実験的くも膜下出血後の脳血管攣縮遅延を評価するための低死亡率のラットモデル

動脈瘤性くも膜下出血（SAH）は時動脈瘤破裂くも膜下腔に発生する出血です。このイベントの罹患率と死亡率が改善された治療アプローチのために減少傾向にあったが、くも膜下出血後の脳血管攣縮のリスクは、それが数年前と同じであり続けている。脳血管攣縮の開始事象を識別するために、包括的かつ再現可能な動物モデルを確立することの重要性は、バリーが1979年に実験的脳血管攣縮モデルにおけるラットの最初の使用以来、研究の焦点となっているら。ラットにおける初期の研究では、大槽内に自己血の単回注射は急性につながった（数分以内）ですが、脳血管攣縮を延期しないことを実証し ^3、6、14。ここでは、再現性の遅発性脳血管攣縮の結果が低い死亡率くも膜下出血モデルラットを特徴付ける。

目的：特性化開始イベント、病態生理学的変化や治療のための潜在的なターゲットを特定するために、ラットにおける動脈瘤性くも膜下出血（SAH）後の遅れの脳血管攣縮を示し、再現モデルを確立する。

方法：二十八雄Sprague-Dawleyラット（250 - 300gを） - くも膜下出血または生理食塩水対照任意に2つのグループのいずれかに割り当てられていた。 SAH群（n = 15）のラットくも膜下出血は、大槽内に、48時間離れて、自己血の二重注入によって誘発された。同様に、生理食塩水（N = 13）が大槽食塩水対照群の中に注入した。ラットは、第2の血液注射後5日目に屠殺し、脳を組織学的分析のために保存されていた。攣縮の程度は、NIHイメージ-Jのソフトウェアを使用して、内部の管腔の断面積を測定することにより、脳底動脈のセクションを使用して測定した。意義があったテューキー/クレイマーの統計分析を使用してテストされています。

結果：組織切片の分析後、脳底動脈内腔の断面積は、前者のグループの脳血管攣縮と一貫し、生理食塩水群よりもクモ膜下出血で小さかった。 SAH群、脳底動脈の内部領域（0.056μmの±3）（初期血注射後7日間）5日間第2の血液注射後血管攣縮から有意に小さかったで、内部領域と生理食塩水対照群と比較して（0.069 ±3、P = 0.004）。脳血管攣縮からの死亡は認められなかった。

結論：ラットダブルSAHモデルは、小さな動物モデルにおいて、脳血管攣縮の病態生理学的メカニズムを研究するために使用することができる穏やかな、サバイバル、脳底動脈の攣縮を誘発する。低く、許容死亡率は血管攣縮のメカニズムはelucidすることができるように理想的なSAHモデル動物に対して満足すべき重要な基準ですated ^7,8。モデルの更なる修正が血管攣縮および神経学的試験の増加重症度を調整するために行うことができます。

1。 0.15ミリリットル自家動脈血を注射SAH Subjectのラットの手術

1. ラットでは、ケタミン/キシラジンげっ歯類のカクテルの0.1 mg / kgを使用し、5分間静置し、麻酔をかける。
2. 十分な麻酔が後肢反射の減少によって確認された。
3. サブ後頭部周りの毛の鼻の領域に首を剃られている電子シェーバーを使用しています。
4. 動物は、手術台上に仰臥位に置かれ、尾は無菌切開を確保するためにベタジンとスワブされています。
5. ストレート1cmの正中切開を尾の腹側面に取られる
6. 尾動脈が同定され単離されるまで切開が延長されます。
7. 滅菌26ゲージのカテーテルを使用して、尾動脈にカニューレを挿入され、動脈血の0.15ミリリットルを注射器に引き込まれる。
8. 滅菌ガーゼは、切開部を封止するvetbondの適用前に、止血を確実にするために切開の周りにラップされます。
9. T彼ラットはベタジンとスワブれるサブ後頭部オーバーテーブルと剃らエリアで発生しやすいになっています。
10. 垂直正中切開·アクセスを使用すると大槽に得られる。
11. 一旦同定さ25ゲージの針を大槽内に挿入され、CSFの0.15ミリリットル、自家血液量の注入による増加頭蓋内圧力を回避するために、注射器に引き込まれる。
12. さて、尾動脈から抽出された血液の0.15ミリリットルを大槽にゆっくりと注入される。
13. 30秒は、くも膜下腔に血液凝固を確認してから、慎重に撤回するために針を付けたままにしています。
14. 止血が確保され、切開はステープルデバイスを使用して閉じられます。
15. 動物は、今や脳底動脈の周りに水槽に凍らせるために血液を許可するように20分間下の位置20°ヘッドと温暖化の面に配置されている傾向がある。
16. 1.1から1.15までの手順がバラバラに二度目の手術の48時間の間に繰り返されます。

