Un test per misurare l'attività di Escherichia coli Inducibile Lisina Decarboxyase

L'attività della decarbossilasi inducibile lisina è monitorato facendo reagire il substrato L-lisina e il prodotto cadaverina con 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acido per formare addotti che hanno solubilità differenziale in toluene.

Escherichia coli è un batterio intestinale che è in grado di crescere in un ampio intervallo di valori di pH (pH 5 - 9) ¹ e, incredibilmente, è in grado di sopravvivere acido estrema sottolinea anche il passaggio attraverso lo stomaco dei mammiferi in cui il pH può scendere al livello più basso come pH 1 - ² 2. Per consentire ad una vasta gamma di sopravvivenza a pH acido, E. coli possiede quattro diversi decarboxylases aminoacido inducibile che decarbossilano loro substrato amino acidi in un protone-dipendente aumentando così il pH interno. Il decarboxylases includono il acido glutammico decarboxylases Gada e GadB ^3, l'arginina decarbossilasi Adia ^4, la lisina decarbossilasi LdcI ^{5, 6} e l'ornitina decarbossilasi SpeF ^7. Tutti questi enzimi utilizzano piridossale-5'-fosfato come co-fattore ⁸ e funzione con membrana interna substrato-prodotto antiporters che rimuovono i prodotti decarbossilazione al supporto esterno in cambio di substrato fresco ^2. Nel caso di LdcI, la lisina-cadaverina antiporter si chiama Cadb. Recentemente, abbiamo determinato la struttura a raggi X di cristallo di LdcI a 2.0 Å, e abbiamo scoperto un romanzo piccole molecole legato LdcI il severo guanosina regolatore risposta 5'-difosfato, 3'-difosfato (ppGpp) ^14. La risposta rigorosa verifica quando le cellule in crescita esponenziale esperienza privazione nutritiva o uno di una serie di sollecitazioni di altri ^9. Di conseguenza, le cellule producono ppGpp che porta ad una cascata di segnali si conclude con il passaggio da una crescita esponenziale alla crescita fase stazionaria ^10. Abbiamo dimostrato che ppGpp è un inibitore specifico della LdcI ^14. Qui descriviamo il test lisina decarbossilasi, modificato dal test sviluppato da Phan et al. ^11, che abbiamo usato per determinare l'attività di LdcI e l'effetto di pppGpp / ppGpp su tale attività. La reazione di decarbossilazione LdcI rimuove l'α-carbossi gruppo di L-lisina e produce anidride carbonica e la cadaverina poliammine (1,5-diaminopentane) ^5. L-lisina e cadaverina si può reagire con 2,4,6-trinitrobenzensulfonic acido (TNBS) a pH elevato per generare N, N-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverina) e N, N'-bistrinitrophenyllysine (TNP-lisina), rispettivamente ^11. Il TNP-cadaverina può essere separato dal TNP-lisina in quanto il primo è solubile in solventi organici come il toluene, mentre la seconda non lo è (vedi figura 1). Il range lineare del test è stato determinato empiricamente utilizzando purificata cadaverina.

1) Reagenti ed apparecchiature

1. In primo luogo, preparare le seguenti tre soluzioni: 1 ml di soluzione A, che si compone di 8 mM L-lisina, 100 mM di sodio 2 - (N-Morpholino) ethanesulphonic acido (MES) pH 6,5, 0,2 mM nucleotide, in cui il nucleotide è o: guanosina difosfato (GDP), guanosina trifosfato (GTP), guanosina 5'-difosfato, 3'-difosfato (ppGpp), o guanosina 5'-trifosfato, 3'-difosfato (pppGpp), 0,1 mM piridossal 5'-fosfato (PLP), e 1 mM β-mercaptoetanolo / (β-ME). 1 ml di soluzione B che consiste in 100 mM di sodio MES pH 6,5, 0,1 mM PLP, 1 mM β-ME, e 50 nM LdcI. LdcI è stato purificato come descritto nella Snider et al. ⁶ e Kanjee et al. ^14.
   1 ml di soluzione C che è identico a B Solution, ma non contiene LdcI.
2. Preparare 100 mL di soluzione bloccante costituita da carbonato di sodio 1 M (10,6 g/100 ml) e un'aliquota 50 microlitri in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti in polistirene con una pipetta multicanale. Aggiungere 30 ml di acqua al piatto e poi coprire. Si noti che la somma del volume di acqua aggiunta e il volume di campione estratti durante la reazione enzimatica deve essere uguale a 50 microlitri. In questo caso, 20 l di campione reazione enzimatica saranno rimossi.
3. Preparare 5 ml di soluzione TNBS a 10 mm diluendo 294 ml di 5% (w / v) magazzino TNBS con 4706 microlitri di acqua, avvolgetela in un foglio di alluminio e tenere in ghiaccio.
4. Equilibrare la ThermoStat Eppendorf Plus. a 37 ° C. Plus ThermoStat ha 24 pozzi in 6 colonne. Vedere la Figura 2 per schematico. Etichetta 1,5 ml provette Eppendorf indicando l'identità del nucleotide che saranno testati (uno per colonna): GTP (colonna A), il PIL (colonna B), ppGpp (colonna C), pppGpp (colonna D), non nucleotide (colonna E ), e campioni di proteine ​​(colonna F).
5. Scatole rack diverse punte di 200 microlitri in modo tale che ogni riga si alternano viene omesso per un totale di quattro file di punte. Ciò è necessario per l'utilizzo della pipetta multicanale con il termostato e heatblock durante il dosaggio degli enzimi.
6. Equilibrare Digital Heatblock (VWR) a 42 ° C.
7. Posizionare un 96-piastra ben 2,0 ml in polipropilene sul ghiaccio per raffreddare.

