Floral-לטבול טרנספורמציה של ארבידופסיס thaliana לבדיקת PTSO2: β-glucuronidase Gene Expression Reporter

מאמר זה ממחיש את הפרחים, טובלים שיטת Agrobacterium tumefaciens בתיווך הטרנספורמציה של ארבידופסיס thaliana. על ידי החדרת תא מחזור מוסדר האמרגן, כתב, PTSO2: β-glucuronidase (גאס) אל ארבידופסיס אנו מדגים כיצד מזהה ביטוי גאס הכתב שתילים מהונדס.

היכולת להכניס גנים זרים לתוך אורגניזם היא הבסיס הביולוגיה והביוטכנולוגיה המודרנית. בשנת הצמח פורח מודל

I. Floral-לטבול הטרנספורמציה של thaliana ארבידופסיס

1. כ 1 חודש לפני השינוי, לזרוע זרעי ארבידופסיס על 4-8 סירים (5 סירים מרובע אינץ') עם כ 10-15 צמחים לכל סיר. לקבלת צמחים עם פריון תקין, 4 סירים של צמחים לכל לבנות הפלסמיד יהיה מספיק. אם יש להפוך ארבידופסיס מוטנט עם בפוריות, להגדיל את מספר סירים בהתאם.
2. הצמחים גדלים בתנאים סטנדרטיים (16 שעות אור ו 8 שעות חושך על 22 ° C). אם הצמחים גדלים תחת יום קצר יותר או טמפרטורה נמוכה יותר, הם ייקחו עוד פרחים כבר להיות מוכנים לשינוי. הצמח טוב לטיפול יבטיח צמחים בריאים, שהם חיוניים טרנספורמציה מוצלחת.
3. כאשר הצמחים יש רק בריח והחלו פרח. עכשיו הם מוכנים לשינוי. כדי להגביר את יעילות הטרנספורמציה, 3-4 ימים לפני השינוי, לקצץ את יורה תפרחת העיקרי בהקדם להם מוברג לעודד היווצרות לירות משני יותר. המים צמחים יום לפני השינוי. הדבר מבטיח כי האדמה לא לספוג התקשורת חדירה יותר מדי במהלך פרחים בעירום.
4. יומיים לפני השינוי, לחסן LB 40ml המכילות אנטיביוטיקה המתאימה (במקרה של pTSO2: גאס, 50 מיקרוגרם / מ"ל Kanamycin) עם Agrobacterium tumefaciens זן GV3101 נושאת את pTSO2: גאס לבנות. PTSO2: גאס הוא משובטים ב וקטור pBIN20 כי בעל הגן NPTII כי מקנה עמידות Kanamycin ^3. לגדול לילה חממה רועד ב 28-30 ° C.
5. למחרת, 8ml העברת התרבות בין לילה לתוך 400ml של LB המכיל 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​Kanamycin. לגדול לילה חממה רועד ב 28-30 ° C.
6. ביום של טרנספורמציה, כאשר OD ₆₀₀ של התרבות Agrobacterium ומגיע לכ 0.8 (OD ₆₀₀ בין 0.5 to1 מקובלים), ספין מטה התרבות לילה Agrobacterium בבית במשך 8 דקות 5000rpm.
7. Resuspend גלולה Agrobacterium ב L 1 (ליטר) של התקשורת הסתננות (10mm MgCl _2, סוכרוז 5%, 0.44mM 6-benzyladenine (BA), 0.3% silwet L-77, ויטמין 1x s Gamborg פתרון ומים autoclaved). המדיום אינו צריך להיות autoclaved אבל צריך להיות טרי. יוצקים את 1 Agrobacterium המכילים L בינוני חדירה לתוך צלחת (כגון 8 "x15" x2 "צלחת פיירקס זכוכית).
8. הפוך את הסיר (צמחים לא תיפול) ו לטבול את כל חלקי אוויר של הצמחים לתוך הפתרון הסתננות, להחזיק במשך 5 דקות סיר אחד בכל פעם. בעוד כל החלקים אוויר של המפעל שקועים המדיום הסתננות, להימנע לתת אדמה לספוג כל חדירה של התקשורת להפחית את הסיכויים של גידול פטרייתי על האדמה.
9. לאחר טבילה, מקום כל הסירים טבל בצד שלהם על כמה שכבות של מגבת נייר במגש. מגבות נייר לספוג כמות גישה של התקשורת הסתננות. מכסים את המגש בניילון נצמד, כדי להבטיח לחות גבוהה. מניחים את המגש לחדר גידול צמחים.
10. למחרת, להסיר את ניילון ומגבות נייר, סירים מקום זקוף. אין מים הצמחים האלה עבור 4-5 ימים נוספים. לאחר מכן, לשמור את הצמחים בדרך כלל עד שהם קבוצה זרעים לאסוף זרעים בתפזורת.
11. יוצקים צלחות (צלחת פטרי 150x15mm) עם בינוני MS המכיל 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​Kanamycin (משקל 2.2g Murashige ו Skoog מלח הבסיס ללא ויטמין, להמיס 500 חומציות המים, עד 5.8 מ"ל עם NaOH 1M, הוסיפו 4 גרם אגר, החיטוי, קריר כדי להוסיף Kanamycin 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​בריכוז הסופי). פלטות נשמרים 4 ° C עד הצורך.
12. כדי לבחור עבור עמידים לאנטיביוטיקה הצמחים הטרנסגניים, צריך מסך 20,000 זרעים לכל הפחות. 0.1 גרם הוא כ 5000 הזרעים. משקל להעריך את כמות הזרעים.
13. לעקר זרעים ידי לשטוף אותם בצינור פלקון 15 מ"ל עם אתנול 70% למשך 30 שניות. לשטוף עם מים סטריליים זרעים פעם. משרים את הזרעים למשך 30 שניות בתמיסה המכילה דילול של 1:10 אקונומיקה קנויה 5% (מלבין). יש לשטוף את הזרעים עם מים סטריליים 3-6 פעמים. בשכונה סטרילי, על פיפטה 5000 זרעי על כל צלחת MS (Kanamycin), להפיץ את הזרעים בצורה שווה על הצלחת, לאטום את צלחות עם הקלטת 3M micropore כדי למנוע זיהום.
14. דגירה צלחות ב 4 ° C בחושך במשך 3-4 ימים, ולאחר מכן להעביר את הצלחות לחדר (יכול להיות באותו חדר גידול צמחים). לאחר כ 14 ימים, שתילים מהונדס להישאר ירוק אך לא מהונדס אלה הופכים חיוורים גוסס. מעבירים את השתילים מהונדס לקרקע על ידי האטת קצב משיכת השורשים מן המדיום והניחה אותן באדמה.

