Цветочные погружением Преобразование Arabidopsis thaliana, Чтобы изучить PTSO2:: β-глюкуронидазы Reporter экспрессии генов

В этой статье показано цветочно-падение метод Agrobacterium tumefaciens Опосредованного преобразования Arabidopsis thaliana. Вводя клеточного цикла регулируется промоутер-репортер, PTSO2:: β-глюкуронидазы (GUS), В Arabidopsis, Мы иллюстрирует, как один репортер обнаруживает GUS экспрессии в трансгенных саженцев.

Способность вводить чужеродных генов в организме является основой современной биологии и биотехнологии. В цветущих растений модель

И. Цветочные погружением преобразования Arabidopsis thaliana

1. Примерно за 1 месяц до преобразования, сеять семена арабидопсиса на 4 до 8 горшков (5 дюймов квадратных горшках) с приблизительно 10-15 растений на горшок. Для растений с нормальной плодовитости, 4 горшки растений на плазмиды построить будет достаточно. Если у человека есть превратить мутантов арабидопсиса с снижение рождаемости, увеличение количества сосудов соответственно.
2. Растения, выращенные в стандартных условиях (16 ч света и 8 часов темноте при 22 ° С). Если растения выращивают в самый короткий день или более низкой температуре, они будут занимать больше времени, чтобы цветок и больше времени, чтобы быть готовым к трансформации. Хороший уход завод будет обеспечивать здоровые растения, которые имеют существенное значение для успешной трансформации.
3. Когда растения имеют только болтовые и начали цвести. Теперь они готовы к трансформации. Для повышения эффективности трансформации, за 3-4 дня до преобразования, обрезать соцветия основных побегов, как только они болтами для поощрения более вторичных побегов. Вода растения за день до преобразования. Это гарантирует, что почва не впитает слишком много средств массовой информации во время проникновения цветочно-погружением.
4. За два дня до преобразования, привить 40 мл LB, содержащей соответствующие антибиотики (в случае pTSO2:: GUS, 50 мкг / мл канамицину) с Agrobacterium tumefaciens штамма GV3101 проведения pTSO2:: GUS конструкции. PTSO2:: GUS клонируют в pBIN20 вектор, который обладает NPTII ген, который придает устойчивость к канамицину ^3. Вырасти на ночь в термостат при встряхивании 28-30 ° C.
5. На следующий день, трансфер из 8 мл ночной культуры в 400 мл LB, содержащей 50 мкг / мл канамицина. Вырасти на ночь в термостат при встряхивании 28-30 ° C.
6. В тот день, трансформации, когда OD ₆₀₀ из культуры Agrobacterium достигает примерно 0,8 (OD ₆₀₀ от 0,5 до ТО1 приемлемы), спин вниз Agrobacterium ночной культуры в течение 8 минут при 5000rpm.
7. Ресуспендируют Agrobacterium гранул в 1 л (литр) инфильтрации СМИ (10 мМ MgCl _2, 5% сахарозы, 0.44mM 6-benzyladenine (BA), 0,3% silwet L-77, витамин решение 1x Gamborg с и автоклавного воды). Среды не должны быть автоклавного, но необходимо сделать свежий. Залить 1 л Agrobacterium содержащих проникновения среды в блюдо (например, 8 "x15" x2 "Pyrex стеклянную посуду).
8. Обратить банка (растения не отвалится) и погрузите все надземные части растения в инфильтрации решение, удерживая в течение 5 минут один горшок одновременно. Хотя все надземные части растения погружены в инфильтрации среды, позволяя избежать почвы впитывать любые проникновения СМИ, чтобы уменьшить шансы роста грибов на земле.
9. После погружения, разместить все ближнего горшки с их стороны на несколько слоев бумажных полотенец в лоток. Бумажные полотенца впитывают доступ количество проникновение средств массовой информации. Крышка лотка с пластмассовой оберткой для обеспечения высокой влажности. Место лоток в камере завода роста.
10. На следующий день, снимите пищевую пленку и бумажные полотенца, кастрюли и поместить в вертикальном положении. Не поливайте эти растения в течение четырех-пяти дней. После этого сохранить растения нормально, пока они не набор семян и собрать семена оптом.
11. Налейте пластин (150x15mm Петри) с MS среды, содержащей 50 мкг / мл канамицина (вес 2,2 г Мурасиге и Скуга базальной соли без витаминов, растворить в 500 мл воды, рН до 5,8 1М NaOH, добавить 4 грамма агара, автоклав, прохладном и добавить Канамицин до 50 мкг / мл, конечная концентрация). Плиты хранятся в 4 ° С до необходимости.
12. Чтобы выбрать для устойчивых к антибиотикам трансгенные растения, нужно экран 20000 семян на минимуме. 0,1 г около 5000 семян. Вес и оценить количество семян.
13. Стерилизовать семена промойте их в 15 мл трубки Сокол с 70% этанола в течение 30 секунд. Промыть семена стерильной водой один раз. Замочите семена в течение 30 секунд в раствор, содержащий 1:10 разбавление приобретенный в магазине 5% отбеливателя (Clorox). Промойте семена стерильной водой три-шесть раз. В стерильных капот, пипетки около 5000 семян на каждый MS (канамицину) табличке, распространение семян равномерно на тарелке, печать пластин с лентой 3M микропоры, чтобы избежать загрязнения.
14. Инкубируйте пластины при температуре 4 ° С в темноте в течение 3-4 дней, а затем перенести пластины камеры (может быть той же камере роста растений). Примерно через 14 дней, трансгенные саженцы оставаться зелеными, но нетрансгенных них бледнея и умирает. Передача трансгенных рассаду в почву, замедляя тянет корни из средних и поместил их в почву.

