Floral dip transformación de la Arabidopsis thaliana Para el Examen de PTSO2:: β-glucuronidasa Reporter Expresión Génica

En este artículo se ilustra el método de inmersión floral de Agrobacterium tumefaciens La transformación mediada de Arabidopsis thaliana. Mediante la introducción de un ciclo celular regulados promotor-reportero, PTSO2:: β-glucuronidasa (GUS), En Arabidopsis, Que ilustra cómo se detecta la expresión de GUS en plantas transgénicas reportero.

La capacidad de introducir genes extraños en un organismo es la base de la biología moderna y la biotecnología. En el modelo de planta de flores

I. floral inmersión en la transformación de Arabidopsis thaliana

1. Aproximadamente un mes antes de la transformación, sembrar las semillas de Arabidopsis en 4-8 botes (5 ollas pulgada cuadrada), con aproximadamente 10-15 plantas por maceta. Para las plantas con fertilidad normal, 4 macetas de plantas por construir el plásmido será suficiente. Si uno tiene que transformar Arabidopsis mutante con reducción de la fertilidad, aumentar el número de macetas en consecuencia.
2. Las plantas se cultivan en condiciones estándar (16 horas luz y 8 h oscuridad a 22 ° C). Si las plantas se cultivan en día más corto o más baja temperatura, se tardará más tiempo en flor y más tiempo para estar listo para la transformación. Buen cuidado de las plantas se asegurará de plantas sanas, que son esenciales para la transformación exitosa.
3. Cuando las plantas tienen sólo atornilladas y comenzado a florecer. Ahora están listos para la transformación. Para aumentar la eficiencia de transformación, 3-4 días antes de la transformación, corte los tallos inflorescencia principal tan pronto como se han atornillado a fomentar la formación de brotes más secundario. Regar las plantas el día antes de la transformación. Esto asegura que el suelo no tomar los medios de infiltración en exceso durante floral inmersión.
4. Dos días antes de la transformación, inocular 40 ml de LB con antibióticos apropiados (en el caso de pTSO2:: GUS, 50 mg / ml de kanamicina) con Agrobacterium tumefaciens cepa GV3101 que lleva el pTSO2:: GUS construir. El pTSO2:: GUS se clona en el vector pBIN20 que posee genes NPTII que confiere resistencia a Kanamicina ^3. Crecen durante la noche en una incubadora de agitación a 28-30 ° C.
5. Al día siguiente, 8 ml de transferencia de la cultura durante la noche en 400 ml de LB con 50 mg / ml kanamicina. Crecen durante la noche en una incubadora de agitación a 28-30 ° C.
6. En el día de la transformación, cuando el OD ₆₀₀ del cultivo de Agrobacterium llega a aproximadamente 0,8 (OD ₆₀₀ entre 0,5 a 1 son aceptables), la desaceleración de la cultura durante la noche en el Agrobacterium durante 8 minutos a 5000 rpm.
7. Resuspender el precipitado en un Agrobacterium L (litro) de los medios de infiltración (10 mM MgCl _2, 5% de sacarosa, 0.44mM 6-benciladenina (BA), un 0,3% Silwet L-77, la solución de 1x Gamborg s vitaminas y agua esterilizada). El medio no tiene por qué ser esterilizados en autoclave, pero tiene que ser fresca. Vierta el 1 L Agrobacterium que contienen medio de infiltración en un plato (por ejemplo, 8 "x15" x2 "Pyrex plato de cristal).
8. Invertir la olla (las plantas no se caiga) y sumergir todas las partes aéreas de las plantas en la solución de infiltración, mantener durante 5 minutos una olla a la vez. Mientras que todas las partes aéreas de la planta se encuentran inmersos en el medio de la infiltración, evitar que el suelo absorba la infiltración de los medios de comunicación para reducir las posibilidades de crecimiento de hongos en el suelo.
9. Después de la inmersión, el lugar todos los utensilios de inmersión de su lado en varias capas de toallas de papel en una bandeja. Las toallas de papel absorben la cantidad de acceso de los medios de infiltración. Cubra la bandeja con papel de plástico para asegurar una alta humedad. Coloque la bandeja en la cámara de crecimiento de las plantas.
10. Al día siguiente, retire la envoltura de plástico y toallas de papel, y las ollas a cabo en posición vertical. No riegue las plantas durante cuatro o cinco días más. A continuación, mantener las plantas con normalidad hasta que se pusieron las semillas y recolectar las semillas a granel.
11. En placas (150x15mm placa de Petri) con un medio MS con 50 mg / ml de kanamicina (2,2 g de peso medio de Murashige y Skoog basal sin sal vitamina, se disuelven en 500 ml de agua, el pH a 5.8 con NaOH 1M, añadir 4 gramos de agar, autoclave, fresco y añadir a la kanamicina a 50 mg / ml concentración final). Las placas se mantienen en 4 ° C hasta que se necesite.
12. Para seleccionar resistentes a los antibióticos de plantas transgénicas, se necesita a la pantalla de 20.000 semillas en el mínimo. 0,1 gramos es de unos 5.000 semillas. Peso y estimar la cantidad de semillas.
13. Esterilizar las semillas mediante lavado en 15 ml tubo Falcon con etanol al 70% durante 30 segundos. Lavar las semillas con agua estéril una vez. Remoje las semillas durante 30 segundos en una solución que contiene una dilución de 1:10 de la tienda compró lejía al 5% (Clorox). Enjuague las semillas con agua estéril tres a seis veces. En campana estéril, una pipeta de 5000 semillas en cada Estado miembro (kanamicina) plato, esparcir las semillas de manera uniforme sobre la placa, sellar las placas con cinta 3M microporos para evitar la contaminación.
14. Las placas se incuban a 4 ° C en la oscuridad durante 3-4 días, a continuación, transferir las placas a una cámara (podría ser la cámara de crecimiento de la planta misma). Después de unos 14 días, las plantas transgénicas se mantienen verdes, pero los no-transgénicos son palidecer y morir. Transferencia de las plántulas transgénicas en el suelo al disminuir tirando de las raíces a partir del medio y los colocó en el suelo.