השנייה. בחינת pTSO2: גאס דפוסי הביטוי

1. קציר pTSO2: גאס שתילים מהונדס ומכניסים אותם אצטון 90% קר בקבוקון זכוכית scintillation או צינורות microfugeכי הם שמרו על הקרח. Microtiter לוחות פוליסטירן (לא פוליפרופילן) יכול לשמש גם אם מנתח מספר גדול של דגימות.
2. אחרי הכל דגימות נקצרים, במקום בקבוקוני בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. במהלך תקופה זו לפצות חיץ מכתים טריים ללא x-Gluc (0.2% Triton x-100, 50mm NaHPO ₄ הצפת pH7.2, 2mm אשלגן אשלגן פרוציאני, 2mm Ferricyanide) ומניחים על קרח.
3. הסר אצטון ממדגמים ומוסיפים את החיץ מכתים.
4. מאפרים x-Gluc פתרון מכתים (0.2% Triton x-100, 50mm NaHPO ₄ הצפת pH7.2, אשלגן אשלגן 2mm פרוציאני, 2mm Ferricyanide, 2 מ"מ x-gluc). הסר את חוצץ מכתים ממדגמים ולהוסיף החיץ מכתים המכיל x-Gluc על דגימות.
5. הסתנן דגימות תחת ואקום עבור 15 עד 20 דקות. לשחרר את הוואקום לאט לוודא שכל הדגימות לשקוע מתחת לפני השטח של הפתרון מכתים. אם יש צורך, חזור על חדירה עד לשקוע כל הדגימות לאחר ואקום הוא שוחרר.
6. דגימות לדגור על 37 מעלות צלזיוס לילה למאגר מכתים עם ה-X Gluc.
7. הסר דגימות חממה ולהסיר חיץ מכתים. שטפו את דגימות בסדרה אתנול רצופים (20%, 35% אתנול ו - 50%) בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות כל אחד מהשינויים.
8. לתקן את הרקמות FAA מקבע (אתנול 50%, 5% פורמלדהיד, חומצה אצטית 10% מים, מנוחה) במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. הסר FAA ולהוסיף אתנול 70%. בשלב זה רקמות ניתן דמיינו וצילם תחת מיקרוסקופ לנתח מצויד במצלמה דיגיטלית. צבע כחול כהה מציין היכן TSO2 מתבטא (איור 1). לחלופין, הרקמות ניתן לאחסן 4 ° C מאוחר יותר לצפייה.
   
   
   איור 1 pTSO2:.: גאס ביטוי ב שתילים מהונדס (A), שורשים לרוחב (B), ואת קצה השורש (C). שים לב TSO2 האמרגן פעיל מאוד ברקמות צעירים חלוקת. דפוס הביטוי ספורדיים שמוצג (C) אופייני של הגנים מתבטאת שלבי מחזור התא הספציפי.

נציג תוצאות

כאשר נעשה בצורה נכונה, יעילות השינוי צריך להיות כ 0.1-0.2%. במילה אחרת, יש לקבל שתילים מהונדס 5-10 על ידי סינון כל הזרעים 5000. בממוצע, כ - 100 קווי מהונדס ניתן להשיג על ידי הפיכת 4 סירים של wild-type צמחים.

