Floral-dip Transformation von Arabidopsis thaliana Zum Untersuchen PTSO2: β-Glucuronidase Reporter Gene Expression

Dieser Artikel veranschaulicht die floral-dip-Methode der Agrobacterium tumefaciens-Vermittelte Transformation von Arabidopsis thaliana. Durch die Einführung eines Zellzyklus-regulierten Promotor-Reporter PTSO2: β-Glucuronidase (GUS), In Arabidopsis, Zeigt uns, wie man GUS-Reporter Expression in transgenen Keimlinge erkennt.

Die Fähigkeit, fremde Gene in einen Organismus einbringen ist das Fundament für die moderne Biologie und Biotechnologie. In das Modell blühende Pflanze

I. Floral-dip Transformation von Arabidopsis thaliana

1. Etwa 1 Monat vor der Transformation, säen Arabidopsis Samen auf 4 bis 8 Töpfe (5 Zoll Vierkant-Töpfe) mit ca. 10-15 Pflanzen pro Topf. Für Anlagen mit normaler Fruchtbarkeit, werden 4 Töpfe mit Pflanzen pro Plasmid-Konstrukt ausreichend sein. Wenn man mutierte Arabidopsis mit reduzierter Fruchtbarkeit zu verwandeln, erhöhen Sie die Anzahl der Töpfe entsprechend.
2. Die Pflanzen werden unter Standard-Bedingungen (16 Stunden Licht und 8 h Dunkelheit bei 22 ° C) gewachsen. Wenn Pflanzen unter kürzeren Tag oder niedrigere Temperatur gezüchtet werden, werden sie länger dauern, zu blühen und mehr bereit zu sein für die Transformation. Gute Anlage Pflege garantieren gesunde Pflanzen, die wesentlich für eine erfolgreiche Transformation sind.
3. Wenn die Pflanzen nur verschraubt und angefangen zu blühen. Sie sind nun bereit für die Transformation. Zur Erhöhung der Transformationseffizienz, 3-4 Tage vor der Transformation, schneiden Sie die Hauptinfloreszenz schießt, sobald sie verschraubt mehrere sekundäre Sproßbildung fördern. Wasser die Pflanzen am Tag vor der Transformation. Dadurch wird sichergestellt, dass der Boden nicht tanken zu viel Infiltration Medien während floral-Tauchen.
4. Zwei Tage vor der Transformation, impfen 40ml LB mit geeigneten Antibiotika (im Falle von pTSO2:: GUS, 50 ug / ml Kanamycin) mit Agrobacterium tumefaciens Stamm GV3101 Durchführung der pTSO2:: GUS-Konstrukt. Die pTSO2:: GUS wird in der pBIN20 Vektor, NPTII Gen, das Resistenz gegen Kanamycin ³ besitzt geklont. Wachsen Sie über Nacht in einem Schüttelinkubator bei 28-30 ° C.
5. Am folgenden Tag, Transfer 8ml der Übernacht-Kultur in 400 ml LB mit 50 ug / ml Kanamycin. Wachsen Sie über Nacht in einem Schüttelinkubator bei 28-30 ° C.
6. Am Tag der Transformation, wenn die OD ₆₀₀ der Agrobacterium Kultur rund 0,8 (OD ₆₀₀ zwischen 0,5 zu 1 sind zulässig) erreicht, Spin-down der Agrobacterium-Nacht-Kultur in 8 Minuten bei 5000rpm.
