على الفحص لقياس نشاط القولونية محرض يسين Decarboxyase

ويتم رصد نشاط كربوكسيل محرض يسين عن طريق تفاعل الركيزة L - يسين وكادافيرين المنتج مع 2،4،6 trinitrobenzensulfonic الحمضية لتشكيل adducts التي الذوبان في الفرق التولوين.

كولاي هي البكتيريا المعوية التي هي قادرة على النمو أكثر من مجموعة واسعة من قيم الرقم الهيدروجيني (درجة الحموضة) 9 -- 5 ¹ ، وبشكل لا يصدق ، قادرة على البقاء على قيد الحياة حمض المدقع تؤكد بما في ذلك المرور عبر المعدة الثدييات حيث درجة الحموضة يمكن أن تقع على أنها منخفضة ودرجة الحموضة ^1-02 فبراير. لتمكين هذه مجموعة واسعة من بقاء درجة الحموضة الحمضية ، E. القولونية يمتلك أربعة أنواع مختلفة من الأحماض الأمينية decarboxylases محرض decarboxylate أن الأحماض الأمينية الركيزة بهم بطريقة بروتون التي تعتمد على رفع درجة الحموضة وبالتالي الداخلية. وdecarboxylases تشمل حمض الغلوتاميك decarboxylases جدة وGadB ³ ، وجهاز أبوظبي للاستثمار كربوكسيل أرجينين ⁴ ، كربوكسيل يسين LdcI ^{5 و 6} و ⁷ كربوكسيل الأورنيثين SpeF. كل هذه الانزيمات الاستفادة بيريدكسال - 5' - phospate كعامل المشترك ⁽⁸⁾ وظيفة مع antiporters الركيزة المنتج ، التي تعمل على إزالة الغشاء الداخلي للمنتجات نزع الكربوكسيل الخارجية في المتوسط ​​مقابل ² الركيزة الطازجة. في حالة LdcI ، يسمى antiporter يسين - كادافيرين CadB. مؤخرا ، مصممون على التركيب البلوري للأشعة السينية من LdcI إلى 2.0 ، واكتشفنا رواية صغيرة جزيء منضمة إلى LdcI المنظم استجابة صارمة غوانوزين 5' - ثنائي فسفات ، 3' - ثنائي فسفات (ppGpp) ^14. استجابة صارمة يحدث عندما الخلايا المتنامية باطراد تجربة الحرمان المغذيات أو واحد من عدد من الضغوط الأخرى ^9. نتيجة لذلك ، تنتج خلايا ppGpp الأمر الذي يؤدي إلى تتالي إشارات وبلغت ذروتها في التحول من النمو المتسارع للنمو ثابتة المرحلة ^10. لقد أثبتنا أن ppGpp هو المانع محددة من LdcI ^14. نحن هنا وصف مقايسة كربوكسيل يسين ، من تعديل المقايسة التي وضعتها فان وآخرون ¹¹ ، التي استخدمناها لتحديد نشاط LdcI وتأثير pppGpp / ppGpp على هذا النشاط. تفاعل نزع الكربوكسيل LdcI يزيل مجموعة α - L - كربوكسي ليسين وينتج غاز ثاني أكسيد الكربون وكادافيرين البوليامين (1،5 - diaminopentane) ^5. يمكن أن يكون رد فعل L - يسين وكادافيرين مع 2،4،6 - trinitrobenzensulfonic حمض (TNBS) عند درجة الحموضة العالية لتوليد N ، N' bistrinitrophenylcadaverine - (TNP - كادافيرين) و N ، N' bistrinitrophenyllysine - (TNP - يسين) ، على التوالي ^11. ويمكن فصل TNP - كادافيرين من ليسين ، كما TNP السابق قابل للذوبان في المذيبات العضوية مثل التولوين في حين أن الأخيرة ليست (أنظر الشكل 1). تم تحديد مجموعة خطية من مقايسة به تجريبيا كادافيرين المنقى.