II. Экспертиза pTSO2:: модели GUS экспрессия

1. Урожай pTSO2:: GUS трансгенных саженцы и разместить их в холодной 90% ацетона в стеклянный пузырек или сцинтилляционных микроцентрифужную труб, которые хранятся на льду. Полистирол микротитровальных пластин (не полипропилен) также может быть использован если проанализировать большое количество образцов.
2. Ведь образцы собирают, место флаконах при комнатной температуре в течение 20 минут. За это время составляют свежие буфера окрашивания без рентгеновских Gluc (0,2% Тритон Х-100, 50 мМ NaHPO ₄ буфера pH7.2, 2мм ферроцианида калия, 2 мМ феррицианида калия) и место на льду.
3. Удаление ацетона из образцов и добавить окрашивания буфера.
4. Макияж-х Gluc красящим раствором (0,2% Тритон Х-100, 50 мМ NaHPO ₄ буфера pH7.2, 2мм ферроцианида калия, 2 мМ феррицианида калия, 2мм х-Gluc). Удалить окрашивания буфер из образцов и добавить окрашивания буфер, содержащий х-Gluc для образцов.
5. Проникнуть проб под вакуумом в течение 15 до 20 минут. Выпуск вакуум медленно и убедитесь, что все образцы раковине под поверхностью окрашивание раствора. При необходимости повторите инфильтрацию, пока все раковины образцов после вакуум не будет отпущена.
6. Инкубируйте образцы при температуре 37 ° С в течение ночи в окрашивании буфера с Х-Gluc.
7. Удалить образцы из инкубатора и удалить окрашивание буфера. Вымойте образцов в серии последовательных этанола (20%, 35% и 50% этанола) при комнатной температуре в течение 30 минут каждого изменения.
8. Fix тканей в FAA фиксатором (50% этанола, 5% формальдегида, 10% уксусной кислоты, остальное вода) в течение 30 минут при комнатной температуре. Удалить FAA и добавить 70% этанола. В этот момент ткани могут быть визуализированы и фотографировал под микроскопом рассекает оснащен цифровой камерой. Темно-синий цвет указывает, где TSO2 выражается (рис. 1). Кроме того, ткани могут храниться при 4 ° С для последующего просмотра.
   
   
   Рисунок 1 pTSO2.:: GUS экспрессии в трансгенных рассады (А), боковые корни (B), и кончика корня (C). Отметим, что промоутер TSO2 очень активен в молодых и деления тканей. Спорадический характер экспрессии показано на (С) является типичным гены выражены в конкретных фазах клеточного цикла.

Представитель Результаты

Если все сделано правильно, эффективность трансформации должна быть примерно 0,1-0,2%. В другом слове, человек должен получать 5-10 трансгенные саженцы путем скрининга каждые 5000 семян. В среднем, около 100 трансгенных линий могут быть получены путем преобразования 4 горшки дикого типа растений.

