Assay למדידת פעילות Escherichia coli ועין מתנהלת ליזין Decarboxyase

הפעילות של decarboxylase ועין מתנהלת ליזין מנוטר על ידי מגיבים המצע L-ליזין לבין המוצר קדברין עם חומצה 2,4,6 trinitrobenzensulfonic-לטופס adducts כי יש מסיסות ההפרש ב טולואן.

Escherichia coli הוא חיידק enteric כי הוא מסוגל לגדול על פני טווח רחב של ערכי ה-pH (pH 5-9) ^1, לא ייאמן, הוא מסוגל לשרוד חומצה קיצונית מדגיש כולל מעבר דרך הקיבה יונקים שבו pH יכול ליפול נמוך כמו pH ^פבואר 01-02. כדי לאפשר כזה מגוון רחב של הישרדות pH חומצי, א coli בעלת ארבעה שונה ועין מתנהלת חומצה אמינית decarboxylases כי המצע שלהם decarboxylate חומצות אמינו בצורה פרוטון תלויי ובכך להעלות את ה-pH הפנימי. Decarboxylases כוללים חומצה גלוטמית decarboxylases GadA ו GadB ^3, decarboxylase ארגינין עדיה ^4, decarboxylase ליזין LdcI ^{5, 6} ו decarboxylase ornithine SpeF ^7. כל אנזימים אלה לנצל pyridoxal-5'-phospate כגורם משותף ⁸ ולתפקד יחד עם המצע מוצר antiporters-הקרום הפנימי להסיר מוצרים decarboxylation למדיום חיצוני תמורת מצע טרי ^2. במקרה של LdcI, antiporter ליזין-קדברין נקרא CadB. לאחרונה, אנו נקבע את מבנה רנטגן של גביש LdcI ל 2.0, ואנו גילו מולקולה קטנה, רומן חייב LdcI התגובה מחמירים הרגולטור guanosine 5'-diphosphate, diphosphate 3'-(ppGpp) ^14. התגובה מחמירים מתרחשת כאשר התאים גדל באופן אקספוננציאלי ניסיון חסך תזונתי או אחת למספר מדגיש אחרים ^9. כתוצאה מכך, התאים לייצר ppGpp שמוביל מפל איתות ששיאה במעבר גידול מעריכי לגידול שלב נייח ^10. אנחנו הוכיחו כי ppGpp הוא מעכב ספציפי של LdcI ^14. כאן אנו מתארים את assay decarboxylase ליזין, שונה מן assay שפותחה על ידי Phan et al. ^11, שיש לנו כדי לקבוע את הפעילות של LdcI והשפעת pppGpp / ppGpp על פעילות זו. התגובה decarboxylation LdcI מסיר את קבוצת α-carboxy של L-ליזין מייצרת פחמן דו חמצני קדברין polyamine (1,5-diaminopentane) ^5. L-ליזין קדברין ניתן הגיבו 2,4,6-trinitrobenzensulfonic חומצה (TNBS) ב-pH גבוה כדי לייצר N, N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-קדברין) ו-N, N'-bistrinitrophenyllysine (TNP-ליזין), בהתאמה ^11. TNP-קדברין ניתן להפריד TNP-ליזין כמו לשעבר הוא מסיס בממסים אורגניים כגון טולואן בזמן האחרון הוא לא (ראו תרשים 1). טווח ליניארי של assay נקבע באופן אמפירי באמצעות מטוהרים קדברין.

