Низкие Модель крысы смертности для оценки задержки церебрального вазоспазма после экспериментального субарахноидального кровоизлияния

Аневризмы субарахноидального кровоизлияния (САК) является кровотечение, которое происходит в субарахноидальное пространство при разрыве аневризмы. В то время как заболеваемость и смертность от этого события была на спад в связи с улучшением методов лечения, риск спазма сосудов после субарахноидального кровоизлияния продолжает оставаться таким же, как это было несколько лет назад. Важность создания всеобъемлющей и воспроизводимые модели животных для определения исходных событий мозговой спазм сосудов был в центре внимания исследований с первого использования крыс в экспериментальной модели вазоспазма в 1979 году Барри И соавт. Ранние работы по крысах показали, что однократная инъекция аутокрови в цистерна привело к острой (в течение нескольких минут), но не задерживается церебрального вазоспазма ^{3, 6, 14}. Здесь мы характеризуем низкая смертность SAH крысиной модели, что приводит к воспроизводимым задержкой спазм сосудов.

Цель: охарактеризовать и создать воспроизводимую модель, которая демонстрирует задержкой церебрального вазоспазма после аневризмы субарахноидального кровоизлияния (САК) у крыс, в целях выявления исходных событий, патофизиологические изменения и потенциальные цели для лечения.

Методы: Двадцать восемь мужчин Sprague-Dawley крыс (250 - 300 г) были произвольно отнесены к одной из двух групп - SAH или физиологического раствора управления. Крысы субарахноидальное кровоизлияние в SAH группы (п = 15) был вызван двойной инъекции аутологичных крови, при 48-часовом друг от друга, в большой цистерны. Точно так же, физиологический раствор (п = 13) вводили в большой цистерны солевого контрольной группы. Крыс умерщвляют на пятый день после второй инъекции кровь и мозги были сохранены для гистологического анализа. Степень спазма сосудов измеряли с помощью разделов основной артерии, путем измерения внутреннего просвета площадь поперечного сечения использовании NIH Image-J программного обеспечения. Значение былопроверена с помощью Тьюки / Крамера с статистическим анализом.

Результаты: После анализа гистологических срезов, просвета артерии площадь поперечного сечения были меньше в SAH, чем в солевой группы, в соответствии с церебрального вазоспазма в первой группе. В группе SAH, основной артерии внутренней области (0,056 мкм ± 3) были значительно меньше от спазма сосудов пять дней после второй инъекции крови (семь дней после первой инъекции крови), по сравнению с контрольной группой солевого с внутренней области (0,069 ± 3, р = 0,004). Существовали нет смертности от церебрального вазоспазма.

Вывод: крыса модели двойного SAH вызывает мягкий, живучестью, базилярной артерии спазм сосудов, который может быть использован для изучения патофизиологических механизмов церебрального вазоспазма в маленькой модели животных. Низкой и приемлемой смертность является важным критерием должны быть выполнены для идеальной модели животных SAH так, что механизмы спазм сосудов может быть elucid^{7 ated, 8.} Дальнейшие модификации модели могут быть сделаны для корректировки увеличилась тяжесть спазма сосудов и неврологические экзаменов.