1) الكواشف والمعدات

1. أولا ، إعداد الحلول الثلاثة التالية : 1 مل من الحل الذي يتكون من 8 مم L - يسين ، 100 ملي الصوديوم 2 -- (N - Morpholino) ethanesulphonic حمض (MES) الرقم الهيدروجيني 6.5 ، 0.2 ملم النوكليوتيدات ، حيث يتم النوكليوتيدات إما : ثنائي فسفات غوانوزين (GDP) ، غوانوزين ثلاثي الفوسفات (GTP) ، غوانوزين 5' - ثنائي فسفات ، 3' - ثنائي فسفات (ppGpp) ، أو غوانوزين 5' - ثلاثي الفوسفات ، 3' - ثنائي فسفات (pppGpp) ، 0.1 ملم بيريدكسال 5' - الفوسفات (حزب العمال التقدمي) ، و 1 ملي β - المركابتويثانول / (β - ME). 1 مل من محلول B الذي يتكون من 100 ملي MES الصوديوم الهيدروجيني 6.5 ، 0.1 ملم حزب العمال التقدمي ، 1 ملم β - ME ، و 50 LdcI نانومتر. تمت تنقية LdcI كما هو موضح في سنايدر وآخرون ⁽⁶⁾ وآخرون Kanjee ^14.
   1 مل من محلول C التي هي مطابقة لB الحل ولكنها لا تحتوي على LdcI.
2. تحضير 100 مل من محلول وقف تتكون من كربونات الصوديوم 1 م (10.6 g/100 مل) ، وقسامة 50 ميكرولتر جيدا في كل من لوحة البوليسترين 96 - جيدا باستخدام ماصة متعدد القنوات. إضافة 30 ميكرولتر من الماء لتغطية لوحة والحين. علما أن مجموع كميات المياه المضافة وحجم العينة المستخرجة خلال تفاعل إنزيم يجب أن تساوي 50 ميكرولتر. في هذه الحالة ، سيتم إزالة 20 ميكرولتر من العينة رد فعل الانزيم.
3. إعداد 5 مل من محلول TNBS 10 مم في تمييع 294 ميكرولتر من 5 ٪ (W / V) TNBS الأسهم مع 4706 ميكرولتر المياه ، التفاف في رقائق الألومنيوم والحفاظ على الجليد.
4. يوازن ميزان الحرارة إيبندورف زائد في 37 درجة مئوية. زائد ثيرموستات من 24 بئرا في 6 أعمدة. انظر الشكل رقم 2 لالتخطيطي. التسمية 1.5 مل أنابيب إيبندورف يدل على هوية النوكليوتيدات التي سيتم اختبار (واحد لكل عمود) : GTP (العمود A) ، الناتج المحلي الإجمالي (العمود B) ، ppGpp (العمود C) ، pppGpp (العمود D) ، أي النوكليوتيدات (العمود E ) ، وعينات من البروتين (العمود F).
5. مربعات رفوف العديد من نصائح 200 ميكرولتر بحيث يتم حذف كل صف بديل يعطي ما مجموعه أربعة صفوف من النصائح. هذا أمر ضروري لاستخدام ماصة متعددة القنوات مع ثيرموستات بلس heatblock خلال فحص الانزيم.
6. يوازن Heatblock الرقمية (VWR) في 42 درجة مئوية.
7. وضع 96 - 2.0 مل كذلك البولي بروبلين لوحة على الجليد لتبرد.

2) الفحص LdcI

1. قسامة 50 ميكرولتر من التوصل إلى حل مع النوكليوتيدات المناسبة للأنابيب 1.5 مل إيبندورف في كل من الأعمدة الخمسة لترموستات إيبندورف.
2. إضافة 330 ميكرولتر باء حلول لثلاثة أنابيب في العمود F وإضافة 330 ميكرولتر من C الحل (لسيطرة أي من البروتين) إلى أنبوب النهائي في العمود F.
3. يوازن الحلول في 37 لمدة خمس دقائق درجة مئوية. نصيحة : بعد 5 دقائق ، وقطع من أنابيب القبعات في وسط كتلة التدفئة لمنعهم من التدخل في الأقنية ماصة لاستخدامها المقبل.
4. باستخدام ميكرولتر 50-50 VWR متعدد القنوات ماصة ، ونقل 50 ميكرولتر من الأنابيب في العمود F في كل من أنابيب في أعمدة AE. بدء موقت حالما الأنبوب الأول هو مختلط.
5. في 2 و 4 و 6 دقائق إزالة 20 ميكرولتر من العينة باستخدام ماصة متعدد القنوات وإضافة إلى الحل يتوقف.
6. ملاحظة : يمكن تغطيتها العينات في حل توقف في غلاف بلاستيكي والمجمدة في -20 درجة مئوية لمدة معالجة لاحقة. يجب إذابة لوحات في درجة حرارة الغرفة قبل التفاعل مع TNBS.