II. Examinar pTSO2:: patrones de expresión de GUS

1. Cosecha pTSO2:: GUS plantas transgénicas y ponerlas en acetona fría al 90% en un vial de centelleo de vidrio o tubos de microcentrífugaque se mantienen en hielo. Placas de poliestireno de microtitulación (no de polipropileno) también se puede utilizar si se analiza un gran número de muestras.
2. Después de todas las muestras se recogen, coloque los tubos a temperatura ambiente durante 20 minutos. Durante este tiempo, constituyen tinción de amortiguación fresco sin X-gluc (0,2% Triton X-100, 50 mm NaHPO ₄ Buffer pH 7.2, 2 mM de potasio ferrocianuro potásico, 2 mM ferricianuro) y el lugar en el hielo.
3. Eliminar la acetona de las muestras y agregar el buffer de tinción.
4. Conforman X-gluc solución de tinción (0,2% Triton X-100, 50 mm NaHPO ₄ Buffer pH 7.2, 2 mM de potasio ferrocianuro potásico, 2 mM ferricianuro, 2mm x-gluc). Eliminar el buffer de tinción de las muestras y agregar el buffer de tinción con X-gluc a las muestras.
5. Infiltrarse en las muestras bajo vacío durante 15 a 20 minutos. Cortar el vacío lentamente y verificar que todas las muestras se hunden bajo la superficie de la solución de tinción. Si es necesario, repetir la infiltración hasta que todas las muestras después de hundirse el vacío se libera.
6. Las muestras se incuban a 37 ° C durante la noche en el buffer de tinción con X-gluc.
7. Extraer muestras de la incubadora y eliminar tinción de amortiguación. Lavado de las muestras en series de etanol sucesivos (20%, 35% y 50% de etanol) a temperatura ambiente durante 30 minutos cada cambio.
8. Fijar los tejidos de la FAA fijador (50% etanol, 5% de formaldehído, ácido acético 10%, resto agua) durante 30 minutos a temperatura ambiente. Retire la FAA y añadir etanol al 70%. En este punto, los tejidos pueden ser visualizados y fotografiados en un microscopio equipado con una cámara digital. Un color azul oscuro indica que TSO2 se expresa (Figura 1). Por otra parte, los tejidos pueden ser almacenadas a 4 ° C para su posterior visualización.
   
   
   Figura 1 pTSO2:.: Expresión de GUS en plantas transgénicas (A), las raíces laterales (B), y la punta de la raíz (C). Tenga en cuenta que TSO2 promotor es muy activa en los tejidos de los jóvenes y se dividan. El patrón de expresión esporádica se muestra en (C) es típico de los genes que se expresan en determinadas fases del ciclo celular.

Resultados representante

Cuando se hace correctamente, la eficiencia de transformación debe ser aproximadamente de 0.1-0.2%. En una palabra, se debe obtener plantas transgénicas 5.10 por cada 5000 semillas de selección. En promedio, alrededor de 100 líneas transgénicas se pueden obtener mediante la transformación de 4 macetas de plantas silvestres.