7. Resuspendieren Agrobacterium Pellet in 1 L (Liter) der Infiltration Medien (10 mM MgCl _2, 5% Saccharose, 0.44 mm 6-benzyladenine (BA), 0,3% Silwet L-77, 1x Gamborg s Vitamin-Lösung und autoklaviert Wasser). Das Medium muss nicht sterilisiert werden, sondern muss frisch zubereitet werden. Gießen Sie die 1 L Agrobacterium-haltigen Infiltration Medium in eine Schale (z. B. 8 "x15" x2 "Pyrex Glasschale).
8. Kehren Sie die Pot (Pflanzen fällt nicht aus) und tauchen Sie alle oberirdischen Teile der Pflanzen in die Infiltration Lösung für 5 Minuten einen Topf zu halten in einer Zeit. Während alle oberirdischen Teile der Pflanze in die Infiltration Medium eingetaucht sind, verhindern, dass Boden aufzusaugen der Infiltration Medien, um die Chancen von Pilzwachstum auf den Boden zu reduzieren.
9. Nach dem Eintauchen Ort alle getaucht Töpfe auf ihrer Seite auf mehrere Lagen Papier Handtuch in ein Fach ein. Die Papiertücher tanken Zugang Menge Infiltration Medien. Decken Sie die Schale mit Frischhaltefolie zu hohe Luftfeuchtigkeit zu gewährleisten. Setzen Sie das Fach in das Pflanzenwachstum Kammer.
10. Am folgenden Tag, entfernen Sie die Plastikfolie und Papierhandtücher, Ort und Töpfe aufrecht. Nicht Wasser dieser Anlagen für vier vor fünf weitere Tage. Danach halten die Pflanzen in der Regel, bis sie Samen gesetzt und sammeln Samen in loser Schüttung.
11. Platten gießen (150x15 Petrischale) mit MS-Medium mit 50 ug / ml Kanamycin (Gewicht 2,2 g Murashige und Skoog basalen Salz ohne Vitamin auflösen in 500 ml Wasser, pH auf 5,8 mit 1 M NaOH, fügen Sie 4 Gramm Agar, Autoklaven, kühl und add Kanamycin bis 50 ug / ml Endkonzentration). Die Platten werden in 4 ° C gehalten, bis sie benötigt.
12. So wählen Sie für die Antibiotika-resistenten transgenen Pflanzen, braucht man zu 20.000 Samen mindestens Bildschirm. 0,1 Gramm ist ungefähr 5000 Samen. Gewicht und schätzen die Menge an Samen.
13. Sterilisieren Samen durch waschen Sie sie in 15 ml Falcon-Röhrchen mit 70% Ethanol für 30 Sekunden. Wash Samen mit sterilem Wasser wieder. Weichen Sie die Samen für 30 Sekunden in eine Lösung, die 1:10 Verdünnung der im Laden gekauften 5% Bleichmittel (Clorox). Spülen Sie Samen mit sterilem Wasser drei Minuten vor sechs mal. In sterile Haube, ausgebreitet Pipette ca. 5000 Samen auf jedes MS (Kanamycin) Platte, die Samen gleichmäßig auf der Platte, dichten die Platten mit Micropore 3M Klebeband, um eine Kontamination zu vermeiden.
14. Die Inkubation bei 4 ° C im Dunkeln für 3-4 Tage, dann überweisen Sie den Teller mit einer Kammer (könnte das gleiche Pflanzenwachstum Kammer werden). Nach etwa 14 Tagen, bleiben transgenen Keimlinge grün, aber der nicht-transgenen diejenigen sind blaß und Sterben. Übertragen Sie die transgenen Keimlinge in den Boden durch Verlangsamung Ziehen der Wurzel aus dem mittleren und legte sie im Boden.

