실험 Subarachnoid의 출혈 후 뇌 지연 Vasospasm을 평가하기 위해 낮은 사망 쥐 모델

Aneurysmal subarachnoid 출혈 (SAH)은 때 동맥 파열 subarachnoid 공간에 발생합니다 출혈이 있습니다. subarachnoid의 출혈이 몇 년 전 예전처럼 될 수 계속 한 후이 행사의 병적 상태와 사망률이 개선 치료 방법으로 인해 감소, vasospasm의 위험에 왔지만. 뇌성 vasospasm의 시작 이벤트를 식별하기 위해 포괄적이고 재현 동물 모델을 확립의 중요성은 배리의 1979 년 실험 vasospasm 모델 쥐의 첫 번째 사용하기 때문에 연구의 초점을했습니다 외. 쥐의 초기 작업은 cisterna 마그나에 autologous 피 한 분사가 급성으로 이어 (분 이내)하지만 뇌성 vasospasm을 지연하지 않는 것이 입증 ^{3, 6, 14}. 여기 낮은 사망률 SAH 쥐 모델을 특성화 그 재현 지연 vasospasm의 결과입니다.

목표 : 특징과 시작 이벤트, pathophysiological 변경 및 치료를 위해 잠재적 인 공격 대상을 파악하기 위해 쥐의 aneurysmal subarachnoid 출혈 (SAH) 이후 지연 뇌성 vasospasm을 보여줍니다 재현 모델을 설정합니다.

방법 : 28 남성 Sprague-Dawley 쥐 (250~300g이) - SAH 또는 생리 제어 임의로 두 그룹 중 하나에 할당되었습니다. SAH 그룹 (N = 15)에서 쥐의 subarachnoid 출혈은 cisterna 마그나로, 48 시간 간격, autologous의 피를 두 번 주입에 의해 유도되었다. 마찬가지로, 정상적인 생리 (N = 13)은 cisterna 마그나 생리 제어 그룹의에 주입했다. 쥐가 두 번째 혈액 주입 후 일 곳곳에서 희생되었고 머리는 조직 학적 분석을 위해 보존되었습니다. vasospasm의 정도는 NIH 이미지-J 소프트웨어를 사용하여 내부 luminal 단면적을 측정하여, 뇌 바닥 동맥의 섹션을 사용하여 측정되었다. 의미했습니다Tukey / 크레이머의 통계 분석을 사용하여 테스트했습니다.

결과 : 조직 학적 섹션의 분석 후, 뇌 바닥 동맥 luminal 단면적은 이전 그룹에 뇌성 vasospasm과 일치, 생리 그룹에서보다 SAH의 작은습니다. SAH 그룹에서 뇌 바닥 동맥 내부 지역 (0.056 μm ± 3) 내부 공간과 생리 대조군 (0.069에 비해 5 일 두 번째 혈액 주입 (7 일 초기 혈액 주입 후) 후 vasospasm에서 훨씬 작했다 ± 3, P = 0.004). 뇌성 vasospasm로부터 mortalities이 없습니다.

결론 : 쥐를 두 번 SAH 모델은 작은 동물 모델에서 뇌성 vasospasm의 pathophysiological 메커니즘을 연구하는 데 사용할 수있는 순한, 생존, 뇌 바닥 동맥 vasospasm을 유도한다. 낮은 허용 사망률이 vasospasm의 메커니즘이 elucid 할 수 있도록 이상적인 SAH 동물 모델에 대한 만족해야하는 중요한 기준입니다ated ^{7, 8.} 모델의 추가 수정은 vasospasm과 신경 시험의 증가 정도에 대한 조정 만들 수 있습니다.