Para las plántulas transgénicas que contienen el pTSO2:: GUS construir ^3, color azul oscuro que refleja la actividad de GUS se encuentra en las células en división activa como las hojas jóvenes, ápice del brote, punta de la raíz y la raíz lateral primordios (Figura 1). El patrón esporádico no uniforme es característico de la fase del ciclo celular específicos de la expresión.

La eficiencia de transformación está determinada por muchos factores diferentes, que se analizan a continuación:

1. La salud de las plantas y su edad son de vital importancia. Aproximadamente un mes las plantas produciendo numerosos botones florales inmaduros son ideales. Recorte de los brotes principales para fomentar la formación secundaria días 3-4 disparar antes de la transformación se incrementará la eficiencia de transformación. Las plantas más viejas dará lugar a transformantes, pero a un ritmo menor.
2. La fertilidad de las plantas es importante. Si uno tiene que transformar mutantes con reducción de la fertilidad, las plantas mucho más será necesario para la inmersión.
3. 0,3% Silwet L-77 de surfactante en tampón de infiltración se considera esencial.
4. Inmersión en los medios de infiltración debe ser por lo menos 5 minutos.
5. Para reducir la contaminación por hongos, algunas precauciones deben ser tomadas. En primer lugar, hay que evitar el suelo de absorber los medios de comunicación la infiltración de regar las plantas / suelo un día antes de la infiltración. No sumerja el suelo en los medios de infiltración. En segundo lugar, quitar la tapa de plástico y una toalla de papel dentro de las 24 horas después de la infiltración para reducir la humedad. En tercer lugar, no las plantas de agua hasta 5 días después de la infiltración.

En función de construir el plásmido específicos, los métodos de selección de las plantas transgénicas pueden variar. Si un vector plásmido lleva la barra (bialafos acetiltransferasa) marcadores de resistencia gen que confiere al glufosinato de amonio, uno directamente puede plantar las semillas en el suelo sin ningún tipo de esterilización de semillas. Entonces se rocía el plántulas con 1:1000 glufosinato de amonio diluido (nombre comercial: Finale, la libertad o Ignite) una vez cada pocos días para seleccionar las plántulas resistentes.

Para la tinción GUS, que s importante de la cosecha de tejidos en acetona sobre hielo y mantener todas las soluciones de frío para evitar cualquier degradación. Los tampones con y sin tinción X-Gluc tiene que ser fresca, aunque la solución de reserva para cada componente se puede hacer y se almacenan antes de tiempo (ver abajo). Ferrocianuro de potasio y ferricianuro son tóxicos y deben manejarse con cuidado. Además, s importante no incubar el tejido a 37 ° C en el buffer de tinción con X-Gluc por más de 1-2 días debido a que el tejido se puede comenzar a deteriorarse y / o el patrón de tinción puede ser demasiado difusa durante las incubaciones a largo . Por último, el aumento de las concentraciones de Ferri y ferrocianuro de dar un nivel inferior manchas en general, pero una mayor especificidad. 2mm x-Glux funciona bien para la mayoría de las aplicaciones, pero las concentraciones pueden necesitar ser ajustados por ciertas necesidades. X-Gluc es caro. La coloración debe ser llevado a cabo en volúmenes mínimos.

Disponibilidad de soluciones que se pueden hacer antes de tiempo:

10% de Triton X-100 (almacenado a temperatura ambiente durante varios meses)
0,5 M NaHPO ₄ Buffer (pH 7.2) (almacenado a temperatura ambiente durante varios meses)
100 mM de ferrocianuro potásico (almacenar en la oscuridad a 4 ° C durante varios meses)
100 mM ferricianuro de potasio (tienda en la oscuridad a 4 ° C durante varios meses)
100 mm x-gluc (5-bromo-4-cloro-3-indolil β-D-glucurónido sal ciclohexamina) se realiza en dimetilformamida (DMF) y se almacenan a -20 ° C en tubos de papel de aluminio envuelto. Tiene una duración de varios meses.

Damos las gracias a Chunxin Wang para la construcción de pTSO2:: GUS y las fotos en la Figura 1, Detlef Weigel para compartir el protocolo de GUS-a prueba de tontos, Sijacic Paja y Hollender Courtney por sus valiosos comentarios. Investigación en el laboratorio Z. L s es apoyado por los EE.UU. National Science Foundation (IOB0616096 y MCB0744752). ZL es parcialmente financiado por la Universidad de Maryland Estación Experimental Agrícola.