Для рассады содержащие трансгенные pTSO2:: GUS построить ^3, темно-синий цвет, отражая активность GUS находится в активно делящихся клеток, включая молодые листья, верхушки побега, кончика корня и боковых корневых зачатков (рис. 1). Неоднородных спорадические картина характерна фазе клеточного цикла конкретного выражения.

Эффективность преобразования определяется многими различными факторами, которые обсуждаются ниже:

1. Здоровье растений и их возраста, имеют первостепенную важность. Примерно через месяц старые заводы по производству многочисленные незрелые почки цветочные идеальны. Обрезки побегов первичных поощрять вторичных побегов 3-4 дня до преобразования увеличит эффективность трансформации. Старые растения приведет к трансформантах, но по более низкой ставке.
2. Плодовитость растений имеет большое значение. Если у человека есть превратить мутантов с пониженной фертильности, гораздо больше заводов будут необходимы для погружения.
3. 0,3% Silwet L-77 поверхностно-активное вещество в буфере проникновения считается существенным.
4. Погружение время в средствах массовой информации проникновение должно быть не менее 5 минут.
5. Для уменьшения грибковых загрязнения, некоторые меры предосторожности должны быть приняты. Во-первых, нужно, чтобы избежать почвы от впитывая проникновения средств массовой информации при поливе растений / почвы день до инфильтрации. Не погружайте почвы в инфильтрации СМИ. Во-вторых, снять пластиковую крышку и бумажное полотенце в течение 24 часов после проникновения снизить влажность. В-третьих, не поливайте растения до 5 дней после инфильтрации.

В зависимости от конкретных плазмиды конструкция, методы отбора трансгенных растений могут отличаться. Если плазмиды вектор несет Бар (биалафос ацетилтрансферазы) маркерный ген устойчивости к глюфосината аммония, можно непосредственно посеять семена в почву без какой-либо стерилизации семян. Один затем спреи саженцев с 1:1000 разбавленный аммония глюфосината (коммерческое название: Финал, свободы или Ignite) раз в несколько дней, чтобы выбрать для устойчивых саженцев.

Для окрашивания GUS, это важно, чтобы урожай ткани в ацетоне на льду и держать все решения холодно, чтобы избежать деградации. Окрашивание буферов с и без X-Gluc необходимо сделать свежий, хотя исходный раствор для каждого компонента могут быть сделаны и хранятся заранее (см. ниже). Калий ферроцианида и феррицианида токсичны и должны использоваться с большой осторожностью. Кроме того, важно не для инкубации ткани при температуре 37 ° С в окрашивании буфера с X-Gluc дольше 1-2 дней, потому что ткань может начать ухудшаться, и / или окрашивания картина может стать слишком размыты в течение длительного инкубации . Наконец, более высокий ферри и ферроцианида концентрации дают более низкие общий уровень окрашивания, но более специфика. 2 мМ X-Glux хорошо работает для большинства приложений, но концентрации могут нуждаться в корректировке для определенных нужд. X-Gluc стоит дорого. Окрашивание должно осуществляться в минимальных объемах.

Исходные растворы, которые можно сделать заранее:

10% Тритон Х-100 (хранить при комнатной температуре в течение нескольких месяцев)
0,5 М NaHPO ₄ Buffer (pH7.2) (хранить при комнатной температуре в течение нескольких месяцев)
100 мМ калий ферроцианида (хранить в темноте при 4 ° С в течение нескольких месяцев)
100 мМ феррицианида калия (хранить в темноте при 4 ° С в течение нескольких месяцев)
100 мм х-Gluc (5-бром-4-хлор-3-индолил β-D-глюкуронида cyclohexamine соли) производится в диметилформамиде (DMF) и сохраняется в -20 ° C в фольгу обернутый труб. Она длится в течение нескольких месяцев.

Мы благодарим Chunxin Ван построения pTSO2:: GUS и для фотографий на рисунке 1, Детлеф Вайгель для обмена GUS-безопасный протокол, Paja Sijacic, и Кортни Hollender за полезные комментарии. Исследования в лаборатории З. л ы поддерживается Национальным научным фондом США (IOB0616096 и MCB0744752). ZL частично поддержана Университета штата Мэриленд сельскохозяйственной опытной станции.