1. Крысы хирургии Тема SAH вводят 0,15 мл аутологичной артериальной крови

1. Крыса находится под наркозом, используя 0,1 мг / кг кетамина / Ксилазин грызунов коктейль и разрешили сидеть в течение 5 мин.
2. Адекватная анестезия подтверждается сокращением задних конечностей рефлекс.
3. Использование электронных бритвы шеи области носа, волос вокруг суб-затылочной области побрился.
4. Животное помещается на спине на операционный стол и хвост протереть бетадин для обеспечения стерильной разрез.
5. Прямой 1 см, срединный разрез принимается на вентральной части хвоста
6. Диссекция продлен до хвоста артерии выявлены и изолированы.
7. Использование стерильных 26-калибровочного катетера, хвост артерии канюли и 0,15 мл артериальной крови в шприц.
8. Стерильную марлю оборачивают вокруг разреза для обеспечения гемостаза перед нанесением vetbond для герметизации разреза.
9. TОн крыса оказалась ничком на стол и побрился, над суб-затылочной области протереть бетадин.
10. С помощью вертикальной средней линии доступа разрез получил на цистерна.
11. После идентификации 25-игла вставляется в большой цистерны и 0,15 мл ликвора в шприц, чтобы избежать повышенного внутричерепного давления с введением аутологичных объема крови.
12. Теперь, 0,15 мл крови извлекаются из хвостовой артерии вводят медленно в большой цистерны.
13. Игла остается на месте в течение 30 сек для обеспечения свертывания крови в субарахноидальное пространство, а затем осторожно снимается.
14. Гемостаз обеспечивается и разрез закрыт с помощью сшивания устройства.
15. Животное теперь находится ничком на потепление поверхности с 20 ° вниз головой позиции в течение 20 минут, чтобы кровь застыть в цистернах по всему базилярной артерии.
16. Шаги 1,1 до 1,15 повторяются во время второй операции 48 часов друг от друга.

2. Крысы хирургии Тема SAH вводят 0,15 мл физиологического раствора

1. Крыса находится под наркозом, используя 0,1 мг / кг кетамина / Ксилазин грызунов коктейль и разрешили сидеть в течение 5 мин.
2. Адекватная анестезия подтверждается сокращением задних конечностей рефлекс.
3. Использование электронных бритвы шеи области носа, волос вокруг суб-затылочной области побрился.
4. Животное помещается на спине на операционный стол и хвост протереть бетадин для обеспечения стерильной разрез.
5. Прямой 1 см, срединный разрез принимается на вентральной части хвоста
6. Диссекция продлен до хвоста артерии выявлены и изолированы.
7. Использование стерильных 26-калибровочного катетера, хвост артерии канюли и 0,15 мл артериальной крови в шприц.
8. Стерильную марлю оборачивают вокруг разреза для обеспечения гемостаза перед нанесением vetbond для герметизации разреза.
9. РАт включен ничком на стол и побрился, над суб-затылочную область окрашена бетадин.
10. С помощью вертикальной средней линии доступа разрез получил на цистерна.
11. После идентификации 25-игла вставляется в большой цистерны и 0,15 мл ликвора в шприц и образец хранится.
12. Теперь, 0,15 мл физиологического раствора (37 ° C) вводят медленно в большой цистерны.
13. Игла остается на месте в течение 30 сек и тщательно сняты.
14. Гемостаз обеспечивается и разрез закрыт с помощью сшивания устройства.
15. Животное теперь находится ничком на потепление поверхности с 20 ° вниз головой положении на 20 мин.
16. Шаги 2,1 до 2,15 повторяются во время второй операции 48 часов друг от друга.

3. Крысы жертвы

1. На 5-й день после второй операции, крыс умерщвляют сердечной перфузии.
2. Крыса получает смертельную дозу (00,2 мл / кг) Fatal Plus (Vortech PHARMACEUTICALS LTD., Дирборн, Мичиган)
3. С вертикальный разрез средней линии, брюшной полости подошел и брюшины открыт.
4. Передней торакотомии выполняется и сердце подвергается.
5. Использование 26-калибровочного катетер, соединенный с фосфатный буферный раствор (PBS рН 7,4 и при температуре 37 °) животное обескровлены, а затем перфузию 4% параформальдегида.
6. После обеспечение адекватной перфузии, перфузия остановился и крысы выведен на обезглавливание таблице.
7. После обезглавливания, кости Rongeur используется для удаления черепа для удаления мозга.
8. Мозга и ствола мозга тщательно извлечены из свода черепа и помещен в 4% параформальдегида решение и хранили при 4 ° C в течение 48 часов.