2) analisi LdcI

1. Aliquota 50 ml di soluzione A con il nucleotide adeguate per 1,5 ml provette Eppendorf in ognuna delle cinque colonne del ThermoStat Eppendorf.
2. Aggiungere 330 ml di soluzione B a tre tubi in colonna F e aggiungere 330 ml di soluzione C (la no-proteina di controllo) al tubo finale nella colonna F.
3. Equilibrare le soluzioni a 37 ° C per cinque minuti. Suggerimento: dopo 5 minuti, tagliare i tappi dei tubi al centro del riscaldamento blocco per impedire loro di interferire con la pipetta multicanale da utilizzare prossimo.
4. Utilizzando un microlitri 5-50 VWR multicanale pipetta, trasferire 50 microlitri dai tubi nella colonna F in ciascuno dei tubi in colonne AE. Avviare il timer non appena il primo tubo è misto.
5. A 2, 4, e 6 minuti togliere 20 l di campione con il multi-canale pipetta e aggiungere alla soluzione di stop.
6. Nota: i campioni in soluzione di arresto può essere coperto in involucro di plastica e congelato a -20 ° C per l'elaborazione successiva. Le piastre devono essere scongelati a temperatura ambiente prima reazione con TNBS.

3) TNBS di reazione e di sviluppo del colore

1. Aggiungere 50 ml di soluzione di mm 10 TNBS alla soluzione di smettere di usare il multi-canale pipetta e poi incubare a 42 ° C per 6 minuti. La soluzione diventerà di un colore giallo scuro / arancione come TNBS reagisce con la lisina e la cadaverina.
2. Dopo 6 minuti, raffreddare la piastra su ghiaccio per rallentare la reazione.
3. Rimuovere 100 l di campione mediante una VWR 20-200 microlitri pipetta multicanale e posto nel piatto 2 ml pozzo profondo che è stato raffreddato in ghiaccio. Trasferimento di ghiaccio secchiello per il fumehood.
4. Aggiungere 500 microlitri toluene in ogni pozzetto utilizzando una HandyStep (Brand) pipettatore ripetere e 12,5 mL puntale (PLASTIBRAND).
5. Togliere ogni eccesso toluene utilizzando un kimwipe e coprire il piatto con le strisce di nastro da imballaggio. Assicurati di premere con decisione per ottenere una buona tenuta. Coprire la piastra a 96 pozzetti con un coperchio piatto e poi agitare energicamente per 1 minuto e 30 secondi.
6. Lasciare le soluzioni per risolvere per 5 minuti. Il TNP-cadaverina è ora in fase superiore toluene, mentre il TNP-lisina rimane solubile in acqua (vedi Figura 1).
7. Prelevare 200 ml di toluene con il 20-200 microlitri multicanale pipetta in una piastra da 96 pozzetti per la lettura. Nota: assicuratevi di controllare che ogni campione viene rimosso è chiaro e non ha alcun fine della fase acquosa. Nota: consigli per l'uso barriera per evitare danni alla pipetta multicanale dal toluene.
8. Leggere l'assorbanza a 340 nm in un lettore di piastre SpectraMax 340.
9. Per pulire la piastra di quarzo, sciacquare il toluene con acqua e posizionare la piastra di quarzo in un grandevassoio di vetro della cappa. Versare sopra 100 ml di una miscela 7:03 del 70% (v / v) di acido nitrico: 95% (v / v) di etanolo e coprire la piastra di quarzo con un vassoio di vetro secondo. Attenzione: la reazione è altamente esotermica protezione contro l'usura e, a volte esplosiva e accertarsi che l'anta cappa è impostato per abbassare il "livello 6 Dopo il raffreddamento, l'acido nitrico lavare con acqua e poi etanolo al 95%..

4) Rappresentante Risultati

1) cadaverina curva standard (Figura 3)
Il test è stato eseguito come descritto ma senza L-lisina o LdcI e le concentrazioni invece diverse cadaverina sono stati utilizzati per determinare empiricamente la gamma lineare del test. Il test è stato lineare a un OD ₃₄₀ di 0,25, corrispondente a ~ 22 nmoli di cadaverina (Figura 3).