1) ריאגנטים וציוד

1. ראשית, להכין את הדברים הבאים שלושה פתרונות: 1 מ"ל של פתרון אשר מורכב של 8 מ"מ L-ליזין, נתרן 100 mM 2 - (N-Morpholino) ethanesulphonic חומצה (MES) pH 6.5, 0.2 מ"מ נוקלאוטיד, שם הוא נוקלאוטיד או: diphosphate guanosine (תמ"ג), guanosine טריפוספט (GTP), guanosine 5'-diphosphate, diphosphate 3'-(ppGpp), או guanosine 5'-טריפוספט, diphosphate 3'-(pppGpp), 0.1 מ"מ pyridoxal 5'-פוספט (PLP), ו - 1 mM β-mercaptoethanol / (β-ME). 1 מ"ל של B פתרון המורכב נתרן 100 mM MES-pH 6.5, 0.1 מ"מ PLP, 1 mM β-ME, ו - 50 ננומטר LdcI. LdcI היה מטוהרים כמתואר סניידר et al. ⁶ ו Kanjee et al. ^14.
   1 מ"ל של C הפתרון הזהה ל-B אך הפתרון אינו מכיל LdcI.
2. הכן 100 מ"ל של הפתרון להפסיק המורכב נתרן קרבונט M 1 (10.6 g/100 מ"ל) ו aliquot 50 μL לבאר כל צלחת 96-באר קלקר באמצעות פיפטה רב ערוצי. הוסף 30 μL מים לצלחת ואז לכסות. שים לב כי סכום של נפח המים הוסיף נפח מדגם שחולצו במהלך התגובה חייב אנזים שווה 50 μL. במקרה זה, 20 μL המדגם התגובה אנזים יוסרו.
3. הכן 5 מ"ל של תמיסת TNBS על 10 מ"מ על ידי דילול 294 μL של 5% (w / v) מניות TNBS עם מים לעטוף μL 4706, בנייר אלומיניום ולשמור על הקרח.
4. לאזן את התרמוסטט Eppendorf פלוס בשעה 37 ° C. פלוס תרמוסטט יש 24 בארות 6 עמודות. ראה איור 2 עבור סכמטית. 1.5 תווית מ"ל Eppendorf צינורות המציין את זהותו של נוקלאוטיד כי תיבחן (אחד לכל עמודה): GTP (עמודה A), התוצר המקומי הגולמי (עמודה B), ppGpp (עמודה C), pppGpp (עמודה D), לא נוקלאוטיד (E עמודה ), דגימות חלבון (עמודה F).
5. Rack כמה קופסאות של 200 טיפים μL כך שכל שורה חלופי מושמט נותן סך של ארבע שורות של עצות. זה הכרחי לשימוש פיפטה רב ערוצי עם תרמוסטט פלוס heatblock במהלך assay האנזים.
6. לאזן דיגיטלי Heatblock (VWR) בשעה 42 ° C.
7. מניחים 96-גם צלחת 2.0 מ"ל פוליפרופילן על הקרח להתקרר.

2) LdcI Assay

1. 50 Aliquot μL של פתרון עם נוקליאוטידים מתאימים 1.5 צינורות מ"ל Eppendorf בכל אחד מחמשת עמודי התרמוסטט Eppendorf.
2. הוספת 330 μL של B פתרון לשלושה צינורות F טור ולהוסיף 330 μL הפתרון C (שליטה ללא חלבון) אל הצינור הסופי בעמודה F.
3. לאזן את הפתרונות על 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. טיפ: לאחר 5 דקות, לנתק את כמוסות של הצינורות במרכז הבלוק חימום כדי למנוע מהם להפריע פיפטה רב לשמש הבאה.
4. שימוש VWR μL 5-50 מרובת ערוצים פיפטה, 50 μL העברת צינורות בפה טור לתוך אחד הצינורות בעמודות AE. הפעל את שעון העצר ברגע הצינור הראשון הוא מעורב.
5. בשלב 2, 4 ו 6 דקות להסיר 20 μL המדגם באמצעות פיפטה רב ערוצי ולהוסיף הפתרון להפסיק.
6. הערה: דגימות פתרון להפסיק יכול להיות מכוסה בניילון קפוא ב -20 ° C לעיבוד שלאחר מכן. הצלחות יש להפשיר בטמפרטורת החדר לפני תגובה עם TNBS.

