Um ensaio para medir a atividade do Escherichia coli Induzível Lisina Decarboxyase

A atividade da descarboxilase induzível lisina é monitorado pela reação do substrato L-lisina e cadaverina o produto com 2,4,6 trinitrobenzensulfonic-ácido para formar adutos que têm solubilidade diferencial em tolueno.

A Escherichia coli é uma bactéria entérica que é capaz de crescer em uma ampla faixa de valores de pH (pH 5-9) ¹ e, incrivelmente, é capaz de sobreviver ácido extremo frisa, incluindo a passagem pelo estômago de mamíferos, onde o pH pode cair para valores tão baixos como pH 1 - ² 2. Para habilitar a um leque tão amplo de sobrevivência pH ácido, E. coli possui quatro diferentes induzível decarboxylases aminoácido que decarboxylate ácidos seu substrato aminoácidos de uma maneira próton-dependentes elevando o pH interno. O decarboxylases incluem o ácido glutâmico decarboxylases Gada e GadB ^3, a arginina descarboxilase Adia ^4, a lisina descarboxilase LdcI ^{5, 6} e ornitina decarboxilase SpeF ^7. Todas essas enzimas utilizam piridoxal-5'-fosfato como um co-fator ⁸ e funcionam em conjunto com a membrana interna-substrato-produto antiporters que remover produtos descarboxilação ao meio externo, em troca de substrato fresco ^2. No caso de LdcI, o antiporter lisina cadaverina é chamado CADB. Recentemente, nós determinamos a estrutura de cristal de raios-X de LdcI a 2,0 Å, e nós descobrimos um romance de pequenas moléculas obrigado a LdcI o regulador de guanosina 5'-difosfato rigorosos resposta, difosfato-3'(ppGpp) ^14. A resposta severas ocorre quando as células em crescimento exponencial experiência de privação de nutrientes ou uma de uma série de outros estresses ^9. Como resultado, as células produzem ppGpp que leva a uma cascata de sinalização que culminou com a mudança de crescimento exponencial para o crescimento da fase estacionária ^10. Nós demonstramos que ppGpp é um inibidor específico da LdcI ^14. Aqui nós descrevemos o ensaio descarboxilase lisina, modificado a partir do ensaio desenvolvido por Phan et al. ^11, que temos usado para determinar a atividade de LdcI eo efeito de pppGpp / ppGpp essa actividade. A reação de descarboxilação LdcI remove o grupo α-carboxila de L-lisina e produz dióxido de carbono ea cadaverina poliamina (1,5-diaminopentane) ^5. L-lisina e cadaverina pode ser reagido com ácido 2,4,6-trinitrobenzensulfonic (TNBS) em pH elevado para gerar N, N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverina) e N, N'-bistrinitrophenyllysine (TNP-lisina), respectivamente ^11. O TNP-cadaverina podem ser separados do TNP-lisina como o primeiro é solúvel em solventes orgânicos como o tolueno, enquanto o último não é (ver Figura 1). A faixa linear do ensaio foi determinada empiricamente usando purificada cadaverina.

1) Reagentes e Equipamentos

1. Primeiro, prepare as três seguintes soluções: 1 mL de uma solução que é composta de 8 mM L-lisina, 100 mM de sódio 2 - (N-Morfolino) ethanesulphonic ácido (MES) pH 6,5, 0,2 mM de nucleotídeos, onde o nucleotídeo é ou: difosfato de guanosina (GDP), o trifosfato de guanosina (GTP), guanosina 5'-difosfato, difosfato-3'(ppGpp), ou guanosina 5'-trifosfato, difosfato-3'(pppGpp), 0,1 mM piridoxal-5'-fosfato (PLP), e 1 mM β-mercaptoetanol / (β-ME). 1 mL da solução B, que consiste em sódio 100 mM MES pH 6,5, 0,1 mM PLP, 1 mM β-ME, e 50 nM LdcI. LdcI foi purificada como descrito no Snider et al. ⁶ e Kanjee et al. ^14.
   1 mL da solução C que é idêntico a Solução B, mas não contém LdcI.
2. Prepare 100 mL da solução de parada consistindo de um carbonato de sódio M (10,6 g/100 mL) e alíquota de 50 mL em cada poço de uma placa de poliestireno de 96 poços, utilizando uma pipeta multi-canal. Adicionar 30 mL de água para a placa e em seguida, cobrir. Note que a soma do volume de água adicionada e do volume de amostra extraída durante a reação enzimática deve ser igual a 50 mL. Neste caso, 20 mL de amostra reação enzimática será removido.
3. Prepare 5 mL de solução TNBS em 10 mM diluindo 294 mL de 5% (w / v) ações TNBS com 4706 mL de água, embrulhe em papel alumínio e mantenha no gelo.
4. Equilibrar a ThermoStat Eppendorf Além disso, a 37 ° C. O Plus ThermoStat tem 24 poços em seis colunas. Veja a Figura 2 para esquemática. Rótulo 1,5 mL tubos Eppendorf indicando a identidade do nucleotídeo, que será testado (um por coluna): GTP (coluna A), o PIB (coluna B), ppGpp (coluna C), pppGpp (coluna D), não nucleotídeo (coluna E ), e amostras de proteínas (coluna F).
5. Caixas de rack de várias dicas de 200 mL de tal forma que cada linha alternativa é omitido dando um total de quatro linhas de dicas. Isso é necessário para o uso da pipeta multi-canal com o termostato heatblock Além disso, durante o ensaio enzimático.
6. Equilibrar Digital Heatblock (VWR) a 42 ° C.
7. Coloque um de 96 poços da placa de polipropileno 2,0 mL sobre o gelo para esfriar.

