Ein Assay zur Messung der Aktivität von Escherichia coli Inducible Lysin Decarboxyase

Die Aktivität der induzierbaren Lysin-Decarboxylase wird durch Umsetzung des Substrates L-Lysin und das Produkt Cadaverin mit 2,4,6-trinitrobenzensulfonic Säure-Addukte, die unterschiedliche Löslichkeit in Toluol Form überwacht.

Escherichia coli ist ein Bakterium, das in der Lage enterischen wachsender über einen weiten Bereich von pH-Werten (pH 5 bis 9) ist ¹ und, unglaublich, ist in der Lage, extreme Säure betont einschließlich Passage durch den Magen von Säugetieren, wo der pH-Wert fallen können, um so niedrig überleben wie pH ¹ bis 02 Februar. Um ein so breites Spektrum von sauren pH Überleben, E. coli besitzt vier verschiedenen induzierbaren Aminosäure Decarboxylasen dass decarboxylieren ihrem Substrat Aminosäuren in ein Proton-abhängigen Weise überhöhen dadurch die internen pH-Wert. Die Decarboxylasen gehören Glutaminsäure Decarboxylasen GADA und GadB ^3, der Arginin-Decarboxylase Adia ^4, die Lysin-Decarboxylase LdcI ^{5, 6} und die Ornithindecarboxylase SPEF ^7. Alle diese Enzyme nutzen Pyridoxal-5'-Phosphat als Co-Faktor ⁸ und Funktion zusammen mit der inneren Membran-Substrat-Produkt Antiporter dass Decarboxylierung Produkte mit dem externen Medium im Austausch für frisches Substrat ^{2 zu} entfernen. Im Falle von LdcI, wird das Lysin-Cadaverin Antiporter genannt Cadb. Kürzlich haben wir festgestellt, das X-ray Kristallstruktur von LdcI bis 2,0 Å, und wir entdeckten ein neues kleines Molekül gebunden LdcI die strengen Response-Regulator Guanosin-5'-diphosphat, 3'-diphosphat (ppGpp) ^14. Die strengen Reaktion tritt ein, wenn exponentiell wachsenden Zellen Nährstoffmangel oder eines einer Reihe von anderen betont ^{9 Erfahrungspunkte.} Als Folge produzieren die Zellen ppGpp, die zu einer Signalkaskade ihren Höhepunkt in der Verlagerung von exponentiellem Wachstum bis zur stationären Phase das Wachstum ¹⁰ führt. Wir haben gezeigt, dass ppGpp ein spezifischer Inhibitor der LdcI ¹⁴ ist. Hier beschreiben wir die Lysin-Decarboxylase-Test aus dem Test von Phan et al modifiziert. ^11, die wir verwendet haben, um die Aktivität von LdcI und die Wirkung der pppGpp / ppGpp diese Tätigkeit zu bestimmen. Die LdcI Decarboxylierung entfernt die α-Carboxygruppe von L-Lysin und produziert Kohlendioxid und das Polyamin Cadaverin (1,5-Diaminopentan) ^5. L-Lysin und Cadaverin kann mit 2,4,6-trinitrobenzensulfonic (TNBS) bei hohen pH umgesetzt werden, um N, N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-Cadaverin) und N, N'-bistrinitrophenyllysine (TNP-Lysin) zu generieren bzw. ^11. Die TNP-Cadaverin aus der TNP-Lysin als der ehemalige löslich in organischen Lösungsmitteln wie Toluol, während letzteres nicht (siehe Abbildung 1) getrennt werden. Der lineare Bereich des Assays wurde empirisch ermittelt unter Verwendung von gereinigten Cadaverin.