4. Создание разделов для оценки Вазоспазм

1. Головного мозга крыс, которая теперь был погружен в 30% сахарозы в течение 4 дней доводится до гоэлектронной криостат для секционирования.
2. После cryoprotected, 12 секций мкМ создаются с помощью криостата, с передней нижней мозжечковой артерии (АИС) в качестве отправной точки для обеспечения межпредметных консистенции.
3. 20 секций созданы друг для животных, заканчивающийся в верхней мозжечковой артерии (SCA).
4. В разделах помещаются на предметное стекло и оцениваются на вазоспазма использованием гистологических методологии

В протоколах, описанных выше, есть несколько шагов, которые мы считаем требуют лучшего характеристика модели, чем то, что было ранее описано в литературе. Здесь мы сосредоточимся на шаги, которые необходимы для достижения воспроизводимых низкая смертность церебрального вазоспазма маленькая модель животного и избежать потенциальных ловушек, связанных с этой моделью, если не сделано правильно.

1. Аутологичные взятия крови из хвостовой артерии:

Тщательное размещение ангиокатетер в хвостовой артерии является важным первым шагом в модели. Рис-1 показано размещение 26-калибровочного катетера в хвостовой артерии крысы. Это представляет собой хорошее место с минимальной травмой и потерей крови. Правильное размещение ангиокатетер может быть подтверждено хорошую отдачу крови.

2. Инъекции аутологичной крови в Cisterna Magna:

Глубокое рассечение тОн подзатылочных области осуществляется до атланто-затылочной мембраны визуализируется в виде блестящей белой мембраны (рис.-2). Цистерна доступ через прокол через мембрану с 25-иглы. После вывода иглы, объединение крови следует отметить, для обеспечения достаточного объема аутологичной крови остается в пределах субарахноидального пространства большой цистерны. Чрезмерное объединение крови на внешней стороне аспект атланто-затылочной мембраны является нежелательным, поскольку наша модель использует относительно низких объемах (0,15 мл) аутологичной крови по сравнению с существующими моделями и объединение может привести к неэффективной объемов крови в субарахноидальное пространство. Рост объемов крови часто приводило к дыхательной недостаточности, предположительно, от повышенного внутричерепного давления и продуктов крови вскоре после инъекции. Сбор крови вокруг артерии в субарахноидальном пространстве является одним из нескольких возможных способов начать экспериментальное вазоспазма ⁸ . Во время второй операции, атланто-затылочной мембраны может иногда быть трудно представить себе, хотя место прокола с первого хирургия часто видны.

3. Образец

Рисунок-3 показывает образцы мозга извлекаются из крысу без (рис.-3A) и с (рис.-3B) субарахноидального кровоизлияния. Обратите внимание на сбор крови в субарахноидальное пространство вокруг основной артерии на рис-3B. Это представляет собой достаточный объем крови, чтобы вызвать спазм сосудов основной артерии. Стрелки на рисунке-3A и 3B-Рис определить степень основной артерии (BA). Разделы (12 мкм) взяты из длины BA простирается от AICA к SCA.

4. Гистологических срезов

Двадцать разделах были проанализированы для каждого образца базилярной артерии в SAH и соленых управлениягрупп (Рис.-4). Внутренний просвет площади поперечного сечения артерии были меньше и не было значительных гофра внутренней упругой пластинки указывают на спазм сосудов, в SAH группы (рис.-4А). Основной артерии от солевых контрольной группе было больше по площади и не имеют гофрированные внутренние упругие пластинки (Рис.-4B). Количественной оценки степени снижения в область между двумя группами можно найти на рисунке 5. Эти исследования подтверждают, что эта модель SAH же производит церебрального вазоспазма, что можно оценить с помощью гистологических методов. Люминал площадь поперечного сечения была использована для определения спазм сосудов, потому что ткань обработки иногда приводит к аморфным сечения сосудов, что затрудняет определение соответствующего диаметра для измерения и использовать для анализа данных. Все измерения проводились с помощью NIH Image-J программного обеспечения. В группе SAH, основной артерии являются(внутренний = 0,056 мкм ± 3) были значительно меньше, чем солевые группы контроля (внутренний = 0,069 мкм ± 3, р = 0,004) за счет спазма сосудов. Значение была проверена с помощью Тьюки / Kramer 'ы статистического анализа. Таблица 1 иллюстрирует эти значения с расчетными стандартные отклонения и стандартные ошибки для обеих групп.