2) Ensaio LdcI

1. Alíquota de 50 mL de uma solução com o nucleotídeo apropriada para tubos de 1,5 mL Eppendorf em cada uma das cinco colunas do termostato Eppendorf.
2. Adicionar 330 mL da solução B para três tubos na coluna F e adicione 330 ml de solução C (o controle não-proteína) ao tubo finais na coluna F.
3. Equilibrar as soluções a 37 ° C por cinco minutos. Dica: depois de 5 minutos, corte as tampas dos tubos no centro do bloco de aquecimento para impedi-los de interferir com a pipeta multicanal para ser utilizado próximo.
4. Usando um 50-50 mL VWR multi-canal de pipeta, 50 mL de transferência dos tubos na coluna F para cada um dos tubos em colunas AE. Iniciar o cronômetro assim que o primeiro tubo é misturado.
5. Aos 2, 4 e 6 minutos retirar 20 mL de amostra usando a pipeta multi-canal e adicionar à solução de parada.
6. Nota: as amostras em solução de parada pode ser percorrida em filme plástico e congeladas a -20 ° C para posterior processamento. As placas devem ser descongeladas em temperatura ambiente antes da reação com TNBS.

3) Reação TNBS e Desenvolvimento Cor

1. Adicionar 50 mL de solução de 10 mM TNBS para a solução parar de usar a pipeta multi-canal e, em seguida, incubar a 42 ° C por 6 minutos. A solução vai virar uma cor amarelo escuro / laranja como o TNBS reage com a lisina ea cadaverina.
2. Após 6 minutos, arrefecer a placa de gelo para diminuir a reação.
3. Remover 100 mL de amostra com uma pipeta VWR 2-20 multi-canal L e lugar na 2 mL prato fundo bem que foi resfriado em gelo. Transferência balde de gelo para o fumehood.
4. Adicionar 500 mL de tolueno em cada cavidade utilizando um HandyStep (Marca) pipetador de repetição e 12,5 mL pipeta ponta (PLASTIBRAND).
5. Limpe qualquer excesso de tolueno usando um kimwipe e cobrir o prato com tiras de fita de embalagem. Certifique-se de pressionar firmemente para obter uma boa vedação. Cobrir a placa de 96 poços com uma tampa plana e, em seguida, agitar vigorosamente por 1 minuto e 30 segundos.
6. Deixe as soluções para resolver durante 5 minutos. O TNP-cadaverina está agora na fase superior tolueno, enquanto que o TNP-lisina permanece solúvel em água (ver Figura 1).
7. Remover 200 mL de tolueno usando a 20-200 pipeta multi-canal mL em uma placa de 96 poços para leitura. Nota: certifique-se de verificar que cada amostra está sendo removido é clara e não tem qualquer fundo da fase aquosa. Nota: Dicas de uso de barreira para evitar danos ao multi-canal de pipeta pelo tolueno.
8. Ler a absorvância a 340 nm em um leitor de placas SpectraMax 340.
9. Para limpar a placa de quartzo, lavar o tolueno com água e colocar a placa de quartzo em um grandebandeja de vidro na capela. Despeje sobre 100 mL de uma mistura 07:03 de 70% (v / v) de ácido nítrico: 95% (v / v) etanol e cobrir a placa de quartzo com uma bandeja de vidro segundo. Atenção: a reação é altamente exotérmica proteção contra o desgaste e às vezes explosiva apropriadas e assegurar que a folha capela está definido para o menor nível 6 "Após arrefecimento, lavar o ácido nítrico com água e depois 95% de etanol..

4) Resultados Representante

1) cadaverina Curva padrão (Figura 3)
O ensaio foi realizado como descrito, mas sem qualquer L-lisina ou LdcI e concentrações em vez de vários cadaverina foram usados ​​para determinar empiricamente a faixa linear do ensaio. O ensaio foi linear para um OD ₃₄₀ de 0,25, correspondendo a ~ 22 nmoles de cadaverina (Figura 3).

Atividade 2) de LdcI (Figura 4)
A atividade de LdcI sozinho estava determinado a ser 153,5 (± 18,1) nmoles cadaverina min-1 mg LdcI-1 em pH 6,5. A atividade de LdcI não é afetada na presença de 100 mM GTP ou GDP, mas é fortemente inibida (> 10 vezes) na presença de pppGpp e ppGpp (Figura 4).