1. SAH 제목에 쥐 수술 0.15 ML Autologous 동맥혈으로 주사

1. 쥐가 0.1 밀리그램 / Xylazine / 케타민 쥐 칵테일 kg을 사용하고 5 분에 앉아서 할 수 anesthetized 있습니다.
2. 충분한 마취는 뒷다리 반사의 감소에 의해 확인된다.
3. 전자 면도기를 사용하여 하위 뒤통수 지역 주변 머리카락 영역을 코 목은 면도 있습니다.
4. 동물은 수술 테이블에 위로 향한 위치와 꼬리는 살균 절개를 보장하기 위해 betadine을 채취합니다.
5. 직선 1cm의 중간 선 절개는 꼬리의 복부 측면에서 이루어집니다
6. 꼬리 동맥이 확인하고 격리 될 때까지 절개가 연장됩니다.
7. 멸균 26 게이지 카테터를 사용하여 꼬리 동맥 cannulated되어 동맥 혈액의 0.15 ML은 주사기로 배출된다.
8. 멸균 거즈은 절개를 밀봉 할 수있는 vetbond의 적용 전에 지혈을 보장하기 위해 절개 감싸 있습니다.
9. 티그는 쥐가 betadine으로 채취되는 하위 뒤통수 지역을 통해 테이블​​과 면도 지역에 발생하기 쉬운 설정되어 있습니다.
10. 수직 중간 선 절개 액세스를 사용하면 cisterna 마그나에 받고있다.
11. 일단 확인 25 게이지 바늘은 cisterna 마그나에 삽입되어 CSF의 0.15 ML은 autologous 혈액 양의 주입으로 증가 intracranial 압력을 피하기 위해 주사기로 배출된다.
12. 이제 꼬리 동맥에서 추출한 혈액의 0.15 ML은 cisterna 마그나에 천천히 주입합니다.
13. 주사 바늘을주의 깊게 철회 다음 subarachnoid 공간에서 응고하기 위해 30 초를위한 자리에 남아 있습니다.
14. 지혈이 보장되고 절개는 stapling 장치를 사용하여 문을 닫습니다.
15. 동물은 이제 뇌 바닥 동맥 주변의 cisterns에 얼고, 혈액을 수 있도록 20 분에 위치 아래로 20 °의 머리 온난화 표면에 발생하기 쉬운 배치됩니다.
16. 1.1-1.15 단계가 분리되어 두 번째 수술 48 시간 동안 반복된다.

2. SAH 제목에 쥐 수술 0.15 ML의 식염과 양념을 넣은

1. 쥐가 0.1 밀리그램 / Xylazine / 케타민 쥐 칵테일 kg을 사용하고 5 분에 앉아서 할 수 anesthetized 있습니다.
2. 충분한 마취는 뒷다리 반사의 감소에 의해 확인된다.
3. 전자 면도기를 사용하여 하위 뒤통수 지역 주변 머리카락 영역을 코 목은 면도 있습니다.
4. 동물은 수술 테이블에 위로 향한 위치와 꼬리는 살균 절개를 보장하기 위해 betadine을 채취합니다.
5. 직선 1cm의 중간 선 절개는 꼬리의 복부 측면에서 이루어집니다
6. 꼬리 동맥이 확인하고 격리 될 때까지 절개가 연장됩니다.
7. 멸균 26 게이지 카테터를 사용하여 꼬리 동맥 cannulated되어 동맥 혈액의 0.15 ML은 주사기로 배출된다.
8. 멸균 거즈은 절개를 밀봉 할 수있는 vetbond의 적용 전에 지혈을 보장하기 위해 절개 감싸 있습니다.
9. RAt는 betadine으로 칠하는 하위 뒤통수 지역 위에 테이블과 면도 지역에 발생하기 쉬운 설정되어 있습니다.
10. 수직 중간 선 절개 액세스를 사용하면 cisterna 마그나에 받고있다.
11. 일단 확인 25 게이지 바늘은 cisterna 마그나에 삽입되어 CSF의 0.15 ML은 주사기로 철회되고 샘플이 저장됩니다.
12. 이제 정상적인 생리의 0.15 ML (37 ° C)은 cisterna 마그나에 천천히 주입합니다.
13. 바늘은 30 초 동안 장소에두고 조심스럽게 취소됩니다.
14. 지혈이 보장되고 절개는 stapling 장치를 사용하여 문을 닫습니다.
15. 동물은 이제 20 분에 위치 아래로 20 °의 머리 온난화 표면에 발생하기 쉬운 배치됩니다.
16. 2.1-2.15 단계가 분리되어 두 번째 수술 48 시간 동안 반복된다.