2) Attività di LdcI (Figura 4)
L'attività di LdcI solo è stato determinato in 153,5 (± 18.1) nmoli cadaverina min-1 mg LdcI-1 a pH 6,5. L'attività di LdcI non è influenzato in presenza di 100 mM GTP o PIL, ma è fortemente inibita (> 10 volte) in presenza di pppGpp e ppGpp (Figura 4).

Figura 1. Schema della reazione LdcI. La reazione di decarbossilazione della L-lisina per generare CO ₂ e cadaverina è mostrata così come la reazione successiva con TNBS a pH elevato per generare N, N-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverina) e N, N '-bistrinitrophenyllysine (TNP-lisina). Sulla base di Phan et al.11

Figura 2. Impostazione del termostato Eppendorf. La disposizione dei campioni nei 24 pozzetti ThermoStat Eppendorf è indicato insieme con la descrizione delle fasi del test (indicata in grassetto). Le frecce indicano il trasferimento di soluzioni di reazione secondo il protocollo. Rimozione della soluzione di reazione alla soluzione fermare nella piastra a 96 pozzetti è anche indicato.

Figura 3. Cadaverina curva standard. Un grafico dell'assorbanza a 340 nm contro nmoli di cadaverina è mostrato. Barre di errore rappresentano la deviazione standard di almeno tre misurazioni indipendenti. La retta di regressione è anche mostrato e ha una R2 di 0,996.

Figura 4. Risultati del dosaggio LdcI. Un grafico del tasso di attività LdcI (in nmoli cadaverina prodotta min-1-1 mg LdcI) è indicato in presenza di mM GTP 100, PIL, pppGpp, ppGpp e in assenza di nucleotide. I nucleotidi risposta stringenti (p) ppGpp sono in grado di inibire in modo significativo l'attività LdcI. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard di almeno sei misurazioni indipendenti.

Nel test lisina decarbossilasi, TNBS viene fatto reagire con le ammine primarie di L-lisina e cadaverina per formare TNP-lisina e TNP-cadaverina addotti (Figura 1). A causa della presenza del gruppo carbossilico sul TNP-lisina, questo addotto rimane solubile in acqua, mentre il TNP-cadaverina, manca il gruppo carbossilico, è in grado di partizionamento in toluene ^11. Questo tipo di analisi può essere utilizzata più ampiamente su altri tipi di aminoacidi in cui la perdita di un gruppo carbossilico si verifica durante la reazione. Questo si verifica durante la decarbossilazione della L-ornitina dal SpeF inducibile ornitina decarbossilasi per formare la putrescina poliammina ⁷ e la decarbossilazione della L-arginina dalla decarbossilasi arginina Adia inducibile per formare il poliammina agmatina ^4.

Il test LdcI qui descritto fornisce un metodo relativamente veloce per la determinazione dell'attività della proteina purificata in vitro. I principali vantaggi di questo test sono:

i) L'uso di più repliche per sperimentare migliora la precisione di ogni misura;

ii) L'analisi può essere condotta in una vasta gamma di condizioni di buffer (pH differenti, sale, agente di riduzione ecc) senza modifiche al protocollo;

iii) Il test può essere modificato per la misurazione in vivo di LdcI determinando la quantità di cadaverina espulso durante la crescita delle cellule.

I limiti principali di questo test sono:

i) La sensibilità degli esperimenti sono limitati dalla gamma lineare dell'assorbanza del TNP-addotti;

ii) Le fasi di lavorazione più aumentare l'entità degli errori sperimentali;

iii) Non tutte le decarboxylases aminoacidi sono riconducibili a questo tipo di protocollo. Per esempio, la decarbossilazione di acido L-glutammico dal decarboxylases acido glutammico inducibile Gada / GadB genera γ-amino-butirrico ^2, il TNBS di addotti delle quali saranno solubili in acqua a causa della presenza della catena laterale carbossilico di gruppo.

Le indagini biochimiche della risposta di stress acido di E. coli è una zona in espansione della ricerca e ci permetterà di comprendere meglio le basi molecolari della risposta allo stress in E. coli relativi γ-proteobatteri che hanno simili sistemi acido risposta allo stress, come Salmonella enterica sierotipo Typhimurium ¹² e Vibrio colera ^13. e La scoperta che l'attività LdcI è inibita dalla ppGpp stringenti regolatore di risposta ci ha fornito una visione sconosciuta nella regolamentazione di questa proteina.

Ringraziamo il Dr. Dr. Michael Cashel (National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA) per averci inviato ceppi batterici, plasmidi e protocolli necessari. Ringraziamo il Dr. John Glover (Dipartimento di Biochimica, Università di Toronto) per l'utilizzo del lettore di piastre SpecraMax. Regno Unito è il destinatario di una Nazionale di Scienze e Ingegneria Research Council del Canada (NSERC) Borsa di studio post-laurea, un Canadian Institutes of Research Program Formazione Salute strategica nella biologia strutturale delle proteine ​​di membrana collegato a malattie, e una borsa di studio dell'Università di Toronto Open. Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della Canadian Institutes of Health Research (MOP-67210) per WAH.