Un ensayo para medir la actividad de Escherichia coli Inducible lisina Decarboxyase

La actividad de la descarboxilasa inducible lisina es controlada por la reacción del sustrato L-lisina y el producto cadaverina con 2,4,6-trinitrobenzensulfonic ácido para formar aductos que tienen una solubilidad diferencial en tolueno.

Escherichia coli es una bacteria entérica que es capaz de crecer en un amplio rango de valores de pH (pH 5-9) ¹ e, increíblemente, es capaz de sobrevivir ácido extremas tensiones incluyendo el paso por el estómago de mamíferos en donde el pH puede caer tan bajo como pH 1 - ² 2. Para permitir una gama tan amplia de la supervivencia de pH ácido, E. coli posee cuatro descarboxilasas diferentes inducible descarboxilación de aminoácidos que los ácidos amino sustrato en forma de protones dependiente de lo que aumenta el pH interno. El descarboxilasas incluyen el ácido glutámico descarboxilasas Gada y GadB ^3, la arginina descarboxilasa Adia ^4, la lisina descarboxilasa LdcI ^{5, 6} y la ornitina decarboxilasa SPEF ^7. Todas estas enzimas utilizan piridoxal-5'-fosfato como un co-factor ⁸ y funcionan en conjunto con la membrana interna de productos sustrato antiporters que eliminar los productos de descarboxilación al medio externo a cambio de sustrato fresco ^2. En el caso de LdcI, el antiporter lisina cadaverina se llama Cadb. Recientemente, se determinó la estructura cristalina de rayos X de LdcI a 2,0 Å, y descubrimos una novela pequeña molécula unida a la guanosina LdcI respuesta regulador estricto 5'-difosfato, 3'-difosfato (ppGpp) ^14. La respuesta estrictas ocurre cuando las células en crecimiento exponencial experiencia de la privación de nutrientes o una de una serie de otros factores de estrés ^9. Como resultado, las células producen ppGpp que conduce a una cascada de señalización que culmina en el cambio de un crecimiento exponencial a fase estacionaria del crecimiento ^10. Hemos demostrado que ppGpp es un inhibidor específico de LdcI ^14. A continuación se describe el ensayo de lisina descarboxilasa, una modificación del ensayo desarrollado por Phan et al. ^11, que hemos utilizado para determinar la actividad de LdcI y el efecto de pppGpp / ppGpp en esa actividad. La reacción de descarboxilación LdcI elimina el grupo α-carboxilo de la L-lisina y produce dióxido de carbono y la cadaverina poliamina (1,5-diaminopentano) ^5. L-lisina y la cadaverina puede reaccionar con el ácido 2,4,6-trinitrobenzensulfonic (TNBS) a un pH elevado para generar N, N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverina) y N, N-bistrinitrophenyllysine (TNP-lisina), respectivamente ^11. El TNP-cadaverina se puede separar de la TNP-lisina como el primero es soluble en disolventes orgánicos como el tolueno y el segundo no lo es (ver Figura 1). El rango lineal del ensayo fue determinado empíricamente por medio purificada cadaverina.

1) Reactivos y Equipos

1. En primer lugar, preparar las tres soluciones siguientes: 1 ml de solución A, que se compone de 8 mM de L-lisina, 100 mM de sodio 2 - (N-morfolino) el ácido etanosulfónico (MES) pH 6,5, 0,2 mM de nucleótidos, que es el nucleótido o bien: difosfato de guanosina (GDP), guanosina trifosfato (GTP), guanosina 5'-difosfato, 3'-difosfato (ppGpp), o guanosina 5'-trifosfato, 3'-difosfato (pppGpp), 0,1 mM piridoxal 5-fosfato (PLP), y 1 mM β-mercaptoetanol / (β-ME). 1 ml de solución B que consiste en 100 mM de sodio pH 6,5 MES, 0,1 mM PLP, 1 mM β-ME, y 50 nM LdcI. LdcI fue purificado como se describe en Snider et al. ⁶ y Kanjee et al. ^14.
   1 ml de solución C, que es idéntica a la solución B, pero no contiene LdcI.
2. Preparar 100 ml de la solución de paro que consiste en 1 M de carbonato de sodio (10,6 g/100 ml) y la parte alícuota de 50 l en cada pocillo de una placa de poliestireno de 96 pocillos utilizando una pipeta multicanal. Añadir 30 l de agua a la placa y la cubierta entonces. Tenga en cuenta que la suma del volumen de agua añadida y el volumen de muestra extraída durante la reacción de la enzima debe ser igual a 50 mL. En este caso, 20 l de muestra de enzima reacción será eliminado.
3. Preparar 5 ml de solución TNBS a 10 mM mediante la dilución de 294 l de 5% (w / v) acciones TNBS con 4.706 l de agua, envuelva en papel aluminio y mantener en hielo.
4. Equilibre el termostato Eppendorf Plus en 37 ° C. Además el termostato tiene 24 pozos en 6 columnas. Ver Figura 2 para el esquema. Etiqueta de 1,5 ml tubos Eppendorf indicando la identidad de los nucleótidos que se pondrá a prueba (una por columna): GTP (columna A), el PIB (columna B), ppGpp (columna C), pppGpp (columna D), no nucleótidos (columna E ), y las muestras de proteínas (columna F).
5. Bastidor de varias cajas de 200 tips l tal que cada fila alterna se omite un total de cuatro hileras de puntas. Esto es necesario para el uso de la pipeta multicanal con el termostato Además heatblock durante el ensayo enzimático.
6. Equilibre Digital Heatblock (VWR) a 42 ° C.
7. Coloque una de 96 y 2,0 mL placa de polipropileno en el hielo para enfriar.