3. 쥐의 희생

1. 두 번째 수술 후 5 일에서 쥐가 심장 재관류에 의해 희생되어 있습니다.
2. 쥐가 치명적인 복용량 (0 주어집니다치명적인 플러스의 0.2 ML / kg) (VORTECH 제약 LTD., 디어, MI)
3. 수직 중간 선 절개를 통해 복강이 접근되고 복막가 열립니다.
4. 앞 thoracotomy이 수행되고 심장이 노출됩니다.
5. 동물이 피가 다 말라되어 있으며 다음 4 % paraformaldehyde와 perfused되는 인산 완충 용액 (PBS 산도 7.4과의 37 °)에 연결된 26 게이지 카테터를 사용합니다.
6. 적절한 재관류을 보장 후, 재관류이 중지되고 쥐가 목 베기 테이블로 배달됩니다.
7. 목 베기 후, 뼈 rongeur는 뇌 제거를위한 두개골을 제거하는 데 사용됩니다.
8. 뇌와 brainstem는 신중하게 48 시간 동안 두개골 천장에서 추출하고 4 % paraformaldehyde 솔루션에 배치, 4 ° C에 저장됩니다.

4. Vasospasm을 평가하는 섹션을 만들

1. 지금 4 일 동안 30 %의 자당에 잠겨 된 쥐의 뇌는 일에 배달됩니다sectioning에 대한 전자 그라 이오 스탯.
2. 일단 cryoprotected, 12 μM 섹션은 간 주제 일관성을 보장하기 위해 기점으로 앞쪽 하부 소뇌 동맥 (AICA)로, 그라 이오 스탯을 사용하여 만들어집니다.
3. 20 절은 수 페리 어 소뇌 동맥 (SCA)에 종료, 각 동물에 대해 생성됩니다.
4. 섹션은 유리 슬라이드에 배치하고 조직 학적 방법론을 사용하여 vasospasm에 대한 평가

위에 설명 된 프로토콜 내에서, 우리는 이전에 문학에 설명 된 것보다 모델의 더 나은 특성을 필요로한다고 생각되는 몇 가지 단계가 있습니다. 여기 재현 낮은 사망률 뇌성 vasospasm 작은 동물 모델을 달성하고 제대로하지 않을 경우이 모델과 관련된 잠재적 인 함정을 피하기 위해 필수적입니다 단계에 초점을 맞 춥니 다.

1. 꼬리 동맥의 Autologous 혈액 추첨 :

꼬리 동맥의 angiocatheter주의 위치는 모델에 필수적인 첫 단계입니다. 그림-1 쥐의 꼬리 동맥의 26 게이지 카테터의 위치를 보여줍니다. 이 최소한의 외상과 출혈이있는 좋은 위치를 나타냅니다. angiocatheter의 적절한 위치는 좋은 혈액 수익으로 확인 할 수 있습니다.

2. Cisterna 마그나에 Autologous 혈액의 주입 :

t의 깊은 해부atlanto - 뒤통수 막이 반짝이는 흰 막 (그림-2)로 시각화 될 때까지 그 아래쪽 뒤통수 밑 지방이 수행됩니다. cisterna 마그나는 25 게이지 바늘로 막을 통해 구멍을 통해 액세스됩니다. 혈액 풀링 바늘의 철회를 주목해야합니다 후, autologous 혈액의 충분한 양을 확보하는 것은 cisterna 마그나의 subarachnoid 공간 내에서 유지됩니다. 우리의 모델은 기존 모델과 풀링이 subarachnoid 공간에서 혈액의 효과 볼륨을 초래할 수에 비해 autologous 혈액의 상대적으로 낮은 볼륨 (0.15 ML)을 사용하기 때문에 atlanto-뒤통수 막 바깥 부분에 혈액의 풀링 과도한는 바람직하지 않다. 혈액의 높은 볼륨 자주 곧 주사 후 높은 intracranial 압력과 혈액 제품의 아마 호흡하게되었습니다. subarachnoid 공간에서 동맥 주위에 혈액의 컬렉션은 실험 vasospasm에게 ⁸ 시작하는 몇 가지 방법 중 하나입니다 . 첫 번째 수술에서 구멍 사이트가 종종 볼 수 있지만 두 번째 수술 당시 atlanto-뒤통수 막 가끔, 시각화하기 어려울 수 있습니다.