2。 0.15ミリリットルの生理食塩水を注入しSAH題目用ラットの手術

1. ラットでは、ケタミン/キシラジンげっ歯類のカクテルの0.1 mg / kgを使用し、5分間静置し、麻酔をかける。
2. 十分な麻酔が後肢反射の減少によって確認された。
3. サブ後頭部周りの毛の鼻の領域に首を剃られている電子シェーバーを使用しています。
4. 動物は、手術台上に仰臥位に置かれ、尾は無菌切開を確保するためにベタジンとスワブされています。
5. ストレート1cmの正中切開を尾の腹側面に取られる
6. 尾動脈が同定され単離されるまで切開が延長されます。
7. 滅菌26ゲージのカテーテルを使用して、尾動脈にカニューレを挿入され、動脈血の0.15ミリリットルを注射器に引き込まれる。
8. 滅菌ガーゼは、切開部を封止するvetbondの適用前に、止血を確実にするために切開の周りにラップされます。
9. RAtは、ベタジンで描かれているサブ後頭部の上にテーブルと剃ら領域に発生しやすいになっています。
10. 垂直正中切開·アクセスを使用すると大槽に得られる。
11. 一旦同定さ25ゲージの針を大槽内に挿入され、CSFの0.15ミリリットルを注射器内に引き込まれ、サンプルが格納されます。
12. さて、通常の生理食塩水の0.15ミリリットル（37°C）を大槽にゆっくりと注入される。
13. 針は30秒間そのままにして慎重に引き抜かれる。
14. 止血が確保され、切開はステープルデバイスを使用して閉じられます。
15. 動物は、今や20分間ポジションダウン20°ヘッドと温暖化の面に配置されている傾向がある。
16. 2.1から2.15までの手順がバラバラに二度目の手術の48時間の間に繰り返されます。

3。ラットサクリファイス

1. 二度目の手術後5日目に、ラットは心臓灌流によって犠牲にされています。
2. ラットは致死量（0が与えられている致命的なプラス（VORTECHファーマ株式会社、ディアボーン、ミシガン州）の0.​​2ミリリットル/キログラム）
3. 垂直正中切開で、腹腔に接近され、腹膜が開かれます。
4. 前方開胸が行われ、心臓を露出させる。
5. リン酸緩衝液（PBS pH7.4及び37℃）に接続され、26ゲージのカテーテルを用いた動物は、血液の排出された後、4％パラホルムアルデヒドで灌流される。
6. 十分な血流を確保した後、血流が停止され、ラットを断頭台に引き渡されます。
7. 断頭後、骨骨鉗子は、脳の除去のための頭蓋を除去するために使用されます。
8. 脳と脳幹は慎重に48時間頭蓋から抽出され、4％パラホルムアルデヒド溶液に入れ、4℃で保存されています。

4。攣縮を評価するためのセクションの作成

1. 今では4日間の30％スクロースに沈めれたラットの脳は目に持って来られるセクショニングのeはクライオスタット。
2. 一度凍結保護し、12μmの切片を、被験者間の一貫性を確保するための出発点として前下小脳動脈（AICA）で、クライオスタットを使用して作成します。
3. 20セクションは上小脳動脈（SCA）で終わる、それぞれの動物のために作成されます。
4. 切片はスライドガラス上に置き、組織学的手法を用いて血管攣縮のために評価が行われ

上記のプロトコルの中で、我々が以前に文献に記載されているものよりも良いモデルの特性を必要とすると考えているいくつかの手順があります。ここでは、再現性の低死亡率脳血管攣縮小動物モデルを実現し、正しく行われない場合は、このモデルに関連付けられている潜在的な落とし穴を避けるために不可欠なステップに焦点を当てる。

1。尾動脈からの自己採血：

尾動脈における血管カテーテルを慎重に配置するには、モデルに不可欠な最初のステップです。 図A-1は、ラットの尾動脈の26ゲージのカテーテルの配置を示しています。これは、最小限の外傷、出血量との良好な配置を表します。血管カテーテルの適切な配置が良い返血することによって確認することができる。

2。大槽に自己血注入：

tの深い解剖環椎後頭膜は、光沢のある白い膜（ 図A-2）として可視化されるまで、彼は後頭下部が実行されます。大槽25ゲージ針で膜を通して穿刺を介してアクセスされます。針の撤退後、血液のプーリングは、大槽のくも膜下腔の中に自己血ステーの十分な音量を確保するために、注意すべきである。我々のモデルは自己血の比較的少量（0.15ml）を、既存のモデルと比較すると、プーリングがくも膜下腔に血液の効果が有効でないボリュームをもたらすかもしれません使用しているため、環椎後頭膜の外側側面に血液が貯留する過度のは望ましくありません。血液の量の増加は、頻繁に注射後まもなく頭蓋内圧亢進と血液製剤から、おそらく呼吸不全をもたらした。くも膜下腔の動脈の周りに血のコレクションは、実験的脳血管攣縮^8を開始するためにいくつかの可能な方法の一つである。最初の手術から穿刺部位が頻繁に表示されているものの、二度目の手術の時に、環椎後頭膜は時折、視覚化することは難しいかもしれません。

