Тест для измерения активности Кишечной палочки Индуцибельной Лизин Decarboxyase

Активности индуцибельной лизина декарбоксилазы контролируется путем взаимодействия подложки L-лизина и кадаверина продукт с 2,4,6-trinitrobenzensulfonic кислотой с образованием аддуктов, которые дифференциальных растворимость в толуоле.

Кишечная палочка является кишечных бактерий, которые способны растущих в широком диапазоне рН (рН 5 - 9) ¹ и, невероятно, способен выжить крайне кислоты подчеркивает, включая проход через млекопитающих желудок, где рН может опуститься до как рН 1 - ² 2. Чтобы включить такой широкий ассортимент кислотных выживания рН, Е. палочка обладает четырьмя различными индуцибельной аминокислот декарбоксилазы кислоту, которая декарбоксилирование субстрата их аминокислот в протон-зависимым образом повышая внутренние рН. Декарбоксилазы включают декарбоксилазы глутаминовой кислоты Гада и GadB ^3, аргинин декарбоксилазы Adia ^4, лизин декарбоксилазы LdcI ^{5, 6} и орнитиндекарбоксилазы SPEF ^7. Все эти ферменты используют пиридоксаль-5'-фосфат в качестве со-фактор ⁸ и функционировать вместе с внутренней мембраны субстрат-продукт антипортеры, которые удаляют декарбоксилирования продукции на внешнем носителе, в обмен на свежий субстрат ^2. В случае LdcI, лизин-кадаверин антипортера называется CadB. Недавно мы определили рентгеновского кристаллической структуры LdcI до 2,0 Å, и мы обнаружили, роман малые молекулы связаны с LdcI строгие гуанозин регулятор ответа 5'-дифосфат, 3'-дифосфат (ppGpp) ^14. Строгий ответ возникает, когда экспоненциально растущих клеток опыт питательных лишения или один из ряда других напряжений ^9. В результате клетки производят ppGpp что приводит к сигнальный каскад кульминацией переход от экспоненциального роста к стационарным фазе роста ^10. Мы показали, что ppGpp является специфическим ингибитором LdcI ^14. Здесь мы опишем лизина анализа декарбоксилазы, модифицированный из анализа разработан Фан соавт. ^11, которые мы использовали для определения активности LdcI и эффект pppGpp / ppGpp на эту деятельность. Реакция LdcI декарбоксилирования удаляет α-карбоксильной группы L-лизина и производит углекислый газ и полиаминов кадаверин (1,5-diaminopentane) ^5. L-лизина и кадаверина может реагировать с 2,4,6-trinitrobenzensulfonic кислоты (TNBS) при высоких рН для получения N, N-bistrinitrophenylcadaverine (ТНП-кадаверин) и N, N-bistrinitrophenyllysine (ТНП-лизин), соответственно ^11. ТНП-кадаверин могут быть отделены от ТНП-лизин, как бывший растворим в органических растворителях, таких как толуол в то время как последняя не является (см. Рисунок 1). Линейный диапазон анализа был определен эмпирически с использованием очищенных кадаверин.

1) Реактивы и оборудование

1. Во-первых, подготовить следующие три решения: 1 мл раствора которого состоит из 8 мМ L-лизин, 100 ммоль натрия 2 - (N-морфолино) ethanesulphonic кислоты (MES), рН 6,5, 0,2 мМ нуклеотид, где нуклеотид либо: гуанозин дифосфат (ВВП), гуанозин трифосфата (ГТФ), гуанозин-5'-дифосфат, 3'-дифосфат (ppGpp), или гуанозин-5'-трифосфата, 3'-дифосфат (pppGpp), 0,1 мМ пиридоксаль-5'-фосфат (ПЛП), и 1 мМ β-меркаптоэтанол / (β-ME). 1 мл раствора В, состоящий из 100 ммоль натрия МЧС рН 6,5, 0,1 мМ ПЛП, 1 мМ β-ME и 50 нМ LdcI. LdcI очищали, как описано в Снайдер и др. ^6. Kanjee и соавт. ^14.
   1 мл раствора С, который является идентичным Раствор В, но не содержит LdcI.
2. Подготовка 100 мл универсальное решение, состоящее из 1 М карбонат натрия (10,6 г/100 мл) и аликвоту 50 мкл в каждую лунку 96-луночного полистирола пластины с использованием многоканальной пипетки. Добавить 30 мкл воды к пластине, а затем крышку. Обратите внимание, что сумма объема добавленной воды и объем образца извлеченных во время ферментативной реакции должна быть равна 50 мкл. В этом случае, 20 мкл образца фермента реакция будет удален.
3. Подготовка 5 мл раствора TNBS в 10 мМ путем разбавления 294 мкл 5% (м / о) TNBS акции с 4706 мкл воды, заверните в алюминиевую фольгу и хранить на льду.
4. Равновесия Термостат Эппендорф Plus при температуре 37 ° C. Термостат Plus имеет 24 скважин в 6 колонн. На рисунке 2 схематично. Этикетка 1,5 мл Eppendorf труб с указанием идентичности нуклеотидных, что будет проверяться (по одному на колонку): GTP (столбец), ВВП (колонка Б), ppGpp (столбец С), pppGpp (столбец D), не нуклеотидных (столбец E ), а белок образцы (столбец F).
5. Стойка несколько коробок с 200 мкл советы, что каждый альтернативный строки опущены дает в общей сложности четыре ряда советов. Это необходимо для использования многоканальной пипетки с термостатом Плюс heatblock во фермента анализа.
6. Равновесия Цифровой Heatblock (VWR) при 42 ° C.
7. Место 96-луночного 2,0 мл полипропиленовые пластины на льду, чтобы охладиться.