3. 표본

그림 3은없이 (그림-3A) 및 (그림-3B) subarachnoid 출혈이있는 쥐에서 검색 brainstem의 표본을 보여줍니다. 그림 - 3B의 뇌 바닥 동맥 주변의 subarachnoid 공간에서 혈액의 컬렉션을합니다. 이것은 뇌 바닥 동맥의 vasospasm를 유도하기 위해 혈액의 충분한 볼륨을 나타냅니다. 그림 - 3A 및 그림-3B의 화살표는 뇌 바닥 동맥 (BA)의 범위를 정의합니다. 제 (12 μm)은 AICA에서 SCA까지 연장 BA의 길이에서 가져옵니다.

4. 조직 학적 제

스물 섹션은 SAH와 생리 제어 각 뇌 바닥 동맥의 표본에 대해 분석 하였다그룹 (그림 4). 뇌 바닥 동맥의 내부 luminal 단면적이 작은이었고 vasospasm의 암시 내부 탄성 얇은 판의 상당 주름은 SAH 그룹 (그림-4A)에 있었다. 생리 컨트롤 그룹에서 뇌 바닥 동맥이 지역의 큰이었고 골판지 내부 탄성 얇은 판 (그림-4B)가 없습니다. 두 그룹 사이의 지역에서 감소의 정도의 정량화는 그림 5에서 찾을 수 있습니다. 이 연구는이 SAH 모델은 조직 학적 방법을 사용하여 평가 할 수 뇌성 vasospasm을 생산 않는 있는지 확인합니다. Luminal 단면 영역은 조직 처리 때때로 혈관의 비정질 크로스 섹션에서 결과, 어려운 측정 및 데이터 분석에 사용할 적절한 직경을 결정하기 위해 제작하기 때문에 vasospasm를 결정하는 데 사용되었다. 모든 측정은 NIH 이미지-J 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다. SAH 그룹에서 뇌 바닥 동맥은vasospasm으로 인해, (내부 = 0.056 μm ± 3) (P = 0.004 = 0.069 μm ± 3 내부) 생리 통제 집단보다 훨씬 작은습니다. 의의는 Tukey / 크레이머의 통계 분석을 사용하여 테스트되었습니다. 표 1은 두 그룹에 대한 계산 표준 편차 및 표준 오류가있는 이러한 값을 보여줍니다.

그림 1. 26 게이지 카테터의 삽입은 꼬리 동맥에 삽입됩니다.

그림 2. 쥐의 atlanto - 뒤통수 막 (화살표)의 외관.

그림 3. 쥐 브라의 복부 표면(A) 및 (B), SAH없이있는 뇌 바닥 동맥을 (화살표) instem.

그림 4. SAH (A) 및 염분 제어 (B) 그룹에서 뇌 바닥 동맥을 보여주는 조직 학적 섹션을 제공합니다. 뇌 바닥 동맥의 luminal 단면적을 작게하고 내부 탄성 얇은 판은 vasospasm과 일치 모두 SAH 그룹의 (화살표) 골판지라는 점에 유의하십시오.

그림 5. SAH와 생리 제어 그룹 사이 뇌 바닥 동맥 luminal 단면 지역의 비교.

표 1. 수단과 SAH와 salien 제어 그룹의 표준 편차를 계산합니다.

출판 더블 subarachnoid 출혈 쥐 모델 표 2. 요약.