1) Reagenzien und Geräte

1. Zuerst bereiten Sie die folgenden drei Lösungen: 1 ml Lösung A, die aus 8 mM L-Lysin, 100 mM Natrium-2 wird - (N-Morpholino) ethansulfonsäure (MES) pH 6,5, 0,2 mM Nukleotid, wo die Nukleotid entweder: Guanosin-diphosphat (GDP), Guanosin-Triphosphat (GTP), Guanosin-5'-diphosphat, 3'-diphosphat (ppGpp) oder Guanosin-5'-Triphosphat, 3'-diphosphat (pppGpp), 0,1 mM Pyridoxal-5'-Phosphat- (PLP) und 1 mM β-Mercaptoethanol / (β-ME). 1 ml Lösung B, die von 100 mM Natrium-MES pH 6,5, 0,1 mM PLP, 1 mM β-ME und 50 nM LdcI besteht. LdcI wurde gereinigt, wie in Snider et al. ⁶ und Kanjee et al. ^14.
   1 ml Lösung C, die identisch mit Lösung B ist aber nicht enthalten LdcI.
2. Bereiten Sie 100 mL der Stop-Lösung, bestehend aus 1 M Natriumcarbonat (10,6 g/100 ml) und 50 ul Aliquot in jedes Well einer 96-Well-Polystyrol-Platte mit einem Mehrkanal-Pipette. Add 30 ul Wasser auf die Platte und dann die Abdeckung. Beachten Sie, dass die Summe der Menge Wasser zugegeben und das Volumen der Probe während der Enzymreaktion extrahiert müssen 50 ul gleich. In diesem Fall werden 20 ul der Enzymreaktion Probe entfernt werden.
3. Bereiten Sie 5 ml TNBS Lösung bei 10 mM durch Verdünnung 294 ul von 5% (w / v) TNBS Lager mit 4706 ul Wasser, in Alufolie wickeln und halten auf dem Eis.
4. Äquilibrieren der Eppendorf Thermostat und bei 37 ° C. Der Thermostat und verfügt über 24 Brunnen in 6 Spalten. Siehe Abbildung 2 für eine schematische. Label 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen unter Angabe der Identität des Nukleotids, die getestet (eine pro Spalte) werden: GTP (Spalte A), BIP (Spalte B), ppGpp (Spalte C), pppGpp (Spalte D), keine Nukleotid (Spalte E ) und Protein-Proben (Spalte F).
5. Rack mehrere Kisten mit 200 ul Tipps, so dass jeder abwechselnd hintereinander ausgelassen wird somit insgesamt vier Reihen von Spitzen. Dies ist notwendig für die Nutzung der Multi-Kanal-Pipette mit dem Plus-ThermoStat heatblock während der Enzym-Assay.
6. Äquilibrieren Digitale Heatblock (VWR) bei 42 ° C.
7. Legen Sie eine 96-well 2,0 ml Polypropylen-Platte auf Eis zu kühlen.

2) LdcI Assay

1. Aliquot 50 ul Lösung A mit dem entsprechenden Nukleotid bis 1,5 mL Eppendorf-Röhrchen in jedem der fünf Säulen des Eppendorf Thermostat.
2. Add 330 ul Lösung B auf drei Röhren in Spalte F und fügen 330 ul Lösung C (die nicht-Protein-control), um die endgültige Rohr in Spalte F.
3. Äquilibrieren Sie die Lösungen bei 37 ° C für fünf Minuten. Tipp: nach 5 Minuten, schneiden Sie die Kappen der Röhren in der Mitte des Heiz-block, sie stören die Mehrkanalpipette zum nächsten verwendet werden zu verhindern.
4. Mit einer 5-50 ul VWR Mehrkanal-Pipette 50 ul aus den Rohren in Spalte F in jedem der Rohre in den Spalten AE. Starten Sie den Timer, sobald das erste Rohr vermischt wird.
5. Bei 2, entfernen 4 und 6 Minuten 20 ul der Probe mit dem Mehrkanal-Pipette und fügen Sie die Stop-Lösung.
6. Hinweis: Proben in Stop-Lösung kann in Plastikfolie abgedeckt und bei -20 ° C für die nachfolgende Verarbeitung. Die Platten sollten bei Raumtemperatur vor der Reaktion mit TNBS aufgetaut werden.