Figura 1. Esquema da reação LdcI. A reação de descarboxilação de L-lisina para gerar CO ₂ e cadaverina é mostrado, assim como a reação subseqüente com TNBS em pH elevado para gerar N, N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-cadaverina) e N, N '-bistrinitrophenyllysine (TNP-lisina). Baseado em Phan et al.11

Figura 2. Configuração do termostato Eppendorf. O layout das amostras no ThermoStat Eppendorf de 24 poços é mostrada junto com a descrição das etapas do ensaio (indicado em negrito). As setas indicam a transferência de soluções de reação de acordo com o protocolo. Remoção da solução de reação à solução de parada na placa de 96 poços também é indicado.

Figura 3. Cadaverina curva padrão. Um gráfico de absorvância a 340 nm contra nmoles de cadaverina é mostrado. Barras de erro representam o desvio padrão de pelo menos três medições independentes. A linha de melhor ajuste também é mostrada e tem um R2 de 0,996.

Figura 4. Os resultados do ensaio LdcI. Um gráfico da taxa de atividade LdcI (em nmoles cadaverina produzido min-1 g-1 LdcI) é mostrada na presença de 100 mM GTP, GDP, pppGpp, ppGpp e na ausência de nucleotídeos. Os nucleotídeos resposta rigorosa (p) ppGpp são capazes de inibir significativamente a atividade LdcI. As barras de erro representam o desvio padrão de pelo menos seis medições independentes.

No ensaio descarboxilase lisina, TNBS é reagido com as aminas primárias de L-lisina e cadaverina para formar TNP-lisina e cadaverina TNP-adutos (Figura 1). Devido à presença do grupo de ácido carboxílico em TNP-lisina, este permanece aduto solúvel em água, enquanto o TNP-cadaverina, faltando o grupo ácido carboxílico, é capaz de particionamento em tolueno ^11. Este tipo de ensaio pode ser utilizado de forma mais ampla em outros tipos de aminoácidos, onde a perda de um grupo de ácido carboxílico ocorre durante a reação. Isso ocorre durante a descarboxilação da L-ornitina pela SpeF ornitina descarboxilase induzível para formar a putrescina poliamina ⁷ ea descarboxilação da L-arginina pela arginina descarboxilase induzível Adia para formar a agmatina poliamina ^4.

O ensaio aqui descrito LdcI fornece um método relativamente rápido para a determinação da atividade da proteína purificada in vitro. As principais vantagens deste teste são:

i) Utilização de múltiplas repetições por experimento melhora a precisão de cada medida;

ii) O ensaio pode ser conduzido em uma ampla gama de condições de tampão (pH diferente, sal, agente redutor, etc), sem modificação do protocolo;

iii) O ensaio pode ser modificado para medir a atividade in vivo de LdcI determinando a quantidade de cadaverina excretado durante o crescimento celular.

As principais limitações deste ensaio são:

i) A sensibilidade dos experimentos são limitados pela faixa linear de absorbância do TNP-adutos;

ii) As etapas de processamento múltiplas aumentam a magnitude dos erros experimentais;

iii) Nem todos os decarboxylases aminoácidos são passíveis a este tipo de protocolo. Por exemplo, a descarboxilação do ácido L-glutâmico pela induzível decarboxylases ácido glutâmico Gada / GadB gera γ-amino-butírico ^2, o TNBS aduto de que será solúvel em água, devido à presença do ácido carboxílico de cadeia lateral grupo.

A investigação bioquímica da resposta ao estresse ácido de E. coli é uma expansão da área de pesquisa e vai nos permitir entender melhor a base molecular da resposta ao estresse em E. e Escherichia relacionadas γ-proteobactérias que têm sistemas semelhantes de ácido resposta ao estresse, tais como Salmonella enterica serovar Typhimurium ¹² e cólera Vibrio ^13. A descoberta de que a atividade LdcI é inibida pela ppGpp rigorosos resposta do regulador nos proporcionou uma visão até então desconhecida para a regulação dessa proteína.

Agradecemos ao Dr. Dr. Michael Cashel (National Institutes of Health, Bethesda, MA, EUA) por enviar cepas de bactérias, plasmídeos, e protocolos necessários. Agradecemos ao Dr. John Glover (Department of Biochemistry, University of Toronto) para uso do leitor de placas SpecraMax. Reino Unido é o destinatário de uma National Ciências e Pesquisa de Engenharia Council of Canada (NSERC) Bolsa de Pós-Graduação, a Canadian Institutes of Health Programa de Formação de Investigação Estratégica na Biologia Estrutural de Proteínas de Membrana ligados à doença, e da Universidade de Toronto Fellowship Open. Este trabalho foi financiado por uma doação do Canadian Institutes of Health Research (MOP-67210) para WAH.