영장류에 더 유사한 유전 조성과 해부학 적 특징을 갖는 인간 더 자세히 지연 뇌성 vasospasm의 사건을 모방하고보다 쉽게 쥐 ^8보다 동맥 변경 사항을 모니터링하는 비 침습적 영상을 (MRI 및 혈관 조영술) 받아야 할 수 있습니다. 그러나, 영장류 모델은 비용 금지 및 소형 동물 모델보다 더 복잡한 관리 및 윤리적 문제와 연결되어 있습니다. 개발 된 소형 동물 SAH 모델은 이전에 SAH를 일으킬 세 가지 방법에 초점을 맞추고 있습니다 : 1) Endovascular 동맥 혈액이 subarachnoid 공간으로 탈출하고 부상당한 동맥 주위에 수집 할 수 있도록 허락 해 intracranial 동맥의 천공 2) 동맥의 외과 노출 지역 autologous 응고 분사, subarachnoid 공간 ^8로 피 3) 직접 분사 (autologous 또는 기증자). 모든 모델은 자신의 장점과 단점이 있습니다. 예를 들어, endovascular 천공 모델은 가장 가까운 aneurys의 이벤트를 모방수술 방법은 인공하고 aneurysmal SAH의 전형적인 인간의 프리젠 테이션의 이벤트를 모방하지 않는 동안 m 파열하지만은 매우 높은 사망률과 조기 vasospasm와 연결되어 있습니다. 우리가 여기서 설명하는 직접 분사 모델은 endovascular 천공 모델보다 낮은 사망률을 가지고 더 가깝게 개방 수술 모델보다 인간 SAH 조건을 모방 않습니다. 유사한 모델이 이전에 설명 된 있지만 모델의 뉘앙스에서 잠재적 인 합병증이 잘 곳 이전에 설명되지 않아, 우리는 SAH 모델 개발을 큰 학습 곡선을했다. 그것은 미래의 조사가 더 쉽게 재현 SAH 모델을 사용할 수 있도록 더 나은 이러한 잠재적 인 함정을 정의하기위한 의도했다.

우리가 지연 vasospasm의 효과를 연구 할 수있는 간단하고 비용 효율적인 모델을 제안 있지만, 그 제한없이하지 않습니다. 빠르게 subarachnoid 공간에서 혈액을 취소 할 수 쥐의 능력으로 인해,그리고 대뇌 동맥 자체의 해부학 적 차이는, 쥐가 지연 subarachnoid 출혈 ^{6, 8의} 연구 가난한 모델로 간주됩니다. 모델의 결과에 영향을 줄 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 케타민 / Xylazine 칵테일의 용량은 충분한 마취을 보장하기 위해 0.1 ML / kg을 초과 할 수 없습니다. 우리가 피를 풀링하는 vasospasm ⁹ 낮은 ^{정도, 13, 15로} 연결 있다고 지적했습니다대로 cisterna 마그나에 주입 한 후 혈액 풀링의 금액이 언급하고 문서화해야한다. 다른 연구는 혈액 24 시간의 두 번째 주사가 떨어져 vasospasm ^6보다 큰 학위를 일으킬 수 것으로 나타났습니다, 우리는 vasospasm 거의 SAH 후 하루에 세번 이전 발생하지 어디에 인간 vasospasm의 시간 과정을 모방하지 않을 생각합니다. 보다 긴밀하게이 시간 코스를 모방하기 위해 우리는 먼저 주사 한 후 혈액 48 시간의 두 번째 주사를했다.