3) التفاعل والتنمية TNBS اللون

1. إضافة 50 ميكرولتر من 10 ملي TNBS الحل في حل التوقف عن استخدام ماصة متعدد القنوات ثم احتضان حوالي 42 درجة مئوية لمدة 6 دقائق. سيكون الحل بدوره داكنة اللون الأصفر / البرتقالي كما TNBS يتفاعل مع يسين وكادافيرين و.
2. بعد 6 دقائق ، لوحة باردة على الجليد لإبطاء التفاعل.
3. إزالة 100 ميكرولتر من العينة باستخدام 2-20 VWR ميكرولتر ماصة متعدد القنوات والمكان في لوحة 2 مل الآبار العميقة التي تم تبريده على الجليد. نقل دلو من الجليد في fumehood.
4. إضافة إلى 500 ميكرولتر التولوين باستخدام كل بئر HandyStep (العلامة التجارية) pipettor تكرار و 12.5 مل ماصة الحافة (Plastibrand).
5. امسحي أي التولوين الزائدة باستخدام kimwipe وتغطية لوحة مع شرائط من الشريط التعبئة والتغليف. تأكد في الضغط بقوة للحصول على ختم جيدة. تغطية لوحة 96 - جيدا مع غطاء مسطح ويهز بقوة ثم لمدة 1 دقيقة و 30 ثانية.
6. ترك الحلول لتسوية لمدة 5 دقائق. وTNP - كادافيرين الآن في المرحلة التولوين العلوي ، في حين لا يزال TNP - يسين للذوبان في الماء (انظر الشكل 1).
7. إزالة 200 ميكرولتر من التولوين باستخدام 2-20 ميكرولتر ماصة متعدد القنوات في لوحة 96 - جيد للقراءة. ملاحظة : تأكد للتأكد من أن كل عينة يتم إزالتها واضحة وليس لديها أي من المرحلة مائي القاع. ملاحظة : نصائح استخدام حاجز لمنع تلف متعدد القنوات ماصة من التولوين.
8. قراءة الامتصاصية في 340 نانومتر في صفيحة SpectraMax القارئ 340.
9. لتنظيف لوحة الكوارتز ، والتشطيف بالماء والتولوين ووضع لوحة كبيرة في الكوارتزعلبة زجاج في غطاء الدخان. صب أكثر من 100 مل من مزيج 07:03 من 70 ٪ (V / V) حامض النتريك : 95 ٪ (V / V) الايثانول وتغطية لوحة الكوارتز مع علبة زجاج الثانية. تحذير : رد الفعل هو الطاردة للحرارة العالية والمتفجرة في بعض الأحيان بارتداء الحماية المناسبة وضمان أن يتم تعيين وشاح غطاء الدخان الى أدنى مستوى "(6) وبعد التبريد ، وتغسل بماء حامض النيتريك ثم الايثانول 95 ٪.

نتائج الممثل 4)

1) منحنى قياسي كادافيرين (الشكل 3)
تم إجراء الفحص كما هو موضح ولكن من دون أي L - يسين أو LdcI واستخدمت بدلا من تركيزات مختلفة لتحديد كادافيرين تجريبيا مجموعة خطية من الفحص. كان مقايسة خطية إلى ₃₄₀ من OD 0.25 ، الموافق 22 nmoles ~ من كادافيرين (الشكل 3).

2) نشاط LdcI (الشكل 4)
تم تحديد نشاط LdcI وحدها لتكون 153.5 (± 18.1) nmoles كادافيرين دقيقة - 1 - 1 ميكروغرام LdcI عند pH 6.5. نشاط LdcI تتأثر في وجود 100 ميكرومتر GTP أو الناتج المحلي الإجمالي ولكنها منعت بقوة (> 10 أضعاف) في حضور وpppGpp ppGpp (الشكل 4).

الشكل 1. الرسم التخطيطي للتفاعل LdcI. يظهر رد فعل لنزع الكربوكسيل L - يسين لتوليد ثاني أكسيد الكربون ₍₂₎ وكادافيرين فضلا عن رد الفعل لاحقة مع TNBS عند درجة الحموضة العالية لتوليد N ، N' bistrinitrophenylcadaverine - (TNP - كادافيرين) و ن ، ن '- bistrinitrophenyllysine (TNP - يسين). استنادا فان آخرون al.11

الشكل 2. الإعداد لترموستات إيبندورف. يظهر تخطيط عينات في 24 ثيرموستات إيبندورف جيدا جنبا إلى جنب مع وصف للخطوات مقايسة (المشار إليها في غامق). تشير الأسهم لنقل الحلول التفاعل وفقا للبروتوكول. وأشار أيضا إلى إزالة محلول التفاعل في حل توقف في لوحة 96 - جيدا.

الشكل 3. كادافيرين قياسي المنحنى. يظهر قطعة الامتصاصية في 340 نانومتر مقابل nmoles من كادافيرين. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري على الأقل ثلاثة قياسات مستقلة. ويظهر أيضا خط الأنسب ولها R2 من 0.996.