3。標本

図A-3に示すことなく（ 図-3A）と（ 図A-3B）クモ膜下出血のラットから取り出した脳幹標本。 図A-3Bの脳底動脈の周りにくも膜下腔の血液のコレクションに注目してください。これは、脳底動脈の攣縮を誘発するのに十分な血液量を表しています。 図-3Aおよび図A-3Bの矢印は、脳底動脈（BA）の範囲を定義します。切片（12μm）をAICAからSCAに伸びるBAの長さから取られています。

4。組織切片

二十節は、SAHと生理食塩水コントロールの各脳底動脈片を分析したグループ（ 図A-4）。脳底動脈の内部の管腔の断面積が小さくなったと血管攣縮を示唆する内弾性板のかなりのコルゲーションは、SAH群（ 図-4A）で、あった。生理食塩水対照群の脳底動脈は、地域の方が大きかったとコルゲート内弾性板（ 図A-4B）を持っていませんでした。 2群間の面積の減少の程度を定量化は、 図5に記載されています。これらの研究は、このSAHモデルは組織学的方法を用いて評価することができる脳血管攣縮を生成しないことを確認します。管腔の断面積は、組織処理、時折船のアモルファス断面の結果は、それが困難な測定とデータ解析に使用する適切な直径を決定するために行うので、血管攣縮を決定するために使用された。すべての測定は、NIHイメージ-Jのソフトウェアを用いて行った。 SAH群では、脳底動脈である血管攣縮に起因する、（内部= 0.056μmの±3）であった（p = 0.004 = 0.069μmの±3内部）生理食塩水対照群よりも有意に小さかった。意義はテューキー/クレイマーの統計的分析を用いて試験した。 表1は、両方のグループのために計算された標準偏差と標準誤差でこれらの値を示しています。

図1 26ゲージのカテーテルの挿入は、尾動脈に挿入されます。

図2ラットにおける環椎後頭膜（矢印）の外観。

図3ラットブラジャーの腹面（A）と（B）が、くも膜下出血せずに脳底動脈（矢印）をinstem。

図4：SAH（A）と生理食塩水コントロール（B）のグループで脳底動脈を示す組織切片。脳底動脈の内腔の断面積が小さく、内弾性板は血管攣縮と一貫性の両方、SAH群で（矢印）が段ボールであることに注意してください。

図5 SAHと生理食塩水対照群との間脳底動脈内腔の断面積の比較。

表1。手段とSAHとsalien対照群の標準偏差を算出しています。

表2。公表ダブルくも膜下出血のラットモデルの概要。

げっ歯⁸よりも類似遺伝子組成と人間への解剖学的特徴を有する霊長類、より密接に遅延した脳血管攣縮のイベントを模倣し、より簡単に動脈の変更を監視する非侵襲的な画像診断装置（MRI、血管造影検査）を受けることができ、。しかし、霊長類モデルではコスト的に不可能と小動物モデルよりも複雑なケアと倫理的な問題に関連付けられています。開発されてきた小動物SAHモデルは以前にSAHを誘導する3つの方法に焦点を当てている：1）血管内動脈の血液がくも膜下腔に脱出し、負傷した動脈周囲収集することが頭蓋内動脈の穿孔、2）動脈の外科的曝露とローカル自家血栓注入;くも膜下腔への血液の⁸ 3）ダイレクトインジェクション（自家またはドナー）。すべてのモデルには、独自の長所と短所があります。例えば、血管穿孔モデル​​が最も密接aneurysのイベントを模倣mが破裂しかし外科的アプローチは、人工であり、動脈瘤くも膜下出血の典型的な人間のプレゼンテーションのイベントを模倣していないものの、非常に高い死亡率と早期血管攣縮に関連付けられています。私たちがここで説明することを直接噴射モデルは、血管穿孔モデル​​よりも低い死亡率を持っているとより密接に開放外科モデルよりもヒトSAH状態を模倣しています。同様のモデルは、以前に記載されているが、我々はモデルのニュアンスからの潜在的な合併症ためSAHモデルの開発と大規模な学習曲線を持っていた、よく以前にどこに記述していませんでした。これは、将来の研究者がより簡単に再現可能なSAHモデルを使用することができるようにより良いこれらの潜在的なトラップを定義することが目的だった。