3) TNBS Reaction und Farbentwicklung

1. Add 50 ul 10 mM TNBS Lösung für die Stop-Lösung mit dem Mehrkanal-Pipette und dann Inkubieren bei 42 ° C für 6 Minuten. Die Lösung wird wiederum ein dunkles gelb / orange Farbe wie die TNBS reagiert mit dem Lysin und Cadaverin.
2. Nach 6 Minuten, kühlen die Platte auf Eis zu einer Verlangsamung der Reaktion.
3. Nehmen Sie 100 ul der Probe mit einem VWR 20-200 ul Mehrkanalpipette und Platz in der 2 mL Deepwellplatte, dass auf Eis gekühlt wurde. Transfer-Eis-Eimer zum Abzug durchzuführen.
4. Add 500 mL Toluol in jede Vertiefung mit einem HandyStep (Brand) zu wiederholen Pipette und 12,5 ml Pipettenspitze (Plastibrand).
5. Wischen Sie überschüssiges Toluol mit einem Kimwipe und die Platte abgedeckt mit Streifen von Packband. Achten Sie darauf, fest andrücken, um eine gute Abdichtung zu erreichen. Decken Sie die 96-Well-Platte mit einem flachen Deckel und dann kräftig schütteln für 1 Minute und 30 Sekunden.
6. Verlassen Sie die Lösungen für 5 Minuten ruhen lassen. Die TNP-Cadaverin ist nun in der oberen Toluolphase, während der TNP-Lysin bleibt wasserlöslich (siehe Abbildung 1).
7. Nehmen Sie 200 ul von Toluol mit dem 20-200 ul Mehrkanalpipette in eine 96-Well-Platte für das Lesen. Hinweis: Achten Sie darauf, um zu überprüfen, dass jede Probe entfernt ist klar und hat keine der unteren wässrigen Phase. Anmerkung: Mit Barriere Tipps, um Schäden an Mehrkanal-Pipette durch das Toluol zu verhindern.
8. Extinktion bei 340 nm in einem SpectraMax 340 Platten-Lesegerät.
9. Zur Reinigung der Quarzplatte, spülen Sie das Toluol mit Wasser und legen Sie die Quarzplatte in einer großenGlasschale im Abzug. Pour über 100 ml einer 7:3-Mischung von 70% (v / v) Salpetersäure: 95% (v / v) Ethanol und decken die Quarzplatte mit einer zweiten Glasschale. Achtung: Die Reaktion ist stark exotherm und manchmal explosive tragen angemessenen Schutz und sicherzustellen, dass die Abzugshaube Schärpe um den unteren 6 "eingestellt ist nach dem Abkühlen auswaschen Salpetersäure mit Wasser und dann 95% Ethanol..

4) Repräsentative Ergebnisse

1) Cadaverin Standardkurve (Abbildung 3)
Der Test wurde durchgeführt, wie beschrieben, aber ohne L-Lysin oder LdcI und stattdessen verschiedene Konzentrationen von Cadaverin wurden verwendet, um empirisch die lineare Bereich des Assays. Der Assay wurde linear bis zu einer OD ₃₄₀ von 0,25, entsprechend ~ 22 nmol Cadaverin (Abbildung 3).

2) Die Aktivität der LdcI (Abbildung 4)
Die Aktivität von LdcI allein bestimmt wurde auf 153,5 (± 18,1) nmol Cadaverin min-1 pg LdcI-1 bei pH 6,5 werden. Die Aktivität von LdcI ist unberührt in Gegenwart von 100 uM GTP oder GDP aber stark gehemmt wird (> 10-fach) in Gegenwart von pppGpp und ppGpp (Abbildung 4).

Abbildung 1. Schematische Darstellung der LdcI Reaktion. Die Decarboxylierung von L-Lysin zu CO ₂ und Cadaverin zu erzeugen, ist ebenso wie die anschließende Umsetzung mit TNBS bei hohen pH-Wert auf N, N'-bistrinitrophenylcadaverine (TNP-Cadaverin) und N, N erzeugen gezeigt '-bistrinitrophenyllysine (TNP-Lysin). Basierend auf Phan et al.11

Abbildung 2. Einrichten von Eppendorf Thermostat. Das Layout der Proben in der 24-Well-Eppendorf Thermostat ist zusammen mit Beschreibung der einzelnen Schritte des Assays (angezeigt in Fettdruck) gezeigt. Die Pfeile zeigen die Übertragung von Reaktionslösungen nach dem Protokoll. Das Entfernen der Reaktionslösung auf die Stop-Lösung in der 96-Well-Platte ist ebenfalls angegeben.

Abbildung 3. Cadaverin Standardkurve. Ein Plot der Absorption bei 340 nm gegen nmol Cadaverin wird angezeigt. Fehlerbalken stellen die Standardabweichung von mindestens drei unabhängigen Messungen. Die Trendlinie wird auch gezeigt, und hat einen R2 von 0,996.