עבור שתילים מהונדס המכיל את pTSO2: גאס לבנות ^3, בצבע כחול כהה המשקף פעילות גאס נמצא פעיל התאים המתחלקים כולל עלים צעירים, איפקס לירות, קצה השורש, ושורש primordia לרוחב (איור 1). התבנית לא אחידה סדיר אופייני מחזור התא בשלב ספציפי הביטוי.

היעילות של השינוי נקבע על ידי גורמים רבים ושונים, אשר נדון להלן:

1. בריאות הצמחים ואת גילם הם בעלי חשיבות ראשונית. בערך אחד הצמחים ישנים חודש לייצר מספר רב של בלוטות פרחים בשלה הם אידיאליים. זמירה את יורה העיקרית לעודד משני ימים היווצרות לירות 3-4 לפני השינוי יגדיל את יעילות הטרנספורמציה. צמחים מבוגרים יהיה להצמיח transformants אך בקצב נמוך יותר.
2. פוריות הצמחים חשוב. אם יש להפוך מוטנטים עם בפוריות, צמחים הרבה יותר יהיה צורך לטבול.
3. 0.3% Silwet L-77 פעילי שטח חיץ חדירה נחשב חיוני.
4. טובל הזמן בתקשורת חדירה צריך להיות לפחות 5 דקות.
5. כדי להפחית את זיהום פטרייתי, כמה אמצעי זהירות יש לנקוט. ראשית, צריך להימנע מן האדמה לספוג התקשורת חדירה על ידי השקיית הצמחים / אדמה יום לפני החדירה. לצלול אל הקרקע בתקשורת הסתננות. שנית, להסיר את כיסוי הפלסטיק מגבת נייר בתוך 24 שעות לאחר החדירה להפחית לחות. שלישית, לא צמחי מים עד 5 ימים לאחר החדירה.

בהתאם לבנות פלסמיד מסוים, שיטות בחירה של צמחי מהונדס עשוי להשתנות. אם וקטור פלסמיד הנושא את בר (bialaphos acetyltransferase) הגן המקנה עמידות סמן כדי glufosinate אמוניום, אפשר ישירות לזרוע את הזרעים בקרקע ללא עיקור כלשהו של זרעים. אחת מכן תרסיסים את השתילים עם אמוניום 1:1000 glufosinate מדולל (שם מסחרי: פינאלה, החירות, או Ignite) פעם אחת כל כמה ימים כדי לבחור עבור שתילים עמידים.

עבור מכתים גאס, זה חשוב הקציר רקמות אצטון על קרח ולשמור את כל פתרונות קר כדי למנוע השפלה. מאגרים מכתים עם או בלי ה-X Gluc צריך להתבצע טרי, אם כי הפתרון מניות עבור כל רכיב ניתן ומאוחסנים מראש (ראה להלן). פרוציאני אשלגן ו Ferricyanide רעילים יש לטפל בזהירות. בנוסף, חשוב לא דגירה הרקמה ב 37 ° C במאגר מכתים עם ה-X Gluc יותר מ 1-2 ימים, כי רקמת יכול להתחיל להידרדר ו / או דפוס מכתים עלול להפוך מפוזר מדי במהלך incubations ארוך . לבסוף, פרי גבוהה ריכוזי פרוציאני לתת נמוך יותר ברמה הכללית מכתים, אבל הספציפיות יותר. 2mm X-Glux עובד היטב עבור מרבית היישומים, אך בריכוזים עשוי צריך להיות מותאם לצרכים מסוימים. X-Gluc יקר. מכתים צריכה להתבצע בכמויות מינימליות.

מאגר פתרונות שיכולה להתבצע מראש:

10% Triton X-100 (המאוחסן בטמפרטורת החדר במשך כמה חודשים)
0.5 מ NaHPO ₄ חוצץ (pH7.2) (המאוחסן בטמפרטורת החדר במשך כמה חודשים)
100 mM אשלגן (חנות בחושך על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים) פרוציאני
100 mM אשלגן (חנות בחושך על 4 מעלות צלזיוס במשך כמה חודשים) Ferricyanide
100 מ"מ X-Gluc (5-bromo-4-כלורו-3-indolyl β-D-glucuronide מלח cyclohexamine) הוא עשה Dimethylformamide (DMF) ומאוחסנים -20 מעלות צלזיוס צינורות אלומיניום עטופים. זה נמשך במשך מספר חודשים.

אנו מודים Chunxin וואנג לבניית pTSO2: גאס עבור תמונות באיור 1, דטלף ווייגל לשיתוף פרוטוקול גאס-חסינת תקלות, פג'ה Sijacic, ואת קורטני הולנדר על הערות מועילות. מחקר במעבדה של צ'L נתמכת על ידי המוסד האמריקני למדע (IOB0616096 ו MCB0744752). ZL נתמך בחלקו על ידי האוניברסיטה של ​​מרילנד תחנת ניסוי חקלאי.