3) TNBS תגובת ופיתוח צבע

1. הוסף 50 μL של פתרון 10 mM TNBS לפתרון להפסיק את השימוש הרב ערוצית פיפטה ואז לדגור על 42 מעלות צלזיוס במשך 6 דקות. הפתרון יהפוך צבע צהוב / כתום כהה כמו TNBS מגיב עם ליזין לבין קדברין.
2. לאחר 6 דקות, לצנן את הצלחת על קרח כדי להאט את התגובה.
3. הסר 100 μL של המדגם באמצעות 20-200 VWR פיפטה μL מרובת ערוצים ומניחים את צלחת 2 מ"ל עמוק היטב כי היה מקורר על הקרח. העברת קרח בדלי כדי fumehood.
4. הוספת 500 μL טולואן זה גם באמצעות HandyStep (מותג) pipettor לחזור ו 12.5 מ"ל פיפטה קצה (Plastibrand).
5. נגבי את כל טולואן עודף באמצעות kimwipe ולכסות את הצלחת עם רצועות של סרט האריזה. הקפד ולחץ בחוזקה כלפי מטה כדי לקבל חותמת טוב. מכסים את צלחת 96-היטב עם מכסה שטוח ולאחר מכן ללחוץ בחוזקה במשך דקה 1 ו 30 שניות.
6. השאירו הפתרונות להתיישב במשך 5 דקות. TNP-קדברין כעת בשלב טולואן העליון, בעוד TNP-ליזין נשאר מסיס במים (ראה איור 1).
7. הסר 200 μL של טולואן באמצעות פיפטה 20-200 μL רב ערוצי לתוך צלחת 96-היטב לקריאה. הערה: הקפד לבדוק שכל מדגם סולקו ברורה אין שום שלב מימית בתחתית. הערה: מחסום להשתמש טיפים כדי למנוע נזק רב ערוצי פיפטה של ​​טולואן.
8. קרא את ספיגת ב 340 ננומטר קורא SpectraMax 340 צלחת.
9. כדי לנקות את הצלחת קוורץ, לשטוף את טולואן עם מים במקום צלחת קוורץ גדולמגש זכוכית בשכונה קטר. יוצקים מעל 100 מ"ל של תערובת 07:03 של 70% (v / v) חומצה חנקתית: 95% (v / v) אתנול לכסות את הצלחת קוורץ עם מגש הזכוכית השני. אזהרה: התגובה היא הגנה ללבוש אקסותרמית מאוד נפיץ לפעמים מתאימים להבטיח כי אבנט ברדס עשן מוגדר הרמה הנמוכה "6 אחרי קירור, לשטוף חומצה חנקתית עם מים ואז אתנול 95%..

4) נציג תוצאות

1) קדברין רגיל Curve (איור 3)
Assay בוצע כמתואר אך ללא L-ליזין או LdcI וריכוזים שונים במקום קדברין שימשו כדי לקבוע באופן אמפירי את הטווח הליניארי של assay. Assay היה ליניארית OD ₃₄₀ של 0.25, המקביל ל ~ 22 nmoles של קדברין (איור 3).

2) פעילות LdcI (איור 4)
הפעילות של LdcI לבד היה נחוש בדעתו להיות 153.5 (± 18.1) nmoles קדברין min-1 מיקרוגרם LdcI-1 ב-pH 6.5. פעילות LdcI אינו מושפע בנוכחות 100 מיקרומטר GTP או התמ"ג אך הוא חזק עכבות (> 10 פי) בנוכחות pppGpp ו ppGpp (איור 4).

באיור 1. תרשים סכמטי של התגובה LdcI. התגובה decarboxylation של L-ליזין לייצר CO ₂ ו קדברין מוצג כמו גם התגובה הבאים עם TNBS ב-pH גבוה כדי לייצר N, N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-קדברין) ו-N, N "-bistrinitrophenyllysine (TNP-ליזין). בהתבסס על et Phan al.11

איור 2. ההתקנה של טרמוסטט Eppendorf. הפריסה של דגימות התרמוסטט Eppendorf 24 גם מוצג יחד עם תיאור של הצעדים של assay (מסומן באותיות מודגשות). החצים מצביעים על העברת התגובה פתרונות על פי הפרוטוקול. הסרת פתרון התגובה לפתרון להפסיק בצלחת 96-טוב מצוין גם.

איור 3. קדברין Curve רגיל. העלילה של ספיגת ב 340 ננומטר לעומת nmoles של קדברין מוצג. ברים שגיאה מייצגים את סטיית התקן של לפחות שלוש מדידות עצמאיות. הקו של בכושר הטוב ביותר מוצג גם ויש לו R2 של 0.996.