우리가 describ 모델의 잠재적 인 수정e는, subarachnoid 공간에 혈액의 큰 볼륨을 주입 혈액의 소스를 변경, 두 번째 분사에 대한 시간 코스를 변경하고, 두 번째 혈액 주입 한 후 추가로 5 명 일 이상 희생이 포함되어 있습니다. 이전 모델에서 이러한 변화는 표 2 위 확인할 수 있습니다. 우리의 모델 개발의 과정에서, 우리는 단일 및 이중 사출 모델을 사용하는 두 SAH 모델 주사 사이의 시간을 변경, 혈액의 다양한 볼륨을 테스트 hemolysed 혈액의 효과를 테스트 동맥과 autologous 기증자 혈액 대 비해 정맥을 시도 주사. 이 수정의 각 지연 vasospasm을 테스트하기위한 사용할 모델 결과 합병증으로 이어질. 모델은 지속적으로 지연 뇌성 vasospasm (CV) ^{6, 7, 11, 13, 15의} 낮은 사망률의 뇌 바닥 동맥 SAH 작은 동물 모델을 제작 위에서 설명한.

낮은 사망률 요금은 전용의 더 철저한 이해 할 수 있도록뇌성 vasospasm ¹³ 타이어 메커니즘. Bederson 외. ¹ 관찰 24 시간 이내에 50 % 사망률을보고, endovascular 천공 모델을 사용했습니다. Veelken 외. ^16의 endovascular 필라멘트 ICA의 천공 모델이 절차의 3 시간 이내에 정상 재관류 그룹에 100 % 사망률을 설명했다. 리 외. ^7에 의해 수행 endovascular 천공 모델은 동일한 연구에서 두 뇌출혈 모델 (BA 직경 320 μm ± 36)에 비해 vasospasm의 상당 학위 (BA 직경 230 μm ± 70), 그리고에 대한 사망률을 보여 주었다 천공 모델을 44 %로보고되었다. 오배의 glutamate 수준 증가뿐만 아니라 젖산과 무료 지방산 농도의 증가는 천공 모델 ^10의 증가 사망률에 기여 SAH의 유도 후 몇 분을 본 해로운 신진 대사 효과 중 일부입니다.다시 천공 모델은 높은 사망률을 제어하기 위해 추가 상세 검색을 필요로하는 지원하는 충분한 증거입니다.

이중 SAH 모델을 사용 사망률은 광범위하게 혈액 주입 및 주입 속도의 양에 따라 다릅니다. 우리는 발견 혈액의 큰 볼륨과 빠른 사출 속도, 혈액 주입하는 동안 또는 직후 호흡기 체포하고 자주 죽음에 대한 모든 리드. 모델 개발 과정, 사망률은 사망률에 영향을 미치는 가장 중요한 요소되는 혈액 양을 1.5 %에서 47km %로 나와 있습니다. 우리가 여기서 설명하는 현재의 모델의 완성으로, 우리는 mortalities를보고하지 않습니다. 조직학, 전자 현미경, 혈관 조영술 및 MRI ^{5, 6, 11, 12, 15,} 성공적으로 식별하고 CV의 정도를 평가하는 데 사용할 수 몇 가지 도구가 있습니다. 우리의 모델에서는 어떤 시도 조직학를 제외한 다른 방법을 사용하지했습니다.

이해를위한 탐구에쥐 모델에서 지연 CV의 pathophysiology 근간, 하나는 우리의 모델의 확장으로 향후 응용 프로그램의 무수한을 수행 할 수 있습니다. 필수 목표는 성공적으로 방지하고 인간의 CV를 취급 할 수 에이전트의 개발입니다. 하나는 시작과 인간 ^17에 CV를 부양하고 복잡한 상호 작용과 multifactorial 과정을 이해해야합니다 이렇게하려면. 적절한 살릴 수 SAH 쥐 모델의 설립을 통해 수사관들이 뇌성 vasospasm의 짧은 및 장기 메커니즘에 초점을하고 쥐 뉴런 ^{2, 4, 8} 차 허혈성 손상의 전형적인 충돌 데이터를 방지 할 수 있습니다. 여기에 설명 된 SAH 모델 CV를 시작하고 유지 프로세스의 이해를위한 유익한 조사 도구가 될 것이라고 생각합니다.

이 연구에 관한 공개 할 수 없어요.

우리는이 원고에 쓰기 그녀의 귀중한 입력에 박사 메리 - 루 Vallano, 신경 과학 및 생리학학과의 노력을 인정하고 싶습니다.