Рисунок 1. Вставка на 26 калибровочных катетер вводится в хвостовой артерии.

Рисунок 2. Внешний вид атланто-затылочной мембраны (стрелка) у крыс.

Рисунок 3. Вентральной поверхности крысы бюстгальтерinstem основной артерии (стрелка) с (A), так и без (B), SAH.

Рисунок 4. Гистологические срезы показывает основной артерии в SAH (A) и засоленных управления (B) группы. Обратите внимание, что просвета площадь поперечного сечения артерии меньше и внутренней упругой пластинки рифленая (стрелка) в группе SAH, и в соответствии с вазоспазма.

Рисунок 5. Сравнение просвета артерии площади поперечного сечения между SAH и соленых контрольных групп.

Таблица 1. Расчетные средние и стандартные отклонения от SAH и групп salien управления.

Таблица 2. Резюме опубликован двойной модели субарахноидального кровоизлияния крысы.

Приматы, имеющие больше похож генетический состав и анатомические особенности для человека, более точно имитировать события задержкой церебрального вазоспазма и может легко пройти неинвазивной томографии (МРТ и ангиографии) для мониторинга артериального изменений, чем грызуны ^8. Тем не менее, приматы модели непомерно и связано с более сложной ухода и этических вопросов, чем маленькие модели на животных. Малые животных SAH модели, которые были разработаны ранее были сосредоточены на трех методов индукции SAH: 1) Эндоваскулярная артериальной перфорации внутричерепной артерии позволяет крови попадать в субарахноидальное пространство и собирает вокруг потерпевшего артерии; 2) Хирургическое воздействие артерии и местные инъекции аутологичных сгустков, 3) непосредственный впрыск крови (аутологичных или донора) в субарахноидальное пространство ^8. Каждая модель имеет свои достоинства и недостатки. Например, модель эндоваскулярной перфорации наиболее близко имитирует события aneurysм разрыва, но связаны с очень высокой смертностью и ранней спазм сосудов, в то время как хирургический подход является искусственным и не имитировать события типичный человеческий презентация аневризмы САК. Модели прямых инъекций, которые мы описываем здесь действительно есть снижение смертности, чем эндоваскулярной модели перфорации и более точно имитирует человеческое состояние SAH, чем открытые хирургические модели. Хотя подобные модели были описаны ранее, у нас был большой кривой обучения с моделью развития SAH, поскольку потенциальные осложнения от нюансов модели, не были хорошо описаны нигде ранее. Это было нашим намерением, чтобы лучше определить потенциальные ловушки, так что будущие исследователи могли бы более легко использовать это воспроизводимые модели САК.

В то время как мы предлагаем простой и экономически эффективной модели для изучения последствий задержки спазм сосудов, это не без его ограничения. Благодаря возможности для крыс быстро очистить кровь от субарахноидального пространства,и анатомические различия в мозговой артерии себя, крысы считаются в качестве модели для изучения задержки субарахноидальное кровоизлияние ^{6, 8.} Есть несколько важных шагов, которые влияют на результат модели. Доза кетамина / Ксилазин коктейля не должна превышать 0,1 мл / кг для обеспечения адекватной анестезии. Любое количество объединение крови после инъекции в большой цистерны должны быть отмечены и задокументированы как мы уже отметили, что объединение в крови приводит к меньшей степени вазоспазма ^{9, 13, 15.} Другие исследования показали, что второй инъекции крови 24 часа в сутки, кроме может вызвать более значительной степени вазоспазма ^6, мы считаем, что не будет имитировать время хода спазм сосудов в организме человека, где редко происходит спазм сосудов до дня три после САК. Для того, чтобы более точно имитировать этот раз Конечно, мы сделали второй инъекции крови 48 ч после первой инъекции.