我々は遅発性脳血管攣縮の影響を研究するための簡単​​かつ費用対効果のモデルを提案する一方で、その限界がないわけではありません。急速にくも膜下腔から血液をクリアするためにラットの能力のために、および脳動脈自体の解剖学的相違は、ラットを遅延くも膜下出血^6,8の研究のための貧弱なモデルが考えられている。モデルの結果に影響を与えるであろういくつかの重要なステップがあります。ケタミン/キシラジンカクテルの投与量は、十分な麻酔を確実にするために0.1ミリリットル/ kgを超えてはならない。私たちは血のプーリングが攣縮^9、13、15の程度の差につながることを指摘しているような大槽内に注入した後に血液が貯留する任意の量を注意して文書化する必要があります。他の研究では、離れて血24時間後の第二の注射は血管攣縮⁶のより重要度を誘発することができる、我々はそれが血管攣縮はめったにSAH後の日3の前に発生していないヒトでは脳血管攣縮の時間経過を模倣しないと信じていることが示されている。より密接に今回のコースを模倣するために、我々は最初の注射後の血中48時間の二回目の注射をしました。

我々はdescribモデルの潜在的な変更eは、くも膜下腔への血液の大きいボリュームを注入し、血液のソースを変更し、二回目の注射の時間経過を変えると、第2の血液注射した後、さらに外に5日以上の犠牲があります。以前のモデルでは、そのような変形は、 表2に、上記記載されています。我々のモデル開発の過程で、我々は、両方のシングルとダブルインジェクションモデルを使用して二重SAHモデルと注射の間の時間を変化させ、血液の様々なボリュームをテストし、溶血血の効果をテストし、動脈および自家ドナーの血液対対静脈を試してみました注射。これらの変更には、それぞれ遅延攣縮をテストするために使用できないモデルの結果の合併症を引き起こす。モデルは一貫して遅延した脳血管攣縮（CV）は^{6、7、11、13、15}の死亡率が低いの脳底動脈SAH小動物モデルを生産し、上記の。

低死亡率には、専用のより完全な理解を可能にする脳血管攣縮¹³のタイヤ機構。 Bederson ら ^1は、観察の24時間以内に50％の死亡率を報告し、血管穿孔モデルを使用している。 Veelken ら ¹⁶彼らの血管内フィラメントのICA穿孔モデルでは、手順の3時間以内に正常灌流群では100％の死亡率を説明した。 Lee ら ⁷による血管穿孔モデルは、同じ研究内ダブル出血モデル（BAの直径320μmの±36）と比較して血管攣縮の重要度（BAの直径230μmで±70）との死亡率を示した穿孔モデル​​が44パーセントであることが報告された。五倍グルタミン酸レベルの増加、ならびに乳酸、遊離脂肪酸濃度の上昇は、穿孔モデル¹⁰で死亡率の増加に寄与SAHの誘導後の数分を見て有害な代謝効果の一部です。再穿孔モデル​​は高い死亡率を制御するために、更なる改良が必要であることをサポートするのに十分な証拠である。

ダブルSAHモデルを用いて死亡率が広く、血液注入し、注入速度の量に応じて異なります。我々が発見した血液のより大きなボリュームとより速い射出速度、血液注入中または直後に呼吸停止し、頻繁に死にすべてのリード。モデル開発中に、死亡率は死亡率に影響を与える最も重要な因子である血液量の1.5％から47％に及んだ。私たちがここで説明する現行モデルの完成度で、私たちは全く死亡が報告されていない。組織学、電子顕微鏡検査、血管造影、MRIの^{5、6、11、12、15、}正常に識別し、CVの程度を評価するために利用可能ないくつかのツールがあります。我々のモデルでは、試みは組織型とは別に、他のメソッドを使用するようになされなかった。

より良い理解のための探求でラットモデルにおける遅延CVの病態生理学の基礎となる、1は私たちのモデルの拡張として、将来のアプリケーションの無数を引き受けることができる。本質的な目標は、正常ヒトでCVを予防し、治療することができる薬剤の開発である。 1が開始と人間¹⁷にCVを支える複雑な相互作用と多因子プロセスを理解する必要があり、そのためには。適切な存続SAHモデルラットの設立により、研究者は脳血管攣縮の短期的および長期的なメカニズムに注目し、ラットの神経細胞^2、4、8の二次的虚血性障害の典型的な重複データを避けることができます。我々は、ここで説明SAHモデルがCVを開始し、維持するプロセスを理解するために有益な調査ツールになると思います。

我々は、この研究に係る開示することは何もありません。

我々は、この原稿のために書き上げるの彼女の貴重な入力のために博士メアリー·ルー·Vallano、神経科学と生理学教室の取り組みを承認したいと思います。