena

• Opzionale: cellule Count per determinare il volume appropriato per le fasi successive.
• Risospendere le cellule in 1-3 ml di FACS buffer di I (a seconda on numero di cellule, e la quantità di anticorpi che si desidera utilizzare).
• Aggiungi FcBlock (anti-mouse CD16/CD32) per raggiungere diluizione 1:50 (10 pg / ml), e incubare su ghiaccio per 10-20 '.
  Non c'è bisogno di lavare FcBlock.

5. Colorazione

• Estrarre aliquote di 100 pl per provette Eppendorf da utilizzare come un non-tinto controllo e comandi a singolo colore (a seconda del numero di anticorpi fluorescenti utilizzate).
• Per fibroblasti etichetta: aggiungere anti-PDGFRα (direttamente coniugato fluoroforo) ad una diluizione di 1:50 (10 pg / ml).
• Per etichettare popolazioni cellulari (es. cellule immunitarie, macrofagi, cellule endoteliali ecc): aggiungere appropriati anticorpi fluorescenti coniugati a marcatori di superficie, ad una diluizione 1:50.

Nota: sebbene PDGFRα è un marcatore robusto per fibroblasti, si raccomanda di includere anticorpi per cellule immunitarie e cellule epiteliali in modo da escludere qualsiasi positivo doppiapopolazioni e quindi aumentare la purezza dei fibroblasti isolati.

• Aggiungere 2 microlitri di ciascun anticorpo a ciascuno dei singoli tubi eppendorf colore controllo.
• Incubare le cellule con anticorpi per 1 ora su ghiaccio al buio.
• Per lavare: riempire i tubi con tampone FACS I e girare per 5 min a 450 xg a 4 ° C.
• Aspirare il surnatante, risospendere le cellule in tampone FACS I a una concentrazione di circa 2 x 10 ⁶ cellule / ml, o qualsiasi concentrazione più appropriato per l'ordinamento con il sorter disponibili FACS.

Opzionale: Le cellule possono essere risospese in tampone FACS II per la durata di smistamento. Questo può migliorare la vitalità cellulare. Tuttavia, l'esposizione a fattori nel siero possono avere un effetto espressione genica, che deve essere testato, e prese in considerazione.

• Trasferire cellule marcate in tubi FACS con filtro migliori: celle filtranti nei tubi per evitare grumi di cellule.
• Per escludere cellule morte, aggiungere 7AAD (0,5 mcg / ml) o Propidium Ioduro (PI) ai campioni (tranne che per il non-macchiato di controllo).

Nota: Per evitare di sprecare le celle, è possibile aggiungere 7AAD/PI al non-tinto campione dopo la registrazione nel FACS, e usare di nuovo come 7AAD-solo il controllo.

• Conservare i campioni in ghiaccio durante l'analisi.

6. Isolamento delle cellule da FACS

(Nota: questa parte del protocollo richiede conoscenza nella gestione di un selezionatore FACS, ad esempio BD FACS AriaII, o l'assistenza di un tecnico specializzato).

• Utilizzando il software di FACS sorter (BD FACSDiva), preparare grafici di analisi adeguati per l'analisi forward scatter (FSC), dispersione laterale (SSC), 7AAD, FITC, PE e qualsiasi altro fluoroforo utilizzato per etichettare le cellule (Figura 2).
• Prima di caricare ogni campione al cell sorter, vortice brevemente per risospendere le cellule.
• Inizia analizzando il campione non colorato per impostare il gating della popolazione cellulare totale, per escludere il celL detriti, e per determinare autofluorescenza o colorazione di fondo.
• Analizzare campione senza macchia + 7AAD per determinare e porta la popolazione di cellule vive della popolazione cellulare totale.
• Analizzare ogni singolo controllo del colore per determinare e calibrare i parametri quali la compensazione.
• Analizzare il campione colorato per definire la posizione di porte per l'ordinamento.
• Una volta che i parametri e le porte per le popolazioni cellulari desiderati sono stati impostati, iniziare l'ordinamento dei popolazioni di cellule etichettate in provette Eppendorf o provette da 15 ml coniche contenenti terreno di coltura o tampone di lisi RNA (come RLT tampone o Trizol).

Nota: Se l'ordinamento di un gran numero di cellule, non è consigliabile per ordinare direttamente nel tampone di lisi RNA, come il volume di liquido guaina accompagna le cellule diluire il tampone di lisi e ridurre la resa.

• Spin celle in basso subito dopo la cernita è finito, e il trasferimento in terreno fresco o tampone di lisi RNA, dein attesa dello scopo dell'esperimento.
• Se l'ordinamento, al fine di isolate cellule di coltura, eseguire sorta sterile. Per migliore recupero delle cellule, utilizzare rosso fenolo libero DMEM + 5% FCS anziché FACS tampone II e raccogliere cellule in mezzo di coltura con 20% FCS.
• Se la coltura ordinati fibroblasti, alwaysplate su piastre rivestite di collagene e mai direttamente sulla plastica come questo si traduce in attivazione dei fibroblasti che portano a cambiamenti nella loro espressione genica.

Utilizzando PDGFRα come marker risultati fibroblasti in isolamento delle popolazioni altamente arricchito di fibroblasti tissutali. Il livello di purezza dopo la cernita era del 99%, come quantificato mediante analisi post-liste (Figura 2A). Valutare la percentuale di contaminanti non fibroblasti cellule mediante l'espressione relativa di cellula-specifici geni di controllo (Figura 2B) mostra tipicamente 0,1-0,6% contaminazione. Questo livello di purezza permette di alta profilazione trascrittoma qualità dei fibroblasti isolati ^9.