איור 4. תוצאות LdcI assay. חלקת קצב הפעילות LdcI (ב nmoles קדברין המיוצר min-1-1 מיקרוגרם LdcI) מוצגת נוכחותם של 100 מיקרומטר GTP, תוצר, pppGpp, ppGpp ובהעדר של נוקלאוטיד. נוקלאוטידים תגובה מחמירים (p) ppGpp מסוגלים פעילות LdcI עיכוב משמעותי. ברים שגיאה מייצגים את סטיית התקן של לפחות שש מדידות עצמאיות.

ב assay decarboxylase ליזין, TNBS הוא הגיב עם אמינים העיקרי של L-ליזין קדברין כדי ליצור TNP-ליזין TNP-קדברין adducts (איור 1). בשל נוכחותם של הקבוצה חומצה carboxylic על TNP-ליזין, adduct זה נשאר מסיסים במים בעוד TNP-קדברין, חסרה הקבוצה חומצה carboxylic, הוא מסוגל מחיצות לתוך טולואן ^11. סוג זה של assay יכול להיות מנוצל באופן נרחב יותר על סוגים אחרים של חומצות האמינו שבו הפסד של קבוצת חומצה carboxylic מתרחשת במהלך התגובה. זו מתרחשת במהלך decarboxylation של ornithine-L על ידי SpeF ועין מתנהלת ornithine decarboxylase לטופס putrescine polyamine ⁷ ואת decarboxylation של ארגינין L-ארגינין ועין מתנהלת על ידי decarboxylase עדיה לטופס agmatine polyamine ^4.

Assay LdcI המתואר כאן מספק שיטה מהירה יחסית לקביעת הפעילות של החלבון במבחנה מטוהרים. היתרונות העיקריים של assay זה הם:

I) שימוש מרובים משכפל לכל הניסוי משפרת את דיוק המדידה כל אחד;

ii) assay עשוי להתבצע על פני טווח רחב של מצבים חיץ (pH מלח שונים, צמצום סוכן וכו ') ללא שינוי של הפרוטוקול;

iii) assay עשוי להיות שונה למדידת פעילות vivo של LdcI על ידי קביעת כמות קדברין מופרש במהלך גדילת התאים.

המגבלות העיקריות של assay זה הם:

ט) הרגישות של הניסויים מוגבלים על ידי בטווח הליניארי של ספיגת של TNP-adducts;

ii) מדרגות עיבוד רבות להגדיל את גודל שגיאות הניסוי;

ג) לא כל decarboxylases חומצת אמינו ניתנים לסוג זה של פרוטוקול. לדוגמה, decarboxylation של חומצה גלוטמית L-על ידי חומצה גלוטמית decarboxylases ועין מתנהלת GadA / GadB מייצר γ-amino acid-butyric ^2, TNBS-adduct אשר יהיה מסיס במים בשל נוכחותם של חומצה בצד שרשרת carboxylic קבוצה.

החקירה ביוכימיים תגובת חומצה הלחץ של E. coli הוא אזור הרחבת המחקר יאפשר לנו להבין טוב יותר את הבסיס המולקולרי של התגובה ללחץ E. coli הקשורים γ-proteobacteria דומה כי יש מתח חומצה בתגובה מערכות כגון סלמונלה enterica serovar Typhimurium ¹² ו ויבריו כולרה ^13. הגילוי כי פעילות LdcI מעוכבת על ידי ppGpp תגובה מחמירים הרגולטור סיפק לנו תובנה ידועה קודם לכן אל תקנה של חלבון זה.

אנו מודים לד"ר ד"ר מיכאל קאשל (National Institutes of Health, Bethesda, מסצ'וסטס, ארה"ב) לשליחת לנו זני חיידקים, פלסמידים, ופרוטוקולים הצורך. אנו מודים לד"ר ג'ון גלובר (המחלקה לביוכימיה, אוניברסיטת טורונטו) לשימוש של הקורא צלחת SpecraMax. בבריטניה הוא מקבל הלאומית למדעים והנדסה מועצת המחקר של קנדה (NSERC) מלגות לתארים מתקדמים, המכון הקנדי של תוכנית הבריאות הדרכה אסטרטגי מחקר בביולוגיה מבנית של חלבונים בממברנה הקשורים למחלה, וכן אוניברסיטת אחוות פתח טורונטו. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם המכון הקנדי לחקר הבריאות (MOP-67210) כדי וואה.