2) LdcI Пробирной

1. Алиготе 50 мкл раствора с соответствующей нуклеотидной до 1,5 мл Eppendorf труб в каждом из пяти колонн Термостат Эппендорф.
2. Добавить 330 мкл раствора В-три трубы в колонке F и добавляют 330 мкл раствора С (не-белковые контроля) до окончательного трубки в колонке F.
3. Равновесия растворов при 37 ° С в течение пяти минут. Совет: после 5 минут, отрезали шапки труб в центре нагрева блока, чтобы предотвратить их от вмешательства в многоканальной пипетки, которые будут использоваться дальше.
4. Использование мкл 5-50 VWR многоканальной пипетки, трансфер 50 мкл из трубы в колонке F в каждой из труб в колонках AE. Начало таймер, как только первые трубки носит смешанный характер.
5. На 2, 4 и 6 минут удалить 20 мкл образца с помощью многоканальной пипетки и добавить в универсальное решение.
6. Примечание: образцы в универсальное решение может быть покрыта в пищевую пленку и замораживали при -20 ° C для последующей обработки. Плиты должны быть разморозить при комнатной температуре до реакции с TNBS.

3) TNBS реакция и цвет развитию

1. Добавить 50 мкл 10 мМ TNBS решение остановить решение с помощью многоканальной пипетки, а затем инкубируют при 42 ° С в течение 6 минут. Решение станет темно-желтый / оранжевый цвет TNBS реагирует с лизина и кадаверина.
2. Через 6 минут, охладить пластины на лед, чтобы замедлить реакцию.
3. Удалить 100 мкл образца с помощью VWR 20-200 мкл многоканальные пипетки и место в 2 мл глубокий колодец пластина, охлаждали на льду. Передача льда ведро fumehood.
4. Добавить 500 мкл толуола в каждую лунку использованием HandyStep (Brand) пипетка повторить и 12,5 мл пипетки (Plastibrand).
5. Вытрите лишнюю толуол использованием kimwipe и покрывают пластины полосками упаковочной ленты. Убедитесь, что нажали вниз твердо получить хорошее уплотнение. Обложка 96-луночного планшета с плоской крышкой и энергично встряхивают в течение 1 минуты и 30 секунд.
6. Оставить решение согласиться на 5 минут. ТНП-кадаверин сейчас находится в верхней толуол фазы, а ТНП-лизина остается растворимый в воде (см. Рисунок 1).
7. Удалить 200 мкл толуола использованием 20-200 мкл многоканальной пипетки в 96-луночный планшет для чтения. Примечание: не забудьте проверить, что каждый образец удаляется ясно и не имеет какого-либо из нижней водной фазы. Примечание: используйте советы барьер, чтобы предотвратить повреждение многоканальные пипетки на толуол.
8. Считать абсорбцию при 340 нм в SpectraMax 340 ридер.
9. Для очистки кварцевой пластинки, промыть толуола с водой и поставьте кварцевой пластиной в большомстеклянный поднос в вытяжном шкафу. Залить 100 мл 7:03 смеси 70% (объем / объем) азотной кислоты: 95% (объем / объем) этанола и охватывают кварцевой пластинки со вторым стеклянный поднос. Внимание: Реакция сильно экзотермическая, а иногда и взрывных носить соответствующую защиту и гарантировать, что дыма створку капота установлен в нижнем 6 "Уровень После охлаждения промывают азотной кислоты с водой, а затем 95% этанола..

4) Результаты представитель

1) кадаверин калибровочной кривой (рис. 3)
Анализ проводили, как описано, но без каких-либо L-лизина или LdcI и вместо различных концентраций кадаверин были использованы для эмпирически определить линейный диапазон анализа. Анализ был линейным, чтобы OD ₃₄₀ в размере 0,25, что соответствует ~ 22 нмоль кадаверина (рис. 3).