Abbildung 4. LdcI Testergebnisse. Eine Darstellung der Rate von LdcI Aktivität (in nmol Cadaverin produziert min-1 pg-1 LdcI) wird in Gegenwart von 100 uM GTP, GDP, pppGpp, ppGpp und in Abwesenheit von Nukleotid gezeigt. Die strengen Antwort Nukleotide (p) ppGpp der Lage sind, signifikant zu inhibieren LdcI Aktivität. Die Fehlerbalken stellen die Standardabweichung von mindestens sechs unabhängigen Messungen.

In der Lysin-Decarboxylase-Test ist TNBS mit dem primären Aminen von L-Lysin und Cadaverin reagierte auf TNP-Lysin und TNP-Cadaverin Addukte (Abbildung 1). Durch die Anwesenheit der Carbonsäuregruppe auf TNP-Lysin, bleibt dieses Addukt in Wasser löslich ist, während der TNP-Cadaverin, ohne die Carbonsäuregruppe, ist in der Lage Aufteilung in Toluol ^11. Diese Art von Test kann im weiteren Sinne auf andere Arten von Aminosäuren, wo der Verlust einer Carbonsäuregruppe tritt bei der Reaktion genutzt werden. Dies geschieht während der Decarboxylierung von L-Ornithin durch die induzierbare Ornithindecarboxylase SPEF zum Polyamin Putrescin ⁷ und die Decarboxylierung von L-Arginin durch die induzierbare Arginin-Decarboxylase Adia Form der Polyamin Agmatin ^{4 zu} bilden.

Die LdcI Assay hier beschriebenen bietet eine relativ schnelle Methode zur Bestimmung der Aktivität des gereinigten Proteins in vitro. Die wesentlichen Vorteile dieses Tests sind:

i) Die Verwendung von mehreren Wiederholungen pro Experiment verbessert die Genauigkeit jeder Messung;

ii) Der Test kann über einen weiten Bereich von Puffer-Bedingungen (unterschiedliche pH, Salz, Reduktionsmittel etc.) ohne Änderung des Protokolls durchgeführt werden;

iii) Der Assay kann zur Messung der in vivo Aktivität von LdcI durch die Bestimmung der Menge an Cadaverin während des Zellwachstums ausgeschieden geändert werden.

Die wichtigsten Einschränkungen dieses Tests sind:

i) Die Empfindlichkeit der Experimente werden von den linearen Bereich der Absorption der TNP-Addukte begrenzt;

ii) Die mehrfache Bearbeitungsschritte erhöhen das Ausmaß der experimentellen Fehler;

iii) Nicht alle Aminosäuren Decarboxylasen zugänglich sind, diese Art von Protokoll. Zum Beispiel, die Decarboxylierung von L-Glutaminsäure durch die induzierbare Glutaminsäure Decarboxylasen Gada / GadB erzeugt γ-Amino-Buttersäure ^2, die TNBS-Addukt von denen in Wasser löslich sein wird durch die Anwesenheit der Seitenketten-Carbonsäure Gruppe.

Die biochemische Untersuchung des Säure-Stress-Reaktion von E. coli ist ein expandierendes Gebiet der Forschung und ermöglicht uns ein besseres Verständnis der molekularen Grundlagen von Stress-Antwort in E. coli und verwandten γ-Proteobakterien, die ähnliche Säure Stress-Antwort-Systemen wie Salmonella enterica Serovar Typhimurium ¹² und Vibrio cholera ¹³ haben. Die Entdeckung, dass LdcI Aktivität durch die hohen Response-Regulator ppGpp gehemmt hat uns mit einer bisher unbekannten Einblick in die Regulation dieses Proteins zur Verfügung gestellt.

Wir danken Dr. Dr. Michael Cashel (National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA) für die Zusendung Bakterienstämme, Plasmide und notwendigen Protokolle. Wir danken Dr. John Glover (Department of Biochemistry, University of Toronto) für die Nutzung des SpecraMax Plattenlesegerät. Großbritannien ist der Empfänger einer Nationalen Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Postgraduate-Stipendium, ein kanadischer Institutes of Health Research Strategic Training Program in die Strukturbiologie von Membranproteinen Verbunden mit Krankheit, und der University of Toronto öffnen Fellowship. Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss von der Canadian Institutes of Health Research (MOP-67210) bis WAH unterstützt.