In ghiandole mammarie, la percentuale di fibroblasti nel tessuto varia tra 5-20% in normale tessuto mammario, e 1-5% in MMTV-PyMT tumori. La percentuale relativa di fibroblasti nel tessuto tumorale è inferiore in tessuto pre-neoplastiche, nonostante l'aumento del numero totale di fibroblasti, a causa della massiccia espansione del compartimento epiteliale. L'% ridotta fibroblasti isolati da tessuto tumorale è anche il risultato dil'aggiunta difficoltà tecnica e diminuita efficienza di separazione delle cellule da un tessuto altamente necrotico.

Fibroblasti isolati possono essere coltivate direttamente dopo l'ordinamento, ma può richiedere un paio di giorni per recuperare (Figura 2D). È indispensabile effettuare tutte ulteriori esperimenti con cellule passaggio basso, come fibroblasti primari subiscono senescenza durante la propagazione in coltura.

Figura 1. Purificazione di fibroblasti da nuove ghiandole mammarie. A-FVB / n / PyMT mouse. B-Exposed ghiandole mammarie. Ghiandole mammarie C-freschi sono stati sezionati da FVB / n / topi PyMT e digerito con collagenasi ad una sospensione singola cella. Le cellule sono state marcate con immuno-anticorpi per marcatore di superficie dei fibroblasti (PDGFRα) e masuperficie crophages marcatore (F4/80) seguita dalla separazione da FACS. Fibroblasti ordine erano o coltivate o lisati per la purificazione dell'RNA. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 2. Profiling dei fibroblasti ordinati. A-singole sospensioni di cellule di ghiandole mammarie di topo sono state colorate con PDGFRαand F4/80 anticorpi. Ordinamento FACS trama è mostrato (pannello di sinistra). P2 è la porta fibroblasti (cellule PDGFRα +) e P4 è il cancello macrofagi (cellule F4/80 +). Un'analisi sorta messaggio è stato eseguito per determinare la purezza di fibroblasti filtrate e macrofagi (pannelli centrali e destra). B-Analisi di purezza ordinamento per RT-PCR su cellula-specifici geni di controllo per fibroblast (PDGFRα, Col-1α), le cellule immunitarie (CD45, CSF-1R) e cellule epiteliali (E-caderina). I risultati sono stati normalizzati a casa di due geni in custodia (GAPDH e MGUS). Di espressione rispetto al GAPDH è mostrato. C-Quantificazione di espressione PDGFRα nel totale della popolazione non selezionata di fibroblasti mammari. Tessuto D-cultura di fibroblasti ordinati. Clicca qui per ingrandire la figura .

Mentre esperimenti condotti in coltura tissutale può essere informativo e suggerire principi funzionali che possono essere verificati in vivo, è noto che si verificano grandi cambiamenti nell'espressione genica di cellule in coltura ^11,12. Per evitare un passo coltura tissutale a profilare espressione genica in fibroblasti, abbiamo sviluppato un protocollo che permette di isolare normali, così come cancro-associate fibroblasti di topo freschi o tessuti umani. Questo protocollo è stato applicato con successo con i tessuti della pelle, pancreas e della mammella da topo e da umano ^9. Isolamento di fibroblasti di smistamento FACS richiede un marcatore di superficie che fibroblasti etichette. Abbiamo stabilito che PDGFRα è un marcatore di superficie robusta che permette l'isolamento di popolazioni altamente arricchito di fibroblasti ^9. Inoltre, PDGFRα è espressa su entrambi i fibroblasti del tessuto normale e il CAF, consentendo in tal modo l'isolamento imparziale e profilazione dei fibroblasti del tessuto piuttosto che focusing su una sottopopolazione specifica.

I fibroblasti sono una popolazione cellulare eterogenea per quanto riguarda l'espressione di molecole marker così come nella loro origine e proprietà di segnalazione ^8,10,18. Mentre PDGFRα è un marcatore di superficie solida di fibroblasti, non etichetta 100% di fibroblasti in tutti i tessuti risultanti in una sottopopolazione di cellule senza etichetta, a seconda del tipo di tessuto. In pelle, circa il 90% dei fibroblasti sono PDGFRα + (non mostrato), mentre nelle ghiandole mammarie di circa 85% del totale dei fibroblasti tissutali sono PDGFRα + (Figura 2C). La percentuale di PDGFRα fibroblasti esprimenti possono variare in altri tipi di tessuto, e deve essere definito per ciascun tessuto. Tuttavia, in pelle e in ghiandole mammarie, utilizzando PDGFRα come marcatore di superficie cellulare si tradurrà in popolazioni altamente arricchito della maggioranza dei fibroblasti tissutali, consentendo profilo di espressione o coltura di cellule filtrate.

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Ringraziamo il Dott. Yitzchak Oschry e il Dr. Orit Sagi-Asif per il loro aiuto con la selezione FACS. Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni a NE del programma europeo per il Settimo programma quadro dell'Unione (FP7/2007-2013) nell'ambito della convenzione di sovvenzione n ° [276890], da Israele Cancer Association (# 20110078), e da Israele Cancer Research Fund (Ricerca Career Development Award).