2) Деятельность LdcI (рис. 4)
Деятельность LdcI только была определена в 153,5 (± 18,1) нмоль кадаверин мин-1 мкг LdcI-1 при рН 6,5. Деятельность LdcI не влияет в присутствии 100 мкМ ГТФ или ВВП, но сильно тормозится (> 10 раз) в присутствии pppGpp и ppGpp (рис. 4).

Рисунок 1. Принципиальная схема реакции LdcI. Декарбоксилирования реакции L-лизина для генерации СО ₂ и кадаверин показано, а также последующая реакция с TNBS при высоком рН для получения N, N-bistrinitrophenylcadaverine (ТНП-кадаверин) и N, N '-bistrinitrophenyllysine (ТНП-лизина). На основе Фан и др. al.11

Рисунок 2. Настройка термостата Эппендорф. Расположения образцов в 24-луночных Термостат Эппендорф показан вместе с описанием шагов анализа (выделены жирным шрифтом). Стрелки показывают передачи реакция решения в соответствии с протоколом. Удаление реакция решение остановить решение в 96-луночного планшета также указано.

Рисунок 3. Кадаверин стандартной кривой. Участок абсорбции при длине волны 340 нм по сравнению с нмоль кадаверина показано. Планки погрешностей представляют стандартное отклонение по крайней мере трех независимых измерений. Линия наилучшего соответствия Показано также, и R2 из 0,996.

Рисунок 4. LdcI результатов анализа. Участок уровень активности LdcI (в нмоль кадаверин производится мин-1 мкг-1 LdcI) показано в присутствии 100 мкМ ГТФ, ВВП, pppGpp, ppGpp и в отсутствие нуклеотида. Строгие нуклеотидов ответа (р) ppGpp способны существенно подавляя активность LdcI. Погрешности представляют стандартное отклонение по крайней мере шесть независимых измерений.

В лизина анализа декарбоксилазы, TNBS реагирует с первичными аминами из L-лизина и кадаверина сформировать ТНП-лизина и ТНП-кадаверин аддуктов (рис. 1). В связи с наличием группы карбоновой кислоты на ТНП-лизин, этот аддукт остается растворим в воде, а ТНП-кадаверин, не имея группы карбоновой кислоты, способен разбиение на толуол ^11. Этот тип анализа может быть использован более широко и на другие виды аминокислот, где потери группы карбоновой кислоты происходит во время реакции. Это происходит во время декарбоксилирование L-орнитин по индуцибельной орнитиндекарбоксилазы SPEF сформировать полиамина путресцин ⁷ и декарбоксилирование L-аргинина индуцибельной аргинин декарбоксилазы Adia сформировать полиамина agmatine ^4.

Анализ LdcI описанные здесь обеспечивает относительно быстрый метод определения активности очищенного белка в пробирке. Основные преимущества этого анализа являются:

я) Использование нескольких повторяет в эксперименте повышает точность каждого измерения;

II) анализ может быть проведен в широком диапазоне буфера условия (различные рН, соль, восстановителя и т.д.) без изменения протокола;

III) анализ может быть модифицирован для измерения в естественных условиях деятельности LdcI путем определения количества кадаверин выводится во время клеточного роста.

Основные ограничения этого анализа являются:

я) чувствительность эксперименты ограничены линейного спектра поглощения ТНП-аддуктов;

II) несколько этапов обработки увеличение величины погрешности эксперимента;

III) Не все аминокислот декарбоксилазы кислоты поддаются такой тип протокола. Например, декарбоксилирование L-глутаминовой кислоты индуцибельной глутаминовой кислоты декарбоксилазы Гада / GadB генерирует γ-амино-масляной кислоты ^2, TNBS-аддукт, который будет растворим в воде из-за наличия боковой цепи карбоновой кислоты группу.

Биохимические исследования ответ кислоты стресс Е. палочка является расширение области исследований и позволит нам лучше понять молекулярные основы стрессовую реакцию в E. палочки и связанных с ними γ-протеобактерий, которые имеют аналогичную кислоты стрессовую реакцию системы, такие как сальмонелла enterica серовар Typhimurium ¹² и вибрион холеры ^13. Открытие, что LdcI деятельность тормозится строгие ppGpp регулятора ответ дал нам ранее неизвестных понимание регулирования этого белка.

Мы благодарим доктора Д-р Майкл Кашел (Национальный институт здоровья, Бетезда, штат Массачусетс, США) за отправку бактериальные штаммы, плазмиды, и необходимые протоколы. Мы благодарим д-р Джон Гловер (кафедра биохимии, Университет Торонто) для использования читателя пластины SpecraMax. Великобритания является лауреатом Национальной наукам и инженерным исследованиям Совета Канады (NSERC) последипломного стипендии канадского института стратегических исследований в области здравоохранения учебной программы в структурной биологии мембранных белков Связанный с болезнями, а также Университета Торонто стипендий Open. Эта работа была поддержана грантом от Канадского института исследований в области здравоохранения (СС-67210), чтобы WAH.