2) Ensayo LdcI

1. Alícuota de 50 l de la solución A con el nucleótido correspondiente a 1,5 ml tubos Eppendorf en cada una de las cinco columnas de la ThermoStat Eppendorf.
2. Añadir 330 l de la solución B a tres tubos en la columna F y añadir 330 l de solución C (el control sin proteínas) en el tubo final en la columna F.
3. Equilibrar las soluciones a 37 ° C durante cinco minutos. Sugerencia: después de 5 minutos, cortar las tapas de los tubos en el centro de la calefacción de bloque para evitar que interfieran con la pipeta multicanal para ser utilizado junto.
4. El uso de un 50 a 50 l VWR multi-canal de la pipeta, transferir 50 L de los tubos en la columna F en cada uno de los tubos en las columnas AE. En marcha el cronómetro tan pronto como el primer tubo se mezclan.
5. A los 2, 4 y 6 minutos, retire 20 l de la muestra con la pipeta multicanal y añadir a la solución de paro.
6. Nota: las muestras de solución de parada puede ser cubierta en plástico y congelado a -20 ° C para su posterior procesamiento. Las placas se deben descongelar a temperatura ambiente antes de la reacción con TNBS.

3) TNBS reacción y desarrollo de color

1. Añadir 50 l de 10 mM solución TNBS a la solución de dejar de utilizar la pipeta multicanal y luego se incuba a 42 ° C durante 6 minutos. La solución se volverá de color amarillo oscuro / naranja como el TNBS reacciona con la lisina y la cadaverina.
2. Después de 6 minutos, enfriar la placa de hielo para retrasar la reacción.
3. Sacar 100 l de la muestra utilizando un VWR 20-200 l multi-canal pipeta y con más de 2 ml de profundidad y placa que se enfrió en hielo. Transferencia de cubo de hielo a la fumehood.
4. Añadir 500 l de tolueno a cada pocillo utilizando una HandyStep (Marca) Pipeta de repetición y 12,5 ml punta de la pipeta (PLASTIBRAND).
5. Limpie cualquier exceso de tolueno con una Kimwipe y cubrir el plato con tiras de cinta de embalaje. Asegúrese de presionar firmemente hacia abajo para obtener un buen sello. Cubrir la placa de 96 pocillos con tapa plana y se agita vigorosamente durante 1 minuto y 30 segundos.
6. Deje las soluciones reposar unos 5 minutos. El TNP-cadaverina se encuentra ahora en la fase de tolueno superior, mientras que el TNP-lisina sigue siendo soluble en agua (ver Figura 1).
7. Eliminar 200 L de tolueno con el 20-200 l multi-canal de la pipeta en una placa de 96 pozos para la lectura. Nota: asegúrese de comprobar que cada muestra se está quitando es clara y no tiene ninguna de la fase acuosa inferior. Nota: consejos de uso de barreras para evitar daños a múltiples canales de pipeta por el tolueno.
8. Lea la absorbancia a 340 nm en un lector de placas SpectraMax 340.
9. Para limpiar la placa de cuarzo, enjuagar el tolueno con agua y coloque la placa de cuarzo en un granvidrio bandeja en la campana extractora de humos. Verter sobre 100 ml de una mezcla de 7:3 de 70% (v / v) de ácido nítrico: 95% (v / v) de etanol y la cubierta de la placa de cuarzo con una bandeja de vidrio segundos. Advertencia: la reacción es muy exotérmica protección contra el desgaste y explosivo a veces apropiada y asegurarse de que la banda campana extractora de humos está en la parte baja de 6 "de nivel Después de enfriar, lavar el ácido nítrico con agua y etanol al 95%..

4) Los resultados representativos

1) cadaverina curva estándar (Figura 3)
El ensayo se realizó como se describe, pero sin ningún tipo de L-lisina o LdcI y las concentraciones en lugar de varios cadaverina se utilizaron para determinar empíricamente el rango lineal del ensayo. El ensayo fue lineal hasta una DO ₃₄₀ de 0.25, que corresponde a ~ 22 nmoles de cadaverina (Figura 3).

2) Actividad de LdcI (Figura 4)
La actividad de LdcI solo se determinó que era 153,5 (± 18,1) nmoles cadaverina min-1 mg LdcI-1 a pH 6,5. La actividad de LdcI no se ve afectada en presencia de 100 mM GTP o el PIB, pero está fuertemente inhibida (> 10 veces) en presencia de pppGpp y ppGpp (Figura 4).