II. Untersuchen pTSO2:: GUS-Expressionsmuster

1. Ernte pTSO2:: GUS transgenen Keimlinge und legen Sie sie in kaltem 90% Aceton in einem Glasszintillationsröhrchen oder Mikrozentrifugenröhrchen, die auf Eis gehalten. Polystyrol-Mikrotiterplatten (nicht Polypropylen) kann auch verwendet werden, wenn man analysiert eine große Anzahl von Proben sein.
2. Nachdem alle Proben entnommen werden, legen Sie die Fläschchen bei Raumtemperatur für 20 Minuten. Während dieser Zeit bilden frische Färbepuffer ohne x-Gluc (0,2% Triton x-100, 50 mM NaHPO ₄ Buffer pH 7,2, 2 mM Kaliumhexacyanoferrat, 2mM Kaliumferricyanid) und auf Eis stellen.
3. Entfernen Aceton aus den Proben und fügen Sie die Färbepuffer.
4. Make up x-Gluc-Färbelösung (0,2% Triton x-100, 50 mM NaHPO ₄ Buffer pH 7,2, 2 mM Kaliumhexacyanoferrat, 2mM Kaliumferricyanid, 2 mM X-Gluc). Entfernen Sie die Färbepuffer von Proben und fügen Sie die Färbung Puffer mit x-Gluc zu den Proben.
5. Infiltrate der Proben unter Vakuum für 15 bis 20 Minuten. Lassen Sie die Vakuum langsam und sicher, dass alle Proben unter der Oberfläche der Färbelösung sinken. Falls erforderlich, wiederholen Infiltration, bis alle Proben sinken, nachdem das Vakuum freigesetzt.
6. Inkubieren Proben bei 37 ° C über Nacht in die Färbepuffer mit x-Gluc.
7. Nehmen Sie Proben von Inkubator und entfernen Färbepuffer. Waschen Sie die Proben in aufeinanderfolgenden Ethanol-Reihe (20%, 35% und 50% Ethanol) bei Raumtemperatur für jeweils 30 Minuten ändern.
8. Fix das Gewebe in FAA Fixativ (50% Ethanol, 5% Formaldehyd, 10% Essigsäure, Rest Wasser) für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Nehmen Sie FAA und fügen 70% Ethanol. An dieser Stelle im Gewebe sichtbar gemacht werden und fotografiert unter einem Binokular mit einer digitalen Kamera ausgestattet. Eine dunkelblaue Farbe zeigt an, wo TSO2 exprimiert wird (Abbildung 1). Alternativ kann das Gewebe bei 4 ° C für die spätere Ansicht gespeichert werden.
   
   
   Abbildung 1 pTSO2.:: GUS-Expression in transgenen Keimlingen (A), seitliche Wurzeln (B), und Wurzelspitze (C). Beachten Sie, dass TSO2 Promoter hochaktive in jungen und Dividieren Gewebe ist. Die sporadischen Expressionsmuster in (C) gezeigt, ist typisch von Genen in bestimmten Zellzyklusphasen ausgedrückt.

Repräsentative Ergebnisse

Wenn es richtig gemacht, sollte Transformationseffizienz ca. 0,1-0,2% sein. Mit anderen Worten, sollte man 5-10 transgenen Keimlinge durch Screening alle 5000 Samen erhalten. Im Durchschnitt können etwa 100 transgenen Linien durch die Umwandlung 4 Töpfe von Wildtyp-Pflanzen gewonnen werden.

Für transgenen Keimlinge mit den pTSO2:: GUS-Konstrukt ^3, dunkelblaue Farbe reflektiert GUS-Aktivität ist in sich aktiv teilenden Zellen, einschließlich jungen Blätter, Sprosszellen, Wurzelspitze und lateralen Wurzel Primordien (Abbildung 1). Die ungleichmäßige sporadischen Muster ist charakteristisch für Zellzyklusphase-spezifische Expression.

Die Effizienz der Transformation wird durch viele verschiedene Faktoren, die im Folgenden diskutiert bestimmt:

1. Die Gesundheit der Pflanzen und deren Alter von primärer Bedeutung sind. Etwa einen Monat alten Anlagen zur Produktion von zahlreichen unreifen Blütenknospen sind ideal. Trimmen Sie primäre Triebe zu fördern sekundären Sproßbildung 3-4 Tage vor der Transformation erhöht Transformationseffizienz. Ältere Pflanzen werden steigen, um Transformanten zu geben, sondern zu einem niedrigeren Zinssatz.
2. Die Fruchtbarkeit der Pflanzen wichtig ist. Wenn man Mutanten mit verringerter Fruchtbarkeit zu verwandeln, wird noch viel mehr Pflanzen zum Dippen benötigt werden.
3. 0,3% Silwet L-77 Tensid in Infiltration Puffer wird als wesentlich angesehen.
4. Tauchzeit in die Infiltration Medien sollten mindestens 5 Minuten betragen.
5. Zur Verringerung der Pilzbefall, sollten einige Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden. Zuerst muss man den Boden vor aufsaugen Infiltration Medien durch Bewässerung der Pflanzen / Boden einen Tag vor der Infiltration zu vermeiden. Tauchen Sie den Boden in Infiltration Medien. Zweitens, entfernen Sie die Kunststoffabdeckung und Papiertuch innerhalb von 24 Stunden nach der Infiltration von Feuchtigkeit zu reduzieren. Drittens nicht Wasserpflanzen, bis 5 Tage nach der Infiltration.

Je nach spezifischen Plasmid-Konstrukt, kann die Auswahl Methoden der transgenen Pflanzen variieren. Wenn ein Plasmid-Vektor trägt die Bar (Bialaphos Acetyltransferase) Marker-Gen Resistenz gegen Glufosinat Ammonium, kann man direkt die Saat im Boden ohne Sterilisierung von Saatgut. Eine dann sprüht die Sämlinge mit 1:1000 verdünnt Glufosinat-Ammonium (Handelsnamen: Finale, Liberty oder Ignite) einmal alle paar Tage, um resistente Keimlinge zu wählen.

Für GUS-Färbung, s es wichtig, Gewebe in Aceton auf Eis Ernte und halten alle Lösungen kalt, um eine Verschlechterung zu vermeiden. Die Färbung Puffer mit und ohne X-Gluc muss frisch zubereitet werden, obwohl die Stammlösung für die einzelnen Komponenten vorgenommen werden kann und gespeichert vor der Zeit (siehe unten). Kaliumferrocyanid und Ferricyanid sind giftig und sollten mit Vorsicht behandelt werden. Zusätzlich s es wichtig, nicht das Gewebe bei 37 ° C inkubieren in der Färbepuffer mit X-Gluc länger als 1-2 Tage, weil das Gewebe anfangen können, und / oder die Färbungsmuster verschlechtern kann sich auch diffuse während der langen Inkubationen . Schließlich geben höhere ferri und Ferrocyankalium Konzentrationen niedrigere Gesamtkosten Färbung Ebene, sondern mehr Spezifität. 2mm x-Glux funktioniert gut für die meisten Anwendungen, aber die Konzentrationen unter Umständen an bestimmte Bedürfnisse angepasst werden. X-Gluc ist teuer. Die Färbung sollte in minimalen Mengen durchgeführt werden.

Lager-Lösungen, die vor der Zeit gemacht werden können:

10% Triton X-100 (bei Raumtemperatur gelagert mehrere Monate)
0,5 M NaHPO ₄ Buffer (pH 7,2) (bei ​​Raumtemperatur gelagert mehrere Monate)
100 mM Kaliumhexacyanoferrat (dunkel lagern bei 4 ° C für mehrere Monate)
100 mM Kaliumferricyanid (Lagerung im Dunkeln bei 4 ° C für mehrere Monate)
100 mM X-Gluc (5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl β-D-Glucuronid cyclohexamine Salz) wird in Dimethylformamid (DMF) hergestellt und gelagert bei -20 ° C in Alufolie eingewickelt Röhren. Es dauert mehrere Monate.

Wir danken Chunxin Wang für den Bau pTSO2:: GUS und für Fotos in Abbildung 1, Detlef Weigel für die gemeinsame Nutzung der GUS-narrensicher Protokoll, Paja Sijacic und Courtney Hollender für hilfreiche Kommentare. Research in Z. L s Labor ist von der US National Science Foundation (IOB0616096 und MCB0744752) unterstützt. ZL wird teilweise durch die University of Maryland Agricultural Experiment Station unterstützt.