Потенциальные модификации модели мы описывающиеэлектронной включают употребление инъекционных больших объемов крови в субарахноидальное пространство, изменив источник крови, изменения времени курс для второй инъекции, и жертвуя далее, чем через пять дней после второй инъекции крови. Такие изменения в предыдущих моделях можно найти выше в таблице 2. В ходе нашей модели развития, мы использовали как одно-и двухместные модели инъекций, изменили время между инъекциями с двойным модели SAH, испытаны различные объемы крови, проверили эффекты гемолиза крови, венозной пытался по сравнению с артериальной и аутологичных по сравнению с донорской кровью инъекций. Каждая из этих модификаций привести к осложнениям, которые привели в непригодном для использования модели для тестирования задержки спазм сосудов. Описанная выше модель последовательно производится низкая смертность основной артерии SAH маленькое животное модель задержкой церебрального вазоспазма (CV) ^{6, 7, 11, 13, 15.}

Низкая смертность обеспечить более глубокое понимание анШина механизм церебрального вазоспазма ^13. Bederson и др. ^1. Использовали эндоваскулярной модели перфорации, сообщая смертности на 50% в течение 24 ч наблюдения. Veelken и др. ^16. С эндоваскулярной моделью нити перфорации ICA описано смертность 100% в нормальной группе перфузии в течение 3 ч процедуры. Эндоваскулярной модели перфорации исполнении Ли и др. ^7. Показали значительную степень спазма сосудов (BA диаметром 230 мкм ± 70) по сравнению с моделью двойного кровоизлияния в рамках того же исследования (BA диаметром 320 мкм ± 36) и смертности Перфорация модели, как сообщается, 44%. Пятикратного увеличения глутамата, а также увеличение лактата и свободных жирных кислот концентрации некоторые из негативных последствий метаболического видели несколько минут после индукции SAH, которые способствуют увеличению смертности в перфорации модели ^10.Re достаточно доказательств того, что перфорация модель нуждается в дальнейшем уточнении, чтобы контролировать высокие показатели смертности.

Смертность помощью двойного SAH модель широко варьироваться в зависимости от объема введенного крови и скорость впрыска. Мы обнаружили, что большие объемы крови и быстрые темпы инъекции, все это приводит к остановке дыхания и смерти часто во время или сразу после инъекции крови. Во время разработки модели, уровень смертности составлял от 1,5% до 47% с объема крови является наиболее важным фактором, влияющим на смертность. С совершенствованием существующей модели мы описываем здесь, мы не сообщают смертности. Есть несколько инструментов для успешного выявления и оценки степени CV, гистология, электронной микроскопии, ангиографии, МРТ и ^{5, 6, 11, 12, 15.} В нашей модели, не была предпринята попытка использовать любые другие методы, помимо гистологии.

В стремлении к лучшему пониманию, лежащих в основе патофизиологии задержки CV на модели крыс, можно провести множество будущих приложений, как расширение нашей модели. Важной целью является разработка средств, которые могли бы успешно предотвратить и лечить CV у людей. Для того, чтобы сделать это, необходимо понять сложные взаимодействия и многофакторный процесс, которые инициируют и поддерживают резюме в людях ^17. С созданием подходящей модели живучие крысы SAH, следователи могут сосредоточиться на краткосрочных и долгосрочных механизмов церебрального вазоспазма и избегать противоречивых данных типичных вторичных ишемических повреждений у крыс нейроны ^{2, 4, 8.} Мы считаем, что модель SAH описанных здесь, будет полезно следственным инструментом для понимания процессов, которые инициируют и поддерживают CV.

Нам нечего раскрывать, относящиеся к этому исследованию.

Мы хотели бы отметить усилия д-р Мэри-Лу Vallano Департамента неврологии и физиологии, за ее ценный вклад в запись для этой рукописи.