Figura 1. Esquema de la reacción LdcI. La reacción de descarboxilación de la L-lisina para generar CO ₂ y la cadaverina se muestra así como la posterior reacción con TNBS a pH alto para generar N, N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverina) y N, N "-bistrinitrophenyllysine (TNP-lisina). En base a Phan et al.11

Figura 2. La configuración del termostato Eppendorf. El diseño de las muestras en el termostato de 24 y Eppendorf se muestra junto con la descripción de los pasos de la prueba (se indican en negrita). Las flechas indican la transferencia de soluciones de reacción de acuerdo con el protocolo. La eliminación de la solución de reacción a la solución de parada en la placa de 96 pozos también se indica.

Figura 3. Cadaverina curva estándar. La gráfica de la absorbancia a 340 nm frente a nmoles de cadaverina se muestra. Las barras de error representan la desviación estándar de al menos tres mediciones independientes. La línea de mejor ajuste también se muestra y tiene una R2 de 0,996.

Figura 4. LdcI resultados del ensayo. Un gráfico de la tasa de actividad LdcI (en nmoles cadaverina producido min-1 mg-1 LdcI) se muestra en la presencia de GTP M 100, el PIB, pppGpp, ppGpp y en ausencia de nucleótidos. Los nucleótidos respuesta estrictas (p) ppGpp son capaces de inhibir la actividad LdcI significativamente. Las barras de error representan la desviación estándar de al menos seis mediciones independientes.

En el ensayo de lisina descarboxilasa, TNBS se hace reaccionar con las aminas primarias de L-lisina y la cadaverina para formar TNP-lisina y TNP-cadaverina aductos (Figura 1). Debido a la presencia del grupo ácido carboxílico de TNP-lisina, este aducto permanece soluble en agua, mientras que el TNP-cadaverina, que carecen del grupo ácido carboxílico, es capaz de partición en tolueno ^11. Este tipo de ensayo puede ser utilizado más ampliamente en otros tipos de aminoácidos que la pérdida de un grupo ácido carboxílico se produce durante la reacción. Esto ocurre durante la descarboxilación de la L-ornitina por la SPEF ornitina decarboxilasa inducible para formar la putrescina poliamina ⁷ y la decarboxilación de la L-arginina por la descarboxilasa inducible Adia arginina para formar la poliamina agmatine ^4.

El ensayo LdcI descrito aquí proporciona un método relativamente rápido para la determinación de la actividad de la proteína purificada in vitro. Las principales ventajas de este ensayo son los siguientes:

i) El uso de múltiples repeticiones por experimento mejora la precisión de cada medida;

ii) El ensayo puede realizarse en un amplio rango de condiciones (pH diferentes, sal, agente reductor, etc), sin modificación del protocolo;

iii) El ensayo puede ser modificado para medir la actividad in vivo de LdcI mediante la determinación de la cantidad de cadaverina excreta durante el crecimiento celular.

Las principales limitaciones de este ensayo son los siguientes:

i) La sensibilidad de los experimentos están limitados por el rango lineal de la absorbancia del TNP-aductos;

ii) Los pasos de procesamiento de múltiples aumentar la magnitud de los errores experimentales;

iii) No todos los descarboxilasas aminoácidos son susceptibles a este tipo de protocolo. Por ejemplo, la descarboxilación del ácido L-glutámico por la descarboxilasas ácido glutámico inducida Gada / GadB genera γ-amino-butírico ^2, la banca transnacional-aducto de que sea soluble en agua debido a la presencia de los ácidos carboxílicos de cadena lateral grupo.

La investigación bioquímica de la respuesta al estrés ácido de E. E. coli es una zona en expansión de la investigación y nos va a permitir comprender mejor las bases moleculares de la respuesta al estrés en el E. coli y relacionados con γ-Proteobacteria que tienen similares ácido sistemas de respuesta al estrés, tales como Salmonella enterica serovar Typhimurium ¹² y Vibrio cholerae ^13. El descubrimiento de que la actividad LdcI es inhibida por la respuesta del regulador ppGpp estrictos nos ha proporcionado una visión desconocida en la regulación de esta proteína.

Agradecemos al Dr. Dr. Michael Cashel (National Institutes of Health, Bethesda, MA, EE.UU.) para el envío de cepas bacterianas, plásmidos y protocolos necesarios. Agradecemos al Dr. John Glover (Departamento de Bioquímica de la Universidad de Toronto) para el uso del lector de placas SpecraMax. Reino Unido es el destinatario de un Nacional de Ciencias e Ingeniería de Investigación de Canadá (NSERC) Becas de Postgrado, de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud del Programa Estratégico de Formación en la biología estructural de proteínas de membrana ligados a la enfermedad, y de la Universidad de Toronto comunión abierta. Este trabajo fue apoyado por una beca de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (MOP-67210) a WAH.