الشكل 4. نتائج الفحص LdcI (المنتجة في nmoles كادافيرين دقيقة - 1 - 1 ميكروغرام LdcI) قطعة من معدل النشاط LdcI هو مبين في وجود 100 ميكرومتر GTP الناتج المحلي الإجمالي ، pppGpp ، وppGpp في غياب النوكليوتيدات. وردا النيوكليوتيدات صرامة (ع) ppGpp قادرة على تثبيط نشاط LdcI بشكل ملحوظ. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري لا يقل عن ستة قياسات مستقلة.

في مقايسة كربوكسيل يسين ، هو رد فعل TNBS مع الأمينات الأولية من L - يسين وكادافيرين لتشكيل ليسين وTNP - TNP - كادافيرين adducts (الشكل 1). نظرا لوجود مجموعة من حمض الكربوكسيلية على TNP - يسين ، وهذا ناتج إضافة تبقى قابلة للذوبان في الماء بينما TNP - كادافيرين ، التي تفتقر إلى مجموعة حمض الكربوكسيلية ، قادر على التقسيم الى ¹¹ التولوين. ويمكن استخدام هذا النوع من الفحص بشكل أوسع على أنواع أخرى من الأحماض الأمينية حيث فقدان مجموعة حمض الكربوكسيلية يحدث أثناء التفاعل. هذا يحدث من خلال نزع الكربوكسيل الأورنيثين - L من محرض SpeF كربوكسيل الأورنيثين لتشكيل بوتريسين البوليامين ⁽⁷⁾ ونزع الكربوكسيل من أرجينين - L جهاز أبوظبي للاستثمار من قبل كربوكسيل محرض أرجينين لتشكيل أغماتين البوليامين ^4.

في مقايسة LdcI الموصوفة هنا يوفر طريقة سريعة نسبيا لتحديد نشاط البروتين النقي في المختبر. المزايا الرئيسية لهذا الاختبار هي :

ط) استخدام متعددة يعيد التجربة في تحسين دقة كل القياس ؛

قد ب) يجرى الفحص على نطاق واسع من الظروف العازلة (درجة الحموضة المختلفة ، والملح ، والحد من وكيل وغيرها) دون تعديل للبروتوكول ؛

قد III) يتم تعديل مقايسة لقياس النشاط في الجسم الحي من LdcI عن طريق تحديد كمية كادافيرين تفرز أثناء نمو الخلايا.

القيود الرئيسية لهذا الاختبار هي :

وتقتصر ط) حساسية من التجارب من قبل مجموعة خطية من الامتصاصية للTNP - adducts ؛

ب) الخطوات معالجة متعددة إلى زيادة حجم الأخطاء التجريبية ؛

ج) ليس كل الأحماض الأمينية decarboxylases قابلة لهذا النوع من البروتوكول. على سبيل المثال ، نزع الكربوكسيل من L - حمض الجلوتاميك من حمض الجلوتاميك decarboxylases محرض جدة / GadB يولد γ - زبدي حامض الأميني ، ² - ناتج إضافة TNBS التي ستكون قابلة للذوبان في الماء بسبب وجود حمض الجانب سلسلة الكربوكسيلية المجموعة.

التحقيق البيوكيميائية للحمض استجابة ضغوط E. القولونية هو مجال التوسع في البحث وسوف تسمح لنا لتحسين فهم الأساس الجزيئي للاستجابة التوتر في E. القولونية المتعلقة γ - proteobacteria التي مماثل نظم الاستجابة حمض التوتر مثل السالمونيلا التيفية الفأرية ضرب مصلي enterica ¹² و ¹³ ضمة الكوليرا. و وقد قدم هذا الاكتشاف الذي يحول دون LdcI النشاط الذي يقوم به ppGpp استجابة منظم صرامة لنا نظرة لم تكن معروفة سابقا في تنظيم هذا البروتين.

نشكر الدكتور الدكتور مايكل كشل] (المعاهد الوطنية للصحة في بيثيسدا ، MA ، الولايات المتحدة) لارسال لنا سلالات بكتيرية ، وبلاسميدات ، والبروتوكولات اللازمة. نشكر الدكتور جون غلوفر (قسم الكيمياء الحيوية في جامعة تورنتو) لاستخدام لوحة SpecraMax القارئ. المملكة المتحدة هي المستفيدة من العلوم الوطنية والهندسة مجلس البحوث كندا (NSERC) منحة دراسية عليا ، والمعاهد الكندية لأبحاث الصحة برنامج التدريب الاستراتيجية في البيولوجيا البنيوية للبروتينات غشاء مرتبط بمرض ، وزمالة جامعة تورونتو المفتوحة. وأيد هذا العمل عن طريق منحة من المعاهد الكندية للأبحاث الصحية (